劉秋蘭，鄒曉琴，易 陽(yáng)，2*，王宏勛，孫 瑩，2

（1 武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 武漢 430023 2 武漢輕工大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 武漢 430023 3 武漢輕工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 武漢 430023 ）

多糖和多酚是植物中廣泛共存的活性成分，二者可以通過(guò)共價(jià)和非共價(jià)方式結(jié)合。當(dāng)多糖和多酚進(jìn)行物理混合時(shí)，氫鍵、疏水相互作用、靜電作用等非共價(jià)力促成其自發(fā)形成可逆或不可逆的復(fù)合物；而共價(jià)相互作用誘導(dǎo)的復(fù)合物主要涉及酶氧化、碳二亞胺交聯(lián)、自由基誘導(dǎo)等機(jī)制[1-2]。植物性食品加工過(guò)程中，隨著組織結(jié)構(gòu)的破壞，多糖和多酚可能因混合發(fā)生自發(fā)的非共價(jià)結(jié)合，進(jìn)而影響食品的感官品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)特性及功能活性[3]。因此，探究二者的非共價(jià)相互作用以及復(fù)合物的理化與營(yíng)養(yǎng)特性，對(duì)于調(diào)控食品品質(zhì)和指導(dǎo)食品良性加工具有重要意義。

多糖和多酚是蓮藕中的主要功能因子，具有降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抑菌、免疫調(diào)節(jié)等多種活性[4-6]。近年來(lái)，蓮藕多糖（Lotus root polysaccharide，LRP）的研究主要集中在提取、分離、純化、結(jié)構(gòu)/組成分析以及活性評(píng)價(jià)等方面[7-9]，關(guān)于其改性和組分相互作用的研究較少。阿魏酸（Ferulic acid，F(xiàn)A）是一種植物中含量較為豐富的酚酸類物質(zhì)，因具有較好的抗氧化、降血糖、抗炎等活性而被廣泛用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[10-11]，然而其較差的水溶性和穩(wěn)定性在一定程度上限制了應(yīng)用[12]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，蓮藕中LRP 提取量可達(dá)58.8 mg/g[12]，而FA 提取量達(dá)0.217 mg/g[13]。在水溶液混合體系中，LRP 與FA 能通過(guò)非共價(jià)力自發(fā)結(jié)合，而FA 的結(jié)合量（29.28 mg/g LRP）較低[14]。能否通過(guò)物理混合條件優(yōu)化，提升FA 的結(jié)合量，實(shí)現(xiàn)LRP 的功能特性增強(qiáng)和FA 的穩(wěn)態(tài)化利用，有待于進(jìn)一步探究。

多糖和多酚之間的非共價(jià)結(jié)合通常取決于外在環(huán)境因子和內(nèi)在理化性質(zhì)，而環(huán)境影響因素主要包括混合體系的pH 值、溫度、離子強(qiáng)度和底物濃度等[15]。本研究采用熱水浸提和二次醇沉分離LRP，通過(guò)平衡透析法制備LRP-FA 復(fù)合物。為提高復(fù)合物中FA 的結(jié)合量，設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化其制備工藝參數(shù)。采用光譜法和色譜法等分析復(fù)合物的理化特性，以FA 解離率評(píng)價(jià)復(fù)合物的熱穩(wěn)定性和消化穩(wěn)定性，并考察其抗氧化能力和巨噬細(xì)胞刺激活性。基于LRP-FA 復(fù)合物的制備和特性評(píng)價(jià)，旨為蓮藕功能因子的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蓮藕（鄂蓮5 號(hào)），武漢市金水祺良農(nóng)副產(chǎn)品有限公司。將新鮮蓮藕洗凈，去皮切片，于65℃熱風(fēng)烘干至恒重，然后采用多功能粉碎機(jī)磨粉備用。

阿魏酸（FA，純度≥95%），阿拉丁試劑公司；Folin-Phenol 試劑，北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司；小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Raw264.7，武漢普諾賽生命科技有限公司；高糖完全培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM），美國(guó)Hyclone 公司；磷酸鹽緩沖液（Phosphate-buffered saline，PBS，pH 7.4），美國(guó)Hyclone 公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），北京博奧拓達(dá)科技有限公司；格里斯試劑，武漢基因美科技有限公司；48 孔和96 孔的細(xì)胞培養(yǎng)板，美國(guó)Corning 公司；唾液消化液、胃液消化液、腸液消化液，北京雷根生物技術(shù)有限公司；1，1-二苯-2-苦基肼（DPPH），北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司；透析袋（截留分子質(zhì)量500 u），上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

