王銳麒 王碩 徐慶陽

摘要：在L-谷氨酸發(fā)酵中，磷酸鹽和生物素的添加量直接影響著谷氨酸棒狀桿菌的菌體生長和菌體轉型，生物素和磷酸鹽的含量過多或過少都會直接影響L-谷氨酸的產量，為緩解這一問題，提出了調配磷酸鹽與生物素的最適濃度配比（PVH）的策略控制發(fā)酵。為了確定發(fā)酵過程中生物素和磷酸鹽的準確含量，利用單因素實驗對磷酸鹽與生物素的濃度配比進行調整，以找出最有利于菌體快速生長和細胞迅速轉型的實驗組。該實驗設計生物素濃度梯度為4，10，14 μg/L，磷酸鹽濃度梯度為3，5 g/L，通過實驗發(fā)現，當磷酸鹽與生物素濃度配比為5∶14時，菌體量大，細胞轉型快，產酸多，糖酸轉化率高，在此條件下，最大OD600 nm達到82，較其他組分別提高了24%、47%、50%、65%，最終的菌體量為74，較其他組分別提高了29.7%、48.6%、54%、72%，L-谷氨酸的產量為86 g/L，相較于其他組分別提高了30%、45.3%、54.6%、80%。同時，在最適PVH條件下常規(guī)發(fā)酵L-谷氨酸的實驗中可以看出，其整體發(fā)酵水平高于其他非最適PVH組，該常規(guī)發(fā)酵實驗中，L-谷氨酸產量高達178 g/L，轉化率達到77%，對于谷氨酸發(fā)酵具有借鑒意義。

關鍵詞：L-谷氨酸；生物素；磷酸鹽；糖酸轉化率；磷酸鹽與生物素濃度配比；常規(guī)發(fā)酵

中圖分類號：TS201.24????? 文獻標志碼：A???? 文章編號：1000-9973（2023）08-0039-06

Study on the Effect of Optimum Concentration Ratio of Phosphate to Biotin on Glutamic Acid Fermentation

WANG Rui-qi1， WANG Shuo1， XU Qing-yang1，2，3*

（1.College of Bioengineering， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China;

2.Tianjin Engineering Laboratory of Efficient and Green Amino Acid Manufacturing，

Tianjin 300457， China; 3.National and Local United Engineering Laboratory of

Metabolic Control Fermentation Technology， Tianjin 300457， China）

Abstract： In the fermentation of L-glutamic acid， the addition amount of phosphate and biotin directly affects the bacterium growth and transformation of Corynebacterium glutamicum. Too much or too little biotin and phosphate will directly affect the yield of L-glutamic acid. In order to alleviate this problem， the optimal concentration ratio of phosphate to biotin （PVH） strategy is put forward to control the fermentation. In order to determine the accurate content of biotin and phosphate in the fermentation process， the concentration ratio of phosphate to biotin is adjusted by single factor experiment， so as to find out the experimental group which is most beneficial to the rapid growth of bacteria and the rapid transformation of cells. In this experiment， the concentration gradient of biotin is 4， 10， 14 μg/L， and the concentration gradient of phosphate is 3， 5 g/L. Through the experiment， it is found that when the concentration ratio of phosphate to biotin is 5∶14， the bacterial volume is large， cell transformation is fast， acid production is high， and sugar-acid conversion rate is high. Under such conditions， the maximum OD600 nm? reaches 82， which is 24%， 47%， 50%， 65% higher than that of the other groups respectively. The final bacterial volume is 74， which is 29.7%， 48.6%， 54%， 72% higher than that of the other groups respectively. The L-glutamate yield is 86 g/L， which is 30%， 45.3%， 54.6%， 80% higher than that of the other groups respectively. At the same time， in the experiment of conventional fermentation of L-glutamic acid under optimal PVH conditions， it can be seen that the overall fermentation level is higher than that of other non-optimal PVH groups. In this conventional fermentation experiment， the yield of L-glutamic acid is as high as 178 g/L and the conversion rate is as high as 77%， which has reference significance for glutamic acid fermentation.

Key words： L-glutamic acid; biotin; phosphate; sugar-acid conversion rate; phosphate to biotin concentration ratio; conventional fermentation

