沈鑫婷，姜秀杰，許慶鵬，張愛武，張東杰*

（1 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所 黑龍江省食品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黑龍江省全谷物營養(yǎng)食品工程技術(shù)研究中心 哈爾濱 150086 2 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 黑龍江 大慶 163000）

2 型糖尿?。═ype 2 diabetes，T2DM）是代謝性疾病，主要以高血糖和胰島素抵抗為特征[1-2]。T2DM 的大多數(shù)治療干預(yù)都集中在通過刺激胰島素分泌、減少葡萄糖產(chǎn)生或增強(qiáng)胰島素對靶組織的作用來降低血糖水平[3-4]。而近年來許多研究表明，腸道菌群也是參與糖尿病發(fā)生和發(fā)展的一個(gè)重要因素，由于腸道微生物群結(jié)構(gòu)和功能上的變化和高血糖、胰島素抵抗等糖尿病表型密切相關(guān)，腸道菌群及其相關(guān)代謝產(chǎn)物在血糖代謝、胰島素抵抗以及慢性炎癥等2 型糖尿病的病理生理機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)無論是飲食干預(yù)還是藥物治療，腸道都是調(diào)節(jié)糖尿病的重要場所。對腸道菌群[5]調(diào)節(jié)影響最大的因素是飲食因素，如高脂或高糖飲食，可能導(dǎo)致腸道菌群發(fā)生變化，進(jìn)而引發(fā)腸道炎癥。T2DM 還存在不同程度的慢性低度炎癥反應(yīng)[6]，常伴有炎癥因子，如白細(xì)胞介素和腫瘤壞死因子升高。胰島β 細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能受損可能由炎癥因子的釋放所致，甚至導(dǎo)致胰島素分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生障礙[7]。而通過腸道菌群可調(diào)節(jié)代謝疾病的屏障功能和宿主炎癥狀態(tài)。

綠豆是中國重要的食用豆類作物之一[8]。由于它的纖維成分含量高，糖分含量比較低，因此是糖尿病患者的推薦食物。綠豆的發(fā)芽過程實(shí)質(zhì)是綠豆的活化過程。發(fā)芽處理為雜糧加工手段之一，可有效提高谷物的營養(yǎng)價(jià)值和生物活性成分含量。大量研究證實(shí)綠豆的化學(xué)成分，尤其是多酚具有降低慢性疾病風(fēng)險(xiǎn)的健康益處[9-11]。酚類物質(zhì)是植物次生代謝產(chǎn)物，體外和臨床研究均表明[12]，多酚能夠調(diào)節(jié)腸道微生物群，有助于腸道健康的積極變化，減少炎癥過程，從而改善全身疾病狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)以綠豆為原料，發(fā)芽處理后，經(jīng)提取、純化得到多酚提取物。建立T2DM 小鼠模型，對造模成功的小鼠灌胃不同劑量的多酚提取物，通過空腹血糖值、葡萄糖耐受量、胰島素水平以及炎癥因子和肝臟組織切片的分析，探究發(fā)芽綠豆多酚提取物調(diào)控血糖及抗炎的效果。采用高通量測序技術(shù)，探究其對小鼠腸道菌群的影響，以及糖尿病與腸道菌群和炎癥因子間的聯(lián)系。旨在干預(yù)并改善2 型糖尿病，為天然、安全、有效的降糖功能性食品的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF 級C57BL/6 小鼠（18～20 g），雄性，遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司（許可證號：SCXK（遼）2020-0001），本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理遵循黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)原則?；A(chǔ)飼料、高脂飼料，南通特洛菲飼料有限公司。

綠豆，黑龍江省大慶市巴哈西伯綠豆，發(fā)芽綠豆多酚提取物由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制；STZ，美國Sigma 公司；GA-3 血糖試紙，三諾生物有限公司；鹽酸二甲雙胍，上海源葉生物科技有限公司；檢測試劑盒（FINS、TNF-α、IL-6、IL-10、CPR），南京建成生物有限公司；其它化學(xué)試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