A360 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，翱藝儀器（上海）有限公司；SCIENTZ-12N/A 冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；SUNRISE 酶標(biāo)定量測(cè)定儀，西化儀（北京）科技有限公司；Thermo Scientific Nicolet 6700 傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)尼高力儀器有限公司；DAWN HELEOS-II 多角度激光光散射/凝膠色譜儀并配備Optilab TrEX 示差折光儀，美國(guó)Wyatt 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 LRP 的提取及組成分析 參考Yi 等[16]的方法提取LRP，方法稍有改動(dòng)。稱取一定量的藕粉與蒸餾水（固液比為1∶10）混合均勻后，超聲處理10 min。將混合液置于90 ℃熱水浴中浸提2 h。浸提結(jié)束后以4 500 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，分離上清液。向上清液中加入無(wú)水乙醇至體積分?jǐn)?shù)為30%，于4 ℃靜置3 h 以沉淀淀粉，并通過(guò)碘液檢驗(yàn)確定淀粉完全除去。將上清液于4 500 r/min 離心10 min，棄沉淀。繼續(xù)向上清液中加入無(wú)水乙醇至體積分?jǐn)?shù)為75%，繼續(xù)靜置過(guò)夜以沉淀多糖。于4 500 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，保留沉淀。向沉淀物中加少量體積的水復(fù)溶，45 ℃真空濃縮以除去殘留乙醇，對(duì)剩余物進(jìn)行真空冷凍干燥，收集得到干燥粉末即為L(zhǎng)RP。分別采用苯酚-硫酸法[17]和DNS法[18]測(cè)定LRP 的總糖含量和還原糖含量，得到其差值即為多糖含量（50.66%）。

1.3.2 LRP-FA 復(fù)合物制備的單因素實(shí)驗(yàn) LRPFA 復(fù)合物制備參考Li 等[19]的方法，稍有改動(dòng)。將配制好的FA 水溶液（1 mg/mL）和LRP 水溶液（2 mg/mL）按一定比例混合，調(diào)節(jié)pH 和離子濃度后恒溫?cái)嚢?0 min。攪拌結(jié)束后，取10 mL 混合液轉(zhuǎn)移至透析袋中，于190 mL 蒸餾水（總體積為200 mL）中透析4 h。取透析袋外液，采用Folin-Ciocalteu 法[19]測(cè)定FA 濃度，即可計(jì)算透析體系中的游離FA 質(zhì)量，并以此換算混合體系中總游離FA質(zhì)量。相對(duì)于LRP 的FA 結(jié)合量C（mg/g）按公式（1）計(jì)算：

式中，m1——混合體系中添加的FA 質(zhì)量（mg）；m2——混合體系中游離的FA 質(zhì)量（mg）；M——混合體系中添加的LRP 質(zhì)量（g）。

1）反應(yīng)溫度 不添加NaCl 且不調(diào)節(jié)pH，以LRP-FA 質(zhì)量比為4∶1，考察溫度（0，15，30，45，60 ℃）對(duì)FA 結(jié)合量的影響。

2）pH 值 不添加NaCl，以LRP-FA 質(zhì)量比為4∶1，在30 ℃下考察pH 值（3，4，5，6，7）對(duì)FA結(jié)合量的影響。

3）LRP-FA 質(zhì)量比 不添加NaCl 且不調(diào)節(jié)pH，在溫度30 ℃下考察LRP-FA 質(zhì)量比（8∶1，4∶1，2∶1，1∶1，1∶2）對(duì)FA 結(jié)合量的影響。

4）離子濃度 不調(diào)節(jié)pH，在溫度30 ℃和LRP-FA 質(zhì)量比4∶1 的條件下，考察NaCl 濃度（0，25，50，100，200 mmol/L）對(duì)FA 結(jié)合量的影響。

1.3.3 LRP-FA 復(fù)合物制備的響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)之上，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選定溫度（A）、pH（B）、LRP-FA 質(zhì)量比（Y，X1/X2）3 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素和水平編碼見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平Table 1 Response surface experimental factors and levels