收稿日期：2023-02-27

基金項目：內蒙古自治區(qū)科技計劃項目（2021GG0299）；呼倫貝爾市“科技興市”重點專項（2021hzzx07）

作者簡介：王銳麒（1998－），男，碩士研究生，研究方向：代謝工程與發(fā)酵過程控制。

通信作者：徐慶陽（1980－），男，研究員，博士生導師，博士，研究方向：代謝工程與發(fā)酵過程控制。

L-谷氨酸在動物大腦及谷類蛋白質中含量豐富，對生物體的代謝進程有著非常重大的影響[1]。這使得L-谷氨酸普遍運用于食品、醫(yī)藥等各大行業(yè)，其為全球范圍內規(guī)模最龐大的氨基酸產品，使得其有非常光明的發(fā)展?jié)摿2-3]。但是，我國的發(fā)酵水平相較于國外，發(fā)酵產酸率較低，糖酸轉化率在60%左右，其主要是因為我國谷氨酸發(fā)酵行業(yè)中，不同批次玉米漿和糖蜜所提供的生物素含量不一，從而造成發(fā)酵過程中生物素含量難以控制，同時發(fā)酵過程中磷酸鹽含量影響菌體量的大小，只要發(fā)酵過程中生物素和磷酸鹽濃度搭配不一，就會導致菌體活力不足，產酸能力弱，因此，找出最適磷酸鹽與生物素濃度配比成為提高谷氨酸產量的關鍵因素[4-5]。

我國谷氨酸生產規(guī)模雖然占比大，生產技術比較先進，但還存在一些問題：國內現有谷氨酸的生產菌株主要為溫度敏感型突變株。溫度敏感型突變株發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿用量高，造成發(fā)酵過程中容易起泡，在發(fā)酵中后期容易染菌，提取過程中谷氨酸發(fā)酵液濃縮比低，產物收率低，初次結晶產品顏色深，含雜質高；且種子培養(yǎng)周期長，工序多，造成染菌風險大。因此，本文選用生物素亞適量型[6]發(fā)酵谷氨酸工藝，該工藝玉米漿用量低，周期短，不容易出現染菌，產酸方面較穩(wěn)定，有著較優(yōu)秀的提取收率，產品品質好。

生物素可充當羧化、脫羧等多個場景的輔助因子，參與到機體代謝進程中[7]，磷酸鹽是極為關鍵的緩沖劑，對能量的儲存與傳遞等有著重大的影響[8]。據朱蕾蕾等研究發(fā)現，在發(fā)酵過程中，生物素和磷酸鹽濃度過低或過高都會影響菌體生長和產酸量，當生物素過多時，不利于脂肪酸合成，進而影響磷脂和細胞膜的合成[9]，谷氨酸的產量降低；當磷酸鹽濃度過低時，菌體生長緩慢，耗糖慢，產酸低。

針對上述問題，此次研究中采用GDK-9為供試菌，通過單因素實驗，控制生物素和磷酸鹽的添加量，找到最適PVH（磷酸鹽與生物素的濃度配比），在最佳PVH的條件下，研究該最適PVH對常規(guī)谷氨酸發(fā)酵的影響。

1 材料與方法

1.1 菌種

L-谷氨酸生產菌：生物素亞適量型菌株黃色短桿菌GDK-9，本校相關科室負責存儲。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基

葡萄糖30 g/L；VH 3 μg/L；VB1 0.2 mg/L；FeSO4·5H2O 10 mg/L；（NH4）2SO4 1 g/L；MnSO4·H2O 10 mg/L；MgSO4·7H2O 1 g/L；K2HPO4·3H2O 3 g/L；精氨酸 0.3 g/L；賴氨酸0.3 g/L；蘇氨酸0.3 g/L；丙氨酸0.3 g/L；蛋氨酸0.3 g/L；苯丙氨酸0.3 g/L；氯化膽堿0.2 g/L；卡那霉素10 mg/L。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖40 g/L；（NH4）2SO4 6 g/L；VB1、VB2、VB3、VB5、VB12分別為2 mg/L；FeSO4·5H2O 10 mg/L；MnSO4·H2O 15 mg/L；MgSO4·7H2O 1.5 g/L；K2HPO4·3H2O（2.4，4.4 g/L）做梯度；生物素（1，7，11 μg/L）做梯度；氨基酸包 20 g/L；氯化膽堿 0.4 g/L；甜菜堿 0.2 g/L；卡那霉素 10 mg/L。

1.3 主要儀器

LDZH-100KBS全自動高壓蒸汽滅菌器 天津博鑫生物科技有限公司；Biotech-5JG 5 L自動控制發(fā)酵罐 上海保興生物設備工程有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀 濟南延和生物科技有限公司；UV1800紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 菌種活化

從－80 ℃冰箱中取出保菌管，于超凈臺上，用接種環(huán)在火焰附近，從保菌管中取3環(huán)于一代試管斜面上，在32 ℃培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.4.2 一級種子培養(yǎng)

待菌種活化后，于超凈臺上運用接種環(huán)，在試管斜面上取2～3環(huán)菌種，將其接入至3個1 L圓底燒瓶中，于220 r/min、34 ℃的搖床中培養(yǎng)10～12 h。

1.4.3 二級種子培養(yǎng)