GA-3 血糖儀，三諾生物有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；酶標(biāo)儀，中國邁瑞醫(yī)療公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；高速冷凍離心機(jī)，美國Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)芽綠豆多酚的制備流程 發(fā)芽綠豆多酚的制備[13-16]：挑選新鮮優(yōu)質(zhì)綠豆進(jìn)行發(fā)芽處理，利用響應(yīng)面優(yōu)化法，確定綠豆最佳的發(fā)芽工藝為：浸泡溫度25 ℃，浸泡時(shí)間11 h，發(fā)芽溫度28 ℃，發(fā)芽時(shí)間3 d，浸泡液CaCl2濃度2 mmol/L，在此條件下，多酚含量為487.81 mg/100 g。綠豆經(jīng)過發(fā)芽處理，取出沖洗、烘干（40 ℃，鼓風(fēng)干燥箱）、粉碎（過80 目篩）。稱取過篩后的發(fā)芽綠豆粉于燒杯中，根據(jù)1∶26（g/mL）的料液比加入70%的乙醇溶液，經(jīng)過超聲、離心（5 000 r/min，15 min）、取上清液，在45 ℃條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，即得發(fā)芽綠豆多酚粗提物。對多酚粗提物純化（AB-8 大孔樹脂），收集純化后溶液，冷凍干燥，制得綠豆發(fā)芽多酚提取物（Germinated mung bean polyphenol，GMP）。

1.3.2 2 型糖尿病小鼠模型的建立 SPF 級C57BL/6 雄性小鼠在12 h 明暗交替（8∶00～20∶00），室溫（23±2）℃，相對濕度40%左右且通風(fēng)良好的環(huán)境下，分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間均自由飲食、飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，根據(jù)體質(zhì)量進(jìn)行隨機(jī)分組：正常對照組（n=6）和造模組（n=30），正常組進(jìn)食基礎(chǔ)飼料、造模組進(jìn)食高脂飼料。飼養(yǎng)4 周后，禁食12 h，造模組小鼠腹腔注射30 mg/kg bw 的STZ，正常組注射相同體積檸檬酸緩沖液（pH=4）[17-18]。注射72 h 后測定空腹血糖值，并在造模后第7 天檢測空腹血糖水平仍超過11.1 mmol/L 且伴隨表現(xiàn)出“三多一少”特征的小鼠視為造模成功。

1.3.3 動(dòng)物分組及給藥方法 造模成功的小鼠隨機(jī)分為5 組：模型組（M）、陽性對照組（MET，二甲雙胍，150 mg/kg）、高劑量組（MGPH，150 mg/kg）、中劑量組（MGPM，100 mg/kg）、低劑量組（MGPL，50 mg/kg）。日常飼養(yǎng)期間采取自由飲食、飲水。MET 組以及低、中、高劑量干預(yù)組分別用二甲雙胍水溶液和發(fā)芽綠豆多酚提取物水溶液進(jìn)行灌胃，正常組（N）和模型組（M）灌胃相同體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃5 周。實(shí)驗(yàn)期間，每天觀察動(dòng)物進(jìn)食量、精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤等，每周按時(shí)稱量小鼠體質(zhì)量。

1.3.4 空腹血糖值測定及口服葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)每周按時(shí)禁食12 h，測定空腹血糖值（FBG）。在最后一次灌胃結(jié)束后，小鼠禁食6 h，灌胃25%的葡萄糖溶液（2 g/kg bw），測定灌胃0，30，60，90，120 min 的血糖值，根據(jù)公式（1）計(jì)算血糖曲線下面積（AUC），并通過曲線下面積表達(dá)葡萄糖耐受量（OGTT）的變化。

1.3.5 血清指標(biāo)檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，小鼠禁食12 h，用乙醚麻醉，眼球取血，室溫下靜置30 min，低溫高速離心機(jī)3 500 r/min 離心10 min，取血清。采用ELISA 法進(jìn)行指標(biāo)檢測。

胰島素抵抗的穩(wěn)態(tài)模型評估（HOMA-IR）根據(jù)公式（2）計(jì)算：

1.3.6 肝組織的病理切片觀察 取部分固定在4%多聚甲醛中新鮮的肝臟組織，進(jìn)行石蠟包埋、切片（厚度約為4 μm）、染色、水洗、封片處理，自然晾干，用電子顯微鏡觀察組織變化，拍照記錄。

1.3.7 腸道菌群檢測 取小鼠糞便樣品收集在密封的無菌塑料管中。采樣后立即用液氮將糞便冷凍，并保存在-80 ℃下。對糞便進(jìn)行DNA 的提取、PCR 擴(kuò)增、測序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 26.0 對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理，組間兩兩比較用ANOVA 方差分析法。P＜0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，P＜0.01 表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 GMP 對糖尿病小鼠一般體征的影響