1.3.4 LRP-FA 復(fù)合物的制備及理化特征分析

1）LRP-FA 復(fù)合物的制備 根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，在溫度0 ℃，pH 7 和LRP-FA 質(zhì)量比為2∶1 的條件下混合30 min，隨后將混合液轉(zhuǎn)移至透析袋（500 u）內(nèi)。透析袋置于含有大量蒸餾水的燒杯中攪拌透析，每隔4 h 更換透析外液，持續(xù)約48 h，直至透析外液在波長(zhǎng)280 nm 處的吸光度為0 時(shí)終止。對(duì)透析袋內(nèi)液進(jìn)行真空冷凍干燥，收集干燥粉末即為L(zhǎng)RP-FA 復(fù)合物。根據(jù)FA 結(jié)合量，將LRP 和FA 的粉末直接進(jìn)行物理混合，得到LRP&FA 混合物作為對(duì)照。

2）紫外光譜掃描 配制1 mg/mL 的LRP、FA、LRP-FA 復(fù)合物以及LRP&FA 混合物的水溶液，稀釋20 倍，以蒸餾水建立基線，在波長(zhǎng)190～400 nm 范圍內(nèi)掃描。

3）傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）掃描 取1 mg 樣品與200 mg KBr 粉末在研缽中混勻研磨，置于模具中，在油壓機(jī)上壓成透明薄片，將樣品放入紅外光譜儀中測(cè)試，波數(shù)范圍4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)32，分辨率4 cm-1[20]。

4）分子質(zhì)量分布分析 采用體積排阻色譜-示差檢測(cè)-多角度激光光散射聯(lián)用系統(tǒng)（High performance size exclusion chromatography coupled with multi-angle laser light scattering and refractive index detection，HPSEC-MALLS-RI）測(cè)定樣品的分子質(zhì)量分布[21]。精確稱取10 mg 樣品，加入1 mL 0.2 mol/L 醋酸鈉溶液溶解后，于8 000 r/min 離心5 min，取上清液檢測(cè)。色譜條件為：色譜柱Aglient PL aquagel-OH 凝膠色譜柱（300 mm×7.8 mm，8 μm）；流動(dòng)相0.2 mol/L 醋酸鈉；流速0.7 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫30 ℃。

1.3.5 LRP-FA 復(fù)合物的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

1）熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 取10 mL 的LRP-FA 復(fù)合物水溶液（2 mg/mL）于透析袋（500 u）中，浸沒(méi)于裝有190 mL 蒸餾水的燒杯中，將燒杯置于不同溫度（0，25，37，100 ℃）水浴中攪拌透析4 h。測(cè)定透析袋外液中FA 濃度，并按200 mL 總體積計(jì)算游離FA 質(zhì)量。FA 解離率按游離FA 質(zhì)量占20 mg 復(fù)合物中總FA 質(zhì)量的百分比計(jì)算。

2）消化穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 取10 mL 唾液消化液、胃液消化液或腸液消化液與20 mg 復(fù)合物于15 mL 離心管中混合，置于37 ℃恒溫?fù)u床（轉(zhuǎn)速150 r/min）中分別消解10 min，2 h 和1.5 h 后，將混合液轉(zhuǎn)入透析袋（500 u）中，浸沒(méi)于190 mL 蒸餾水，在冰水浴中透析，4 h 后測(cè)定透析外液中FA 濃度，并按200 mL 總體積計(jì)算游離FA 質(zhì)量。FA 解離率按游離FA 質(zhì)量占20 mg 復(fù)合物中總FA 質(zhì)量的百分比計(jì)算。

1.3.6 LRP-FA 復(fù)合物的DPPH 自由基清除能力測(cè)定 分別取不同濃度的樣品溶液1.0 mL 于10 mL 具塞試管中，并加入4.0 mL DPPH 溶液（0.2 mmol/L），混勻后于室溫避光反應(yīng)30 min，以乙醇為空白，于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定吸光值，試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果取“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。DPPH 自由基清除率S（%）按公式（2）計(jì)算：

式中，A0——1.0 mL 蒸餾水與4.0 mL DPPH溶液混合后，于波長(zhǎng)517 nm 處的吸光值；As——1.0 mL 樣液與4.0 mL DPPH 溶液混合后，于波長(zhǎng)517 nm 處的吸光值；Ac——1.0 mL 樣液與4.0 mL乙醇混合后，于波長(zhǎng)517 nm 處的吸光值。

