鹿王成志 舒小康 吳艷

采用斑馬魚試驗，探究余甘子提取物在化妝品中的功效。方法：用過飽和氯化鈉溶液處理斑馬魚尾部，使其尾部面積因皺縮而變小，建立保濕功效評價模型；檢測膠原基因相對表達(dá)量來判斷是否擁有抗皺功效；使用經(jīng)皮吸收的方式進(jìn)行給樣，通過對比斑馬魚體表黑色素含量，檢測是否擁有美白功效；觀察斑馬魚胚胎自主翻滾次數(shù)，檢測是否擁有溫和無刺激功效。結(jié)果：余甘子提取物擁有保濕、抗皺、美白、溫和無刺激功效，在化妝品中擁有良好的潛在應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：斑馬魚；余甘子；化妝品功效；斑馬魚實驗

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及人們健康意識的提高，消費者對純天然化妝品的需求不斷提升。相比于化工原料制造的化妝品，使用天然原料制造的化妝品更受消費者青睞，尤其是使用各種植物提取物為原料的天然化妝品。截至2015年，化妝品已經(jīng)使用的原料中將近有三分之一屬于植物原料[1]，而其中又屬植物提取物較受消費者的歡迎。植物提取物含有一定的活性成分[2]，這些成分擁有良好的化妝品功效，且豐富的植物提取物種類為化妝配方設(shè)計帶來了更多選擇性。因此，植物提取物應(yīng)用在化妝品當(dāng)中，既滿足了消費者對于純天然的追求[3]，又滿足了化妝品廠商對功效多樣性的追求。中藥作為中華文明流傳下來的瑰寶，除了有藥用價值外，還有保健作用，可以作為保健品食用，因此中草藥化妝品也成為化妝品的行業(yè)風(fēng)口之一，其中中草藥提取物更是提供了許多化妝品原材料。

余甘子（Phyllanthus emblica L.） 是一種分布在我國南方的特色經(jīng)濟(jì)樹種[4]，是第一批列入“既是食物又是藥物的物品名單” 的中藥材，同時也是聯(lián)合國衛(wèi)生組織指定的世界推廣種植的3 種保健植物之一。作為藥材其已經(jīng)擁有2000 余年的歷史，在中藥、藏藥、蒙藥、白藥、壯藥中都有廣泛應(yīng)用。余甘子含有上百種成分，主要包括多酚（ 單寧）、黃酮、還原糖、多糖、萜類，甾醇、揮發(fā)油以及多種營養(yǎng)成分[5，6]，其維生素C 含量極高[7]，能夠提高人體免疫力，延緩衰老。余甘子已經(jīng)在化妝品市場獲得了長時間的關(guān)注，有一定的群眾認(rèn)同基礎(chǔ)。因此，以余甘子為基礎(chǔ)原料制成的余甘子提取物，在化妝品領(lǐng)域有極高的關(guān)注價值，需要用合適的方法進(jìn)行來評價余甘子提取物的實際功效效果。斑馬魚與人體基因相似度高達(dá)87％ [8]，因此基因表達(dá)也擁有相似性，從而對斑馬魚進(jìn)行試驗的結(jié)果多數(shù)也適用于人體。而且相比于其他哺乳類實驗動物，斑馬魚不存在周期長、繁殖慢、費用高且操作復(fù)雜等問題，可以快速大批量檢測，且測試成本更低，在化妝品原料篩選和配方驗證方面都已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[9]。本文通過斑馬魚化妝品體外功效檢測方式，對廣州棟方生物科技股份有限公司的余甘子提取物在化妝品中的功效進(jìn)行了探究。

01 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

余甘子提取物，廣州棟方生物科技股份有限公司；氯化鈉，廣州化學(xué)試劑廠 ；十二烷基硫酸鈉，麥克林上海生物化學(xué)有限公司；甲基纖維素，麥克林上海生物化學(xué)有限公司；斑馬魚引物試劑盒，合肥知恩生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器

1-14K 型冷凍離心機，德國希格瑪實驗室離心機公司；Z-A-S5 斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)，上海海圣生物實驗設(shè)備有限公司；BCE224-1CCN 型分析天平，賽多利斯公司；IN812C 型低溫恒溫保溫箱，雅馬拓科技貿(mào)易（ 上海） 有限公司；SZX12型體式熒光顯微鏡，舜宇光學(xué)科技（ 集團(tuán)） 有限公司；gentier96 熒光定時定量pcr 儀，西安天隆科技有限公司。

1.1.3 試驗動物

野生品系A(chǔ)B 型斑馬魚，以自然或成對交配方式繁殖。

1.1.4 術(shù)語

受精后天數(shù)：days post-fertilization（dpf）受精后小時數(shù)：Hours post-fertilization（hpf）無可觀察效應(yīng)濃度：與對照組相比，對實驗生物未產(chǎn)生顯著性效應(yīng)的最高受試物濃度，即“no observedeffect concentration（NOEC）”，不同實驗項目的同一樣品NOEC 不同。