實(shí)驗(yàn)期間，觀察發(fā)現(xiàn)正常組小鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)光滑，實(shí)驗(yàn)前、后的進(jìn)食量、飲水量比較穩(wěn)定，體質(zhì)量逐漸增長。糖尿病模型組小鼠精神比較萎靡，毛發(fā)暗淡無光澤，實(shí)驗(yàn)前、后對比出現(xiàn)了“三多一少”的癥狀。陽性對照組和GMP 各劑量干預(yù)組小鼠體質(zhì)量下降幅度減少，精神狀態(tài)也有所好轉(zhuǎn)。如表1 所示，造模成功后，模型組小鼠的體質(zhì)量和正常組小鼠相比顯著下降（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與模型組對比，GMPM 組、GMPH 組和MET組小鼠的體質(zhì)量都顯著增加。

表1 GMP 對小鼠體質(zhì)量的影響（，n=6）Table 1 Effect of GMP on body weight of mice（，n=6）

表1 GMP 對小鼠體質(zhì)量的影響（，n=6）Table 1 Effect of GMP on body weight of mice（，n=6）

注：##.表示模型組與正常組比較差異極顯著（P＜0.01）；*.表示各組與模型組比較差異顯著（P＜0.05）；**.表示各組與模型組比較差異極顯著（P＜0.01），下同。

2.2 GMP 對糖尿病小鼠空腹血糖及口服葡萄糖耐量的影響

由表2 可知，正常組小鼠空腹血糖濃度比較穩(wěn)定，模型組小鼠的空腹血糖濃度在造模成功后呈逐漸上升的趨勢；與模型組相比，在干預(yù)第4 周時(shí)，中、高劑量組空腹血糖均極顯著低于模型組；在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，低、中、高劑量組的空腹血糖濃度表現(xiàn)出極顯著低于模型組（P＜0.01）。測定結(jié)果表明，GMP 可以改善T2DM 小鼠干預(yù)期間的血糖水平，各劑量干預(yù)組中以高劑量組的多酚溶液效果最佳。

表2 GMP 對小鼠血糖的影響（，n=6）Table 2 Effect of GMP on blood glucose in mice（，n=6）

表2 GMP 對小鼠血糖的影響（，n=6）Table 2 Effect of GMP on blood glucose in mice（，n=6）

糖耐量即機(jī)體對葡萄糖的耐受情況，判斷干預(yù)后胰島β 細(xì)胞對血液中血糖調(diào)節(jié)能力的強(qiáng)弱。血糖曲線下面積（AUC）反映的是人體利用和清除葡萄糖的程度，當(dāng)AUC 增大則說明機(jī)體對葡萄糖的耐受能力下降，反之能力升高。如表3 所示，N組的血糖值隨著時(shí)間的延長變化平緩，M 組小鼠血糖在前30 min 內(nèi)迅速升高，在達(dá)到峰值后呈下降趨勢，而血糖值一直較高。各劑量干預(yù)組的血糖值在60 min 后出現(xiàn)緩慢下降的趨勢，均未恢復(fù)到初始血糖值。根據(jù)AUC 顯示，M 組顯著高于N 組（P＜0.01），與M 組相比，各劑量干預(yù)組和陽性對照組呈現(xiàn)顯著性降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，GMP 可以在一定程度上提高T2DM 小鼠的糖耐量，而且從恢復(fù)程度上看，高劑量組的效果較好。

表3 發(fā)芽綠豆多酚對小鼠糖耐量的影響Table 3 Effects of germinated mung bean polyphenols on glucose tolerance in mice

2.3 GMP 對糖尿病小鼠胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)的影響

胰島素是胰島β 細(xì)胞分泌的、唯一能夠降低血糖的激素，對調(diào)節(jié)血糖有重要影響。如圖1 所示，與正常組比較，模型組的胰島素水平和HOMA-IR 指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，陽性對照組胰島素水平明顯降低（P＜0.05），多酚提取物各劑量干預(yù)組顯著降低了HOMA-IR 指數(shù)水平（P≤0.01），而胰島素水平雖有下降，但無顯著性差異。表明發(fā)芽綠豆多酚提取物可以增加2 型糖尿病小鼠的胰島素敏感性，降低胰島素抵抗。

圖1 GMP 對糖尿病小鼠胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)的影響Fig.1 Effect of GMP on insulin level and insulin resistance index in diabetic mice