1.3.7 LRP-FA 復(fù)合物的巨噬細(xì)胞刺激活性評(píng)價(jià)

參考Yi 等[22]的方法，通過(guò)NO 生成量評(píng)價(jià)LRP-FA 復(fù)合物的巨噬細(xì)胞刺激活性，方法略有改動(dòng)。

1）NO 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定 用去離子水配制50，25，12.5，6.25，3.125 mmol/L 的亞硝酸鈉溶液，各取100 μL 置于96 孔板中，每孔再加入100 μL 格里斯試劑。以不加亞硝酸鈉的孔為空白，每組包括3 個(gè)平行孔，混勻后靜置10 min。采用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)540 nm 處進(jìn)行檢測(cè)，以吸光值（Y）和亞硝酸鈉濃度（X，mmol/L）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=20.528x＋0.0503（R2=0.999）。

2）正常RAW264.7 細(xì)胞的NO 分泌測(cè)定 將RAW264.7 細(xì)胞稀釋至濃度為2×105cells/mL，向48 孔板中每孔加入500 μL 細(xì)胞懸液，于37 ℃的5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，并用PBS 潤(rùn)洗。然后將每孔加入含200 μg/mL LRP-FA、200 μg/mL LRP 或500 ng/mL LPS 的無(wú)胎牛血清培養(yǎng)基500 μL，以不加細(xì)胞的孔為空白，以僅含有細(xì)胞懸液的孔為對(duì)照組，每組包括5 個(gè)平行孔。48 孔板培養(yǎng)24 h 后取100 μL上清液測(cè)定NO 生成量（mmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再次測(cè)定。

3）LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞的NO 分泌測(cè)定RAW264.7 細(xì)胞按上述方法培養(yǎng)貼壁后，每孔加入含500 ng/mL LPS 和200 μg/mL LRP-FA（或LRP）的無(wú)胎牛血清培養(yǎng)基500 μL，并設(shè)計(jì)無(wú)刺激物的空白對(duì)照組和LPS 對(duì)照組（500 ng/mL），每組包括5 個(gè)平行孔。48 孔板培養(yǎng)24 h 和48 h 后，分別取100 μL 上清液測(cè)定NO 生成量（mmol/L）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示（n=3或n=5）。組間數(shù)據(jù)在0.05 水平的顯著性差異通過(guò)SPSS 19.0 軟件采用Duncan（D）進(jìn)行分析。采用Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LRP-FA 復(fù)合物制備的單因素分析

研究溫度、pH、質(zhì)量比以及鹽濃度對(duì)LRP 和FA 結(jié)合量的影響，結(jié)果如圖1 所示。由于氫鍵的形成是一個(gè)放熱過(guò)程，溫度升高導(dǎo)致結(jié)合率降低可能是因?yàn)楦邷貢?huì)削弱氫鍵作用[23-24]。在0～60 ℃范圍內(nèi)，F(xiàn)A 結(jié)合量隨溫度的升高而逐漸降低（P＜0.05），當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃后，F(xiàn)A 結(jié)合量低至3.60 mg/g，由此說(shuō)明氫鍵可能參與LRP 和FA 之間的相互作用。另外，當(dāng)溫度升高，苯環(huán)之間的疏水相互作用有利于FA 聚合體的形成[25]，可能阻礙FA與LRP 之間的非共價(jià)結(jié)合。pH 的變化會(huì)導(dǎo)致LRP 與FA 分子表面的電位改變，從而影響二者之間的靜電相互作用[26]。FA 結(jié)合量隨pH 值（3～7）的升高而逐漸增加（P＜0.05），其原因可能是隨著pH 值的增大，靜電斥力減少，靜電相互作用增強(qiáng)，有利于LRP 與FA 結(jié)合。pH 值為6 和7 時(shí)的FA結(jié)合量無(wú)顯著差異（P＞0.05），在中性條件下的結(jié)合量達(dá)到70.184 mg/g。由此猜測(cè)，靜電相互作用可能參與到LRP 與FA 的結(jié)合，過(guò)酸不利于氫鍵的形成。

圖1 溫度、pH、質(zhì)量比和鹽濃度對(duì)LRP 的FA 結(jié)合量的影響Fig.1 Effect of temperature，pH，mass ratio and salt concentration on the binding rate of ferulic acid to lotus root polysaccharide