將培育完成的種子放到火焰旁邊，經過5 L罐的進樣口傾倒至罐內，后續(xù)將pH控制在7.0左右，實際溫度參數控制在34 ℃，溶氧數據保持在50%～60%。

1.4.4 發(fā)酵培養(yǎng)

當OD600 nm提升至大約20的情況下，依據20%的接種量接入至發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中。同時加入100 mL底糖，流加氨水，使pH維持在7.0～7.4弱堿環(huán)境下，依靠調整轉速與通風，從而讓初期階段的罐壓為0.08 MPa，溶氧數據大約為50%～60%，通風速率為4～6 L/min，初始發(fā)酵溫度為34 ℃，發(fā)酵周期約為32 h。

1.5 實驗方法

1.5.1 磷酸鹽與生物素混合添加控制實驗

設計5組添加策略：

A組采取的具體設計方案：在培養(yǎng)基內部增加實際劑量為3 g/L的磷酸二氫鉀，4 μg/L的生物素；

B組采取的具體設計方案：在培養(yǎng)基內部增加實際劑量為3 g/L的磷酸二氫鉀，10 μg/L的生物素；

C組采取的具體設計方案：在培養(yǎng)基內部增加實際劑量為3 g/L的磷酸二氫鉀，14 μg/L的生物素；

D組采取的具體設計方案：在培養(yǎng)基內部增加實際劑量為5 g/L的磷酸二氫鉀，10 μg/L的生物素；

E組采取的具體設計方案：在培養(yǎng)基內部增加實際劑量為5 g/L的磷酸二氫鉀，14 μg/L的生物素。

1.5.2 常規(guī)谷氨酸發(fā)酵中驗證最適磷酸鹽與生物素濃度配比實驗

根據1.5.1各實驗組中的數據，用常規(guī)發(fā)酵原材料玉米漿代替生物素，驗證最適添加組能否使菌體量最大、細胞轉型快、糖酸轉化率高。

1.6 發(fā)酵檢測方法

1.6.1 發(fā)酵過程中pH測定

以罐內pH電極進行測試，樣液運用精密pH試紙進行精準測試。

1.6.2 發(fā)酵過程中殘?zhí)菧y定

發(fā)酵起始每2 h取樣測試，將樣品倒入1.5 mL EP管中，采用TG16-W離心機持續(xù)處理2 min，取對應的上清液，對此進行稀釋百倍的處理，后續(xù)運用SBA-40E生物傳感分析儀測試具體的殘?zhí)菂怠?/p>

1.6.3 發(fā)酵過程中菌體量測定

菌體量測定可用吸光度OD600 nm表示，每2 h取樣，根據發(fā)酵周期稀釋相應倍數，采用UV1800紫外可見分光光度計測定OD600 nm。菌體量=OD600 nm×稀釋倍數。

1.6.4 發(fā)酵過程中谷氨酸測定

發(fā)酵起始，每2 h取樣，用離心機離心2 min，取上清液，稀釋100，200，300等相應倍數，再用SBA-40E生物傳感分析儀測定谷氨酸產量。

2 結果與討論

2.1 不同磷酸鹽與生物素濃度配比對發(fā)酵過程的影響分析

在5 L發(fā)酵罐中進行不同磷酸鹽與生物素濃度配比的分批發(fā)酵，在發(fā)酵過程中每2 h測定菌體量（OD600 nm）、L-谷氨酸的產量和最終的糖酸轉化率，并繪制發(fā)酵過程的菌體量曲線、產酸曲線和轉化率圖表，按照不同濃度配比設計出單因素實驗組，磷酸鹽與生物素濃度配比分別為A（3∶4）、B（3∶10）、C（3∶14）、D（5∶10）、E（5∶14），從而確定最佳混合配比，通過測定發(fā)酵過程中L-谷氨酸產量、菌體量以及糖酸轉化率，明確不同配比對菌體生長與產酸的影響，結果見圖1。