2.4 GMP 對糖尿病小鼠的炎癥反應(yīng)

GMP 對T2DM 小鼠炎癥反應(yīng)的影響如圖2所示，與正常組相比，模型組小鼠血清中IL-6 從227.37 ng/L 上升到309.25 ng/L，顯著升高了36%；TNF-α 從44.22 ng/L 升高到81.64 ng/L，顯著升高了84.62%；C 反應(yīng)蛋白（CRP）從27.84 μg/mL 升高到47.68 μg/mL，顯著升高了71.26%；IL-10 顯著降低了37.54%。CRP 是一種非特異的炎癥標(biāo)志物，由肝細(xì)胞所合成，其合成的最重要的調(diào)節(jié)因子是IL-6 和TNF-α，其升高的程度反映了炎癥組織的大小和活動(dòng)性。當(dāng)C 反應(yīng)蛋白值為10～50 mg/L時(shí)，表示輕度炎癥。說明與正常組相比，模型組出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)。

圖2 GMP 對糖尿病小鼠炎癥因子的影響Fig.2 Effect of GMP on inflammatory factors in diabetic mice

與模型組比較，GMP 中、高劑量干預(yù)組的IL-6 質(zhì)量濃度從309.25 ng/L 分別降低至265.83，209.91 ng/L，顯著降低了14.04%，32.12%（P＜0.05，P＜0.01），低劑量干預(yù)組降低了9%，而無顯著差異。低、中、高劑量干預(yù)組以及陽性對照組的TNFα 質(zhì)量濃度與模型組相比，顯著降低了23.33%，41.18%，35.25%，42.16%（P＜0.01）；IL-10 質(zhì)量濃度與模型組比，顯著升高了23.02%，35.88%，59.07%，52.15%（P＜0.01）；中、高劑量干預(yù)組以及陽性對照組的CRP 質(zhì)量濃度與模型組相比，顯著降低了16.97%，48%，51.13%，低劑量干預(yù)組降低了10%，然而無顯著差異。說明GMP 干預(yù)組可以顯著降低IL-6、TNF-α、CPR 的水平，升高IL-10的水平，進(jìn)而緩解糖尿病引起的炎癥反應(yīng)。

與模型組對比，動(dòng)物內(nèi)臟均未出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷情況，說明發(fā)芽綠豆多酚灌胃劑量對動(dòng)物是安全的。如圖3 所示，N 組的肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，未見炎癥細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)飽滿，組織中央靜脈清晰可見，肝竇呈放射狀沿著中央靜脈，紅色箭頭所示為肝竇巨噬細(xì)胞。M 組的肝組織結(jié)構(gòu)異常，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松，組織可見較多炎癥細(xì)胞浸潤（黑色箭頭所示）。MET 組的肝組織未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)飽滿。GMPL 組部分肝細(xì)胞輕微水腫，組織可見明顯炎癥細(xì)胞浸潤（黑色箭頭所示）。GMPM 組的肝組織結(jié)構(gòu)輕度異常，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤，部分肝細(xì)胞輕微水腫（黃色箭頭所示）。GMPH 組的肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)飽滿，組織中央靜脈清晰可見，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤。

圖3 GMP 對糖尿病小鼠肝臟炎癥反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of GMP on liver inflammation in diabetic mice

2.5 GMP 對糖尿病小鼠腸道菌群的影響

2.5.1 小鼠腸道Alpha 多樣性分析 Alpha 多樣性（Alpha diversity）表示單獨(dú)樣品的物種豐度及其物種多樣性，有不同衡量指標(biāo)。如圖4 所示，模型組的腸道菌群ACE、Chao、Shanon、Simpson 指數(shù)低于正常組，表明了T2DM 小鼠的物種多樣性降低。與模型組相比，GMP 能夠提高腸道菌群的α多樣性指數(shù)，抑制腸道菌群豐富度下降的能力，并能增加菌群的物種多樣性。本實(shí)驗(yàn)還統(tǒng)計(jì)了覆蓋率，其數(shù)值反映測序結(jié)果是否代表了樣品中微生物的真實(shí)情況，覆蓋率越高，則物種被檢測出來的概率越大。說明GMP 干預(yù)可以在一定程度上平衡失調(diào)的腸道菌群。

圖4 小鼠腸道菌群的α 多樣性指數(shù)Fig.4 Changes of intestinal flora in mice α diversity index