此外，多糖與多酚的混合比例也是影響兩者相互作用的重要因素[27]。在FA 與LRP 質(zhì)量比為1∶2～1∶8 范圍內(nèi)，隨著FA 含量降低，單位質(zhì)量LRP 結(jié)合的FA 質(zhì)量少（P＜0.05）；當(dāng)FA 與LRP 質(zhì)量比為2∶1～1∶2 時(shí)，可能因FA 聚合體的生成[25]，導(dǎo)致FA 與LRP 的結(jié)合量升高。在添加少量NaCl（25 mmol/L）后，F(xiàn)A 結(jié)合量發(fā)生顯著下降（P＜0.05），且隨著NaCl 濃度的升高始終維持較低結(jié)合量（～15 mg/g）。鹽溶液中FA 結(jié)合量的減少，可能歸因于LRP 與FA 之間氫鍵作用減弱[25]，以及溶解度的降低[28]。為了獲得相對(duì)高的FA 結(jié)合量，混合體系中不添加NaCl，在溫度0～30 ℃（0 ℃以下無(wú)法進(jìn)行透析）、pH 5～7 以及LRP-FA 質(zhì)量比1∶1～1∶4 的水平范圍內(nèi)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化復(fù)合物制備條件。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與回歸分析

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇溫度、pH 和LRPFA 質(zhì)量比為變量，以FA 結(jié)合量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2 所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

通過(guò)回歸數(shù)據(jù)處理得到擬合函數(shù)模型：

D=84.43-27.83A＋11.00B-7.36C＋7.38AB-3.22AC-10.05BC-0.57A2-8.52B2-13.51C2

通過(guò)方差分析（表3）發(fā)現(xiàn)，該模型極顯著（P＜0.0001），且失擬項(xiàng)不顯著，表明該模型能夠擬合響應(yīng)值的變化，可以用來(lái)對(duì)LRP-FA 復(fù)合物制備工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。溫度、pH 和質(zhì)量比對(duì)FA 結(jié)合量有影響顯著（P＜0.001），且溫度與pH 之間以及pH 與質(zhì)量比之間存在相互影響。同時(shí)，由F 值推斷，影響LRP 的FA 結(jié)合量的次序?yàn)椋簻囟龋緋H＞質(zhì)量比。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

通過(guò)回歸模型預(yù)測(cè)最大FA 結(jié)合量的復(fù)合物制備條件為：溫度0 ℃，pH 7，LRP-FA 質(zhì)量比1∶2，在此條件下的FA 結(jié)合量理論值為106.79 mg/g，3 次驗(yàn)證試驗(yàn)的實(shí)測(cè)值為110.22 mg/g，模型預(yù)測(cè)偏差為3.11%。

2.3 LRP-FA 復(fù)合物的理化特征

2.3.1 紫外光譜特性 多酚的紫外吸收峰主要存在于波長(zhǎng)240～380 nm 范圍內(nèi)，而大多數(shù)多糖在此范圍內(nèi)沒(méi)有吸收峰。據(jù)研究報(bào)道，多酚通過(guò)非共價(jià)作用與多糖結(jié)合后，其特征峰在復(fù)合物紫外光譜中消失或減弱[19]。如圖2 所示，LRP 僅在波長(zhǎng)190～220 nm 范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的吸收，與其不飽和羰基和羧基有關(guān)[25]；FA 的特征吸收峰出現(xiàn)在波長(zhǎng)312 nm（π-π*雙鍵的躍遷）、288 nm（π-π*酚基的躍遷）和218 nm（π-π*苯環(huán)的躍遷）[26]，且3 個(gè)特征峰也出現(xiàn)在LRP&FA 混合物的光譜圖中。相比于混合物，LRP-FA 復(fù)合物中FA 的特征峰消失，證實(shí)了LRP 與FA 的相互作用。

圖2 LRP、FA 及其復(fù)合物和混合物的紫外光譜圖Fig.2 UV spectra of lotus root polysaccharide，ferulic acid and their complexes and mixtures