1.2. 方法

1.2.1 保濕功效試驗方法

用氯化鈉過飽和溶液處理72hpf 的斑馬魚，由于滲透壓皮膚表面將會失水皺縮，尾部面積因皺縮而變小。通過對尾部面積的影響評價化妝品的補水保濕效果[10，11]。

將30 尾72hpf 斑馬魚隨機平均分成三組，分別是空白對照組、模型對照組和樣品處理組。其中空白對照組加入魚胚胎培養(yǎng)液，模型對照組加入2％氯化鈉溶液，樣品處理組加入用2％氯化鈉溶液配制的0.125％樣品混合液。

隨后將斑馬魚胚胎轉(zhuǎn)移至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，1 尾/ 孔，每孔加入200μl 溶液，置于28.5℃ ±0.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育30min。30min 后，將斑馬魚置于載玻片上使其平躺，體式顯微鏡下拍照。用Image J 軟件測量斑馬魚尾部面積，計算各組的平均斑馬魚尾部面積，通過對尾部面積的影響評價化妝品的補水保濕效果。

1.2.2 抗皺功效試驗方法

皮膚的生長、修復(fù)、營養(yǎng)、彈性以及張力都與膠原蛋白有關(guān)，其流失會使皮膚光滑度下降，產(chǎn)生皺紋。在人體中，I 型膠原蛋白是一個三聚體，主要由兩個α1 鏈和一個α2 鏈組成，分別由 col1a1 和 col1a2 基因編碼，在結(jié)締組織和骨中執(zhí)行膠原蛋白相關(guān)生物功能。在斑馬魚中存在三種 I 型膠原基因，分別編碼α1（I）、α2（I） 和α3（I） 鏈的 col1a1a、col1a1b 和 col1a2。因此，通過檢測 col1a1a或（和）col1a1b 或（和）col1a2 基因相對表達(dá)量可表明樣品是否具有抗皺功效[12]。

將60 尾96 hpf 的斑馬魚幼魚隨機分成兩組，分別是空白對照組與樣品處理組，每組挑選發(fā)育正常的96hpf 野生型斑馬魚幼魚30 尾于6 孔板的1 孔中，在不傷害斑馬魚的情況下除去6 孔板中的緩沖水，并加入0.125％的余甘子提取物溶液3 mL，空白對照組加入緩沖水，蓋上培養(yǎng)板面。

在28.5℃ ±0.5 ℃的生化培養(yǎng)箱中避光孵育至120 hpf，在實驗滿足有效性的基礎(chǔ)上，受試物和空白對照組/ 溶劑對照組對比，如col1a1a 或（和）col1a1b 或（和）col1a2 相對表達(dá)量顯著增加（P <0.05），說明該受試物在該濃度下，能增加彈性蛋白col1a1a 或（和）col1a1b 或（和）col1a2 相對表達(dá)量，可作為抗皺功效評價的證據(jù)支撐之一。

1.2.3 美白功效試驗方法

黑色素的形成、轉(zhuǎn)移、沉積和代謝是決定皮膚顏色的關(guān)鍵因素。斑馬魚的皮膚結(jié)構(gòu)、黑色素合成機制與人類高度相似。

此外，斑馬魚胚胎透明，體表黑色素明顯，易于觀察及呈現(xiàn)；胚胎發(fā)育迅速，黑色素在3 ～ 4d 內(nèi)迅速形成，試驗周期短。本試驗擬使用經(jīng)皮吸收的方式進(jìn)行給樣，通過對比斑馬魚體表黑色素含量，判定產(chǎn)品（ 原料） 的美白功效[13-15]。

收集AB 系野生型斑馬魚24hpf 胚胎，分為2 組，分別是空白對照組和樣品處理組，并隨機分配到24 孔板中，每孔10 尾，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。在不傷害幼魚的情況下除去24 孔板中的緩沖水，然后迅速向每孔中加入1mL 溶液，其中空白組加入魚胚胎培養(yǎng)液，樣品處理組加入0.125％余甘子提取物。置于 28.5℃ ±0.5 ℃生化培養(yǎng)箱孵育48h 后，從斑馬魚胚胎中每孔隨機選取至少5 尾斑馬魚，用4% 甲基纖維素固定，在顯微鏡下觀察并拍照，拍照時選取斑馬魚俯視圖，身體保持水平，頭朝左側(cè)。所有斑馬魚的拍照結(jié)果需在相同的儀器和環(huán)境下完成，且斑馬魚的體位應(yīng)保持一致。

拍照完成后，選取黑色素累積部位通過Image J 軟件進(jìn)行黑色素面積統(tǒng)計，對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.4 溫和無刺激功效試驗方法