2.5.2 小鼠腸道微生物物種分類分析 如圖5 所示，對每組在門水平上比較分析，結(jié)果顯示腸道菌群主要有：厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、疣孢菌門（Verrucomicrobia）等。與N 組小鼠對比，M 組小鼠腸道厚壁菌豐度顯著升高，擬桿菌的豐度顯著降低（P＜0.01），與M 組比較，多酚提取物干預(yù)后，厚壁菌豐度顯著降低，擬桿菌豐度顯著升高，變形桿菌門相對豐度顯著降低。表明菌株在門水平上的豐度會(huì)影響腸道菌群的平衡。

圖5 腸道菌群門水平分析Fig.5 Analysis of phylum level of intestinal flora in mice

2.6 血清炎癥因子和腸道菌群與代謝指標(biāo)的相關(guān)性分析

用Spearman 相關(guān)分析，血清炎癥因子、腸道菌群與糖代謝指標(biāo)的相關(guān)性。如圖6 顯示，小鼠的空腹血糖（FBG）與IL-6、TNF-α、CPR、厚壁菌門、變形菌門呈正相關(guān)，與IL-10、擬桿菌門呈負(fù)相關(guān)。厚壁菌門、變形菌門與IL-6、TNF-α、CPR 呈正相關(guān)，與IL-10 呈負(fù)相關(guān)。擬桿菌門與IL-6、TNF-α、CPR 呈負(fù)相關(guān)，與IL-10 呈正相關(guān)。

圖6 血清炎癥因子和腸道菌群與代謝指標(biāo)的相關(guān)性分析熱圖Fig.6 Heat map of correlation analysis between serum inflammatory factors，intestinal flora and metabolic indexes

3 討論

2 型糖尿病通常被稱為非胰島素依賴型糖尿病，是一種以持續(xù)高血糖診斷為基礎(chǔ)的代謝性疾病[19]。近年來，2 型糖尿病的患病率逐年上升，目前市場上治療糖尿病的常用藥物雖然具有較好的效果，但大多存在一定副作用[20]。因此開發(fā)一種天然、安全、有效的降糖功能性食品，成為當(dāng)前糖尿病研究的熱點(diǎn)。一項(xiàng)流行病學(xué)研究表明，攝入富含多酚的飲食可以大大降低患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[21]。

本文探究發(fā)芽綠豆中提取的多酚的降糖效果。在GMP 干預(yù)5 周后，結(jié)果顯示，GMP 可顯著改善T2DM 小鼠的“三多一少”癥狀，降低T2DM小鼠的高血糖和胰島素抵抗，減輕炎癥反應(yīng)，并對肝臟組織起到保護(hù)或修復(fù)作用。肝臟是參與代謝的關(guān)鍵炎癥器官，參與代謝物的儲(chǔ)存和排泄[22]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GMP 能修復(fù)小鼠肝細(xì)胞溶解、炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，使肝損傷情況得到改善。其上述作用的發(fā)揮與腸道菌群的調(diào)節(jié)存在相關(guān)性。GMP 可調(diào)節(jié)糖尿病小鼠門水平上的菌群豐度，厚壁菌門和變形菌門豐度增加，其血糖和炎癥指標(biāo)水平也越高；擬桿菌門豐度增加，其血糖和炎癥指標(biāo)水平降低。有研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌門具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用，在炎癥小鼠模型的腸道菌群中，擬桿菌門的數(shù)量降低[23-24]。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。近年來有許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)表明，多酚可以通過不同機(jī)制調(diào)節(jié)腸道中微生物菌群、微生物多樣性以及厚壁菌門與擬桿菌門的比例（F/B）[25-27]；并且多酚對葡萄糖代謝有益，可顯著改善機(jī)體葡萄糖耐受[28]，由于飲食攝入后第1 個(gè)接觸的器官是胃腸道，因此腸道可能是多酚發(fā)揮代謝作用的主要場所[29]。而且T2DM 小鼠腸道菌群的物種多樣性、豐度與血糖、炎癥因子水平密切相關(guān)。因此通過調(diào)節(jié)腸道菌群、改善炎癥反應(yīng)來改善T2DM 等代謝性疾病，被認(rèn)為是目前新的治療策略[30]。

綜上所述，一定劑量的發(fā)芽綠豆多酚提取物可以顯著改善2 型糖尿病小鼠的血糖水平，同時(shí)改善炎癥反應(yīng)，并對肝損傷起到一定程度的修復(fù)作用；增加腸道菌群的多樣性，平衡失調(diào)的腸道菌群。結(jié)果表明發(fā)芽綠豆多酚提取物是一種具有潛力和研究價(jià)值的天然降糖物質(zhì)，在糖尿病治療中具有廣闊前景。