2.3.2 FTIR 特征 如圖3 顯示，LRP 具有多糖的典型特征峰[29]，包括3 394 cm-1處的-OH 伸縮振動(dòng)吸收峰，2 933 cm-1處的C-H 伸縮振動(dòng)吸收峰和1 411 cm-1處的-CH2變形吸收峰。LRP&FA 混合物的FTIR 圖中，1 517 cm-1處出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰歸屬為C=C 的伸縮振動(dòng)，1 276 cm-1和1 029 cm-1處出現(xiàn)的峰為C-O-C 振動(dòng)吸收，1 122 cm-1附近的峰屬于酚羥基的彎曲-伸縮振動(dòng)[30]，617 cm-1處的峰歸屬于芳香族化合物平面彎曲的C-H 鍵[20]。LRP-FA 復(fù)合物與LRP&FA 混合物的差異表現(xiàn)在以上峰的消失或偏移，推測(cè)LRP 與FA 的相互作用導(dǎo)致了官能團(tuán)的改變。

圖3 LRP 以及LRP-FA 復(fù)合物和混合物的FTIR 光譜圖Fig.3 FTIR spectra of lotus root polysaccharide，LRP-FA complexes and mixtures

2.3.3 分子質(zhì)量分布分析 采用HPSEC-MALLSRI 測(cè)定LRP 和LRP-FA 復(fù)合物的分子質(zhì)量分布，各組分的保留時(shí)間范圍和分子質(zhì)量如表4 所示。LRP 由6 個(gè)級(jí)分組成，其中最高分子質(zhì)量達(dá)1 704 ku（占7.3%），而分子質(zhì)量數(shù)量級(jí)為105，104，103的級(jí)分相對(duì)含量相近。相比之下，LRP-FA 復(fù)合物中分子質(zhì)量高于100 ku 級(jí)分的相對(duì)含量增加19.5%，而低于10 ku 級(jí)分消失。FA 的結(jié)合將LRP的平均分子質(zhì)量由191.8 ku 增加至297.4 ku，這一現(xiàn)象與Li 等[19]研究結(jié)果一致，證實(shí)了LRP 與FA 之間的相互作用。LRP-FA 復(fù)合物未檢出分子質(zhì)量低于10 ku 級(jí)分，說(shuō)明無(wú)游離FA 存在，因此復(fù)合物在冷凍干燥過(guò)程和色譜流動(dòng)相（0.2 mol/L醋酸鈉溶液）中均具有較好的穩(wěn)定性。

表4 LRP 及LRP-FA 復(fù)合物的分子質(zhì)量分布Table 4 The molecular weight distribution of lotus root lotus polysaccharide，and ferulic acid complexes

2.4 LRP-FA 復(fù)合物的穩(wěn)定性

考慮到LRP-FA 復(fù)合物的應(yīng)用，貯藏、加工及消化過(guò)程中的穩(wěn)定性都是重要的考量因素，故而分析其在冷藏低溫（0 ℃）、貯藏室溫（25 ℃）、消化體溫（37 ℃）和加工高溫（100 ℃）下的FA 解離率，結(jié)果如圖4 所示。0 ℃低溫有利于維持復(fù)合物的穩(wěn)定，F(xiàn)A 解離率僅1.03%。隨著溫度的逐漸升高，F(xiàn)A解離率顯著提高（P＜0.05），且在100 ℃高溫條件下的解離率達(dá)89.33%。綠茶飲料中的單寧類化合物在經(jīng)胃和十二指腸模擬消化后，大幅度降低，且經(jīng)過(guò)胃腸道消化后其抑菌活性消失[31]；而胃腸道消化過(guò)程會(huì)大大降低葡萄皮提取物中酚類化合物的種類和含量，并降低其抗氧化和抑菌活性[32]。由此可見(jiàn)，酚類物質(zhì)的消化穩(wěn)定性對(duì)于其生物利用具有重要意義。進(jìn)一步考察LRP-FA 復(fù)合物在消化體系中的穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，經(jīng)口腔（10 min）、胃（2 h）和腸道（1.5 h）模擬消化后，F(xiàn)A 發(fā)生不同程度的解離。其中，口腔消解程度（10.94%）顯著低于胃消解（21.98%）和腸道消解（23.43%）（P＜0.05）。結(jié)果表明，與LRP 的非共價(jià)結(jié)合有利于FA 在上消化道系統(tǒng)的緩慢釋放。

圖4 LRP-FA 復(fù)合物的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)Fig.4 Stability evaluation of LRP-FA complex