斑馬魚胚胎有極強的敏感性，可以通過經(jīng)皮吸收方式，對包括藥物、食品、化妝品等化合物的刺激性進(jìn)行評價。在17～26 hpf 時期，斑馬魚胚胎運動神經(jīng)已發(fā)育，但尚未有自主運動產(chǎn)生，此時的翻滾運動由外界刺激而產(chǎn)生，對此階段斑馬魚胚胎的翻滾次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計，可反映外源化合物對斑馬魚胚胎的刺激程度。本試驗擬使用經(jīng)皮吸收的方式進(jìn)行給樣，添加待測樣品，觀察斑馬魚胚胎的自主翻滾次數(shù)，具有溫和無刺激功效的化妝品，自主翻滾次數(shù)與空白組胚胎翻滾次數(shù)沒有顯著差別，以此評價待測樣品的溫和無刺激功效[16]。將30 尾24hpf 的斑馬魚隨機平均分成2 組，每組三孔，每孔5 尾，在不傷害幼魚的情況下除去96 孔板中的緩沖水，然后迅速向孔中加入200μL 0.0625％樣品溶液，空白組加入等量魚胚胎培養(yǎng)液，孵育15min。孵育結(jié)束后，進(jìn)行視頻錄制，每孔錄制30s。視頻錄制結(jié)束后，對胚胎翻滾次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計和分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

以上功效評價結(jié)果全部使用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用獨立樣本t 檢驗，P ＜ 0.05 表示具有顯著性差異。

02 結(jié)果和討論

2.1 保濕功效結(jié)果

如圖1 所示，模型對照組相比空白對照組尾部面積顯著性減小（P <0.05）。意味著保濕模型造模成功，樣品處理組相比空白對照組沒有顯著性差異（P ＞ 0. 05），因為人體細(xì)胞與斑馬魚細(xì)胞都會在高滲溶液溶液中失水褶皺，所以可以使用過飽和氯化鈉溶液處理斑馬魚尾部，使尾部失水褶皺面積減小，以此驗證余甘子提取物的保濕功效。試驗結(jié)果說明余甘子提取物有保濕功效。

2.2 抗皺功效結(jié)果

如圖2 所示，樣品處理組對比空白對照組col1a1a 基因相對表達(dá)量顯著增加（P <0.05）。人體皮膚中膠原蛋白的含量是決定皮膚彈性高低的關(guān)鍵，如果皮膚中膠原蛋白流失，會使皮膚光滑度下降，產(chǎn)生褶皺。因此通過檢測斑馬魚體內(nèi)的膠原蛋白含量可以驗證余甘子提取物的抗皺功效。試驗結(jié)果說明余甘子提取物擁有抗皺功效。

2.3 美白功效結(jié)果

如圖3 所示，空白對照組擁有較高的黑色素含量，而使用余甘子處理的樣品處理組黑色素含量顯著減少（P <0. 05），黑色素抑制率高達(dá)26％。人體的色斑中色沉與黑色素有關(guān)，由于斑馬魚皮膚與人體皮膚結(jié)構(gòu)相似，黑色素形成機理也與人體相似，且斑馬魚幼魚身體透明，便于觀察表皮的黑色素細(xì)胞，因此通過檢測斑馬魚體內(nèi)的黑色素強度可以驗證余甘子提取物的美白功效，試驗結(jié)果說明余甘子提取物擁有美白功效。

2.4 溫和無刺激功效結(jié)果

如圖4 所示，樣品處理組與空白對照組相比斑馬魚翻滾次數(shù)沒有顯著性增加（P ＞ 0.05），因為斑馬魚與人體基因高度相似，斑馬魚在17～26hpf 時期運動神經(jīng)已經(jīng)發(fā)育，但是卻沒有自主運動產(chǎn)生，只有外源化合物的刺激會導(dǎo)致斑馬魚的抽搐，因此統(tǒng)計斑馬魚抽搐次數(shù)可以驗證余甘子提取物的溫和無刺激功效。試驗結(jié)果說明余甘子提取物擁有溫和無刺激功效。

03 結(jié)論

綜上所述，余甘子提取物在0.0625％濃度下具有溫和無刺激和美白功效，在0.125％濃度下具有保濕與抗皺功效。其機理可能是余甘子含有上百種成分，主要包括多酚（ 單寧）、黃酮、還原糖、多糖、萜類、甾醇、揮發(fā)油以及多種營養(yǎng)成分，維生素C 含量極高。推測其擁有的美白、抗皺、保濕功效是因為成分有含量極高的維生素C、多糖和多酚，查閱資料可得維生素C、多糖和多酚擁有美白、抗皺、保濕等功效[17-19]。另外，查閱資料可得余甘子提取物擁有溫和無刺激功效是因為其純天然，不含人工化學(xué)成分，且擁有多種營養(yǎng)成分，部分人工化學(xué)成分有刺激性，而多種營養(yǎng)成分卻可以滋養(yǎng)皮膚[20，21]。

余甘子在我國具有豐富的資源，原料易得，且擁有廣泛的藥用和食用價值，許多消費者對余甘子具有一定信任度。另外，余甘子的價格親民，相比其他稀有的植物提取物更受大眾的歡迎。因此，作為一款擁有美白、抗皺、溫和無刺激、保濕功效的植物提取物，余甘子提取物擁有巨大的應(yīng)用價值。