2.5 LRP-FA 復(fù)合物的DPPH 自由基清除活性

此前研究表明，LRP 雖具有一定的DPPH 自由基清除活性，但其活性較低[16]。與可溶性膳食纖維結(jié)合后，酚類化合物仍保留其抗氧化活性[33]，且復(fù)合物的抗氧化活性可能與多酚結(jié)合量成正相關(guān)[34]。如圖5 所示，在0.1～0.8 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，LRP-FA 復(fù)合物的DPPH 自由基清除活性均強(qiáng)于LRP，這可能與活性羥基增多有關(guān)；然而與LRP&FA 物理混合物相比，LRP-FA 復(fù)合物的活性較弱，可能由于活性羥基因氫鍵的形成而減少。

圖5 LRP 以及LRP-FA 復(fù)合物和混合物的DPPH自由基清除能力Fig.5 DPPH radical scavenging activity of lotus root polysaccharide，and LRP-FA complexes and mixtures

2.6 LRP-FA 復(fù)合物的巨噬細(xì)胞刺激活性

巨噬細(xì)胞是抵御內(nèi)源性病原體和外源性病原體的第一道防線，也是研究細(xì)胞免疫的重要對(duì)象[35]。當(dāng)巨噬細(xì)胞被激活時(shí)，會(huì)釋放大量NO，殺死微生物、寄生蟲及腫瘤細(xì)胞，同時(shí)誘發(fā)炎癥反應(yīng)以達(dá)到保護(hù)身體的目的[36]。在200 μg/mL 質(zhì)量濃度下，LRP-FA 復(fù)合物刺激巨噬細(xì)胞NO 分泌量在24 h 和48 h 分別為15.27 μmol/L 和18.16 μmol/L（圖6），與LRP 的刺激作用無(wú)顯著差異（P＞0.05），而均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。LRP 和LRP-FA復(fù)合物能夠刺激Raw264.7 巨噬細(xì)胞分泌NO，而48 h 后的NO 濃度均顯著低于LPS 對(duì)照組（P＜0.05）。LPS 刺激巨噬細(xì)胞NO 分泌量在24 h 和48 h 分別為17.69 μmol/L 和21.84 μmol/L。LRP 和LRP-FA 復(fù)合物對(duì)LPS 誘導(dǎo)的NO 分泌均無(wú)抑制效果（P＞0.05），而后者在48 h 后的NO 分泌量較低（P＜0.05）。由此可見(jiàn)，LRP 及LRP-FA 均可不同程度刺激RAW264.7 細(xì)胞分泌NO，且不會(huì)加劇炎癥反應(yīng)。

圖6 LRP-FA 復(fù)合物對(duì)巨噬細(xì)胞NO 分泌的影響Fig.6 The effect of LRP-FA complex on the NO secretion of macrophages

3 結(jié)論

LRP 能與FA 通過(guò)非共價(jià)相互作用形成復(fù)合物，而物理混合的溫度、pH、LRP-FA 質(zhì)量比和離子濃度對(duì)FA 結(jié)合量都有顯著影響。以FA 結(jié)合量為指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合物制備工藝：在溫度0 ℃，pH 7，LRP-FA 質(zhì)量比1∶2 且離子濃度為0 的條件下，F(xiàn)A 結(jié)合量可達(dá)110.22 mg/g。結(jié)合LRP-FA 復(fù)合物的光譜特征和分子質(zhì)量分布分析，證實(shí)了二者的相互作用，且通過(guò)溫度、pH 和離子濃度對(duì)FA 結(jié)合量的影響判斷，該作用以氫鍵為主。

考察不同溫度和消化條件對(duì)LRP-FA 復(fù)合物穩(wěn)定性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：復(fù)合物中FA 的解離率與溫度呈正相關(guān)，適宜于低溫下作用；復(fù)合物在3種消化液中的FA 解離率均低于25%，表現(xiàn)出一定的消化穩(wěn)定性，可實(shí)現(xiàn)消化過(guò)程中的FA 緩釋。相比LRP，LRP-FA 復(fù)合物具有更強(qiáng)的DPPH 自由基清除活性，同時(shí)保留良好的巨噬細(xì)胞免疫刺激活性。通過(guò)多糖和多酚的非共價(jià)作用調(diào)控，預(yù)期能改善蓮藕食品的營(yíng)養(yǎng)特性。然而，影響多糖-多酚復(fù)合物生物活性和生物利用度的內(nèi)源性和外源性因素，以及構(gòu)效關(guān)系，還有待進(jìn)一步研究。