由圖1中a可知，菌體量在整個發(fā)酵過程中首先處于急劇增加趨勢，隨后進入平穩(wěn)期，最后走向衰退期[10]，不同實驗組的菌體量在4 h內均呈現不同幅度的上升，其中E組菌體量上升幅度最快，最高組菌體量OD600 nm為82，隨著生物素和磷酸鹽濃度的調整，A、B、C、D組最高菌體量OD600 nm分別為25.2，41.2，43，61.2；較E組分別降低了69.2%、49.7%、47.5%、25.3%。E組終菌體量為74，較A、B、C、D組分別提高了72.9%、54%、48.6%、29.7%。由圖1中b可知，發(fā)酵0～4 h的時間段，發(fā)酵液中有L-谷氨酸產出且不同實驗組呈現不同速度的增長幅度，由此說明此時間段菌體開始轉型，4 h后谷氨酸開始大量積累，到22 h時產酸均達到最大，E組最高產酸量達到86 g/L。A、B、C、D組L-谷氨酸產量分別為18，41，47，60 g/L，較E組分別降低了79%、52.3%、45.3%、30%。結合圖1中a和b可知，菌體量與L-谷氨酸產量呈正相關，菌體量越大，L-谷氨酸產量越大。由圖1中a可知，A組磷酸鹽濃度為3 g/L，生物素濃度為4 μg/L，此時磷酸鹽濃度過低，導致谷氨酸棒狀桿菌生長受到抑制，菌體量增長緩慢[11]；生物素濃度過低，不利于脂肪酸合成，進而影響磷脂合成，導致細胞轉型慢[12]，造成L-谷氨酸產量相對于其他組低。在相同磷酸鹽濃度的條件下，A、B、C組整體菌體量增幅明顯低于高磷酸鹽組，且最大菌體量也低于高磷酸鹽組，由此說明磷酸鹽濃度過低，菌體生長受到抑制[13]。同組內，由于生物素濃度依次提高，菌體量增幅C組＞B組＞A組，相鄰兩組最大菌體量下降幅度依次為3.5和16，由此說明，磷酸鹽與生物素的濃度配比影響著菌體量的生長。另外，由圖1中a可知，A、B、C組整個發(fā)酵過程延滯期明顯長于D、E組，A組延滯期最長，最大菌體量最低。由圖1中b可知，0～4 h內，各組均有產酸，且每組增幅差距不是特別大，這是因為發(fā)酵起始時，磷酸鹽和生物素濃度對發(fā)酵產酸的影響不明顯，4 h后，細胞開始大量轉型，D、E組最高產酸量分別為60，86 g/L，產酸水平高于A、B、C組，由于磷鹽濃度較高于其他組，細胞呼吸和胞內ATP水平得以控制，糖代謝水平高，所以整體產酸水平高[14]。同磷酸鹽濃度水平的各組中，生物素濃度提高，產酸量也隨之提高。A、B、C組最高產酸量分別為18，41，47 g/L，相鄰兩組產酸量升高幅度依次為23和5。這是因為生物素濃度的高低決定細胞轉型的水平。細胞轉型快，轉型數量多，對應的產酸量高。當生物素濃度過量時，幾乎沒有產酸型細胞，細胞形態(tài)和種子較接近，幾乎未分泌谷氨酸，有著僅長菌、耗糖、不產酸的現象[15]。綜合結果來看，在發(fā)酵時應當選擇E組磷酸鹽/生物素的最適濃度配比。

由表1可知，在低磷酸鹽濃度組中，C組谷氨酸產量最大，加入相同體積80%葡萄糖溶液后，發(fā)現A組轉化率最低，由于該組生物素含量低，細胞轉型慢，轉型細胞數量少，產酸率低，當磷酸鹽不足時，發(fā)酵后期發(fā)酵液中磷酸鹽幾乎耗盡，發(fā)酵相對無力，菌體早衰，因此糖酸轉化率低，僅為25%。而高磷酸鹽組中，E組生物素和磷酸鹽足夠使菌體快速轉型，菌體量大量上升，因此耗糖大，轉化率高，約為66.1%。高磷酸鹽、高生物素組糖酸轉化率明顯大于低磷酸鹽、低生物素組，且轉化率接近正常水平[16]；因此，E組相較于其他組，磷酸鹽與生物素的比值最適宜。

通過上述結果分析，可以看出生物素與磷酸鹽的濃度對L-谷氨酸發(fā)酵產酸具有十分重要的影響：菌體生長需要磷酸鹽，在整個谷氨酸發(fā)酵過程中，磷源的量與菌體形變及生長速度有很大的關系。作為EMP途徑的關鍵元素，磷和ATP的產生有密切聯系[17-18]；細胞中ATP的周轉以及能量水平會極大影響EMP途徑的葡萄糖耗費。因此，在培養(yǎng)基中必須添加一定量的磷酸鹽才能保證菌體的正常生長。磷酸鹽在5 g/L時菌體長得最快，菌體量相對于3 g/L的磷酸鹽長得多。生物素是控制L-谷氨酸積累的重要因素。生物素是催化乙酰CoA羧化酶的重要輔酶[19]，進而加入到脂肪酸的合成進程中，因此干涉磷脂的合成、細胞膜的正式誕生，為誕生有益于谷氨酸排放的細胞膜[20]，期望磷脂合成不足，所以要求合理管控生物素亞適量的狀態(tài)，改組實驗中生物素最適濃度為14 μg/L左右。

2.2 最適生物素與磷酸鹽的比值對常規(guī)發(fā)酵的影響

通過上述實驗的探究分析可得出，當磷酸鹽與生物素濃度配比在5∶14的條件下，發(fā)酵過程中菌體量、L-谷氨酸產量、糖酸轉化率均比其他組高。但相較于傳統發(fā)酵培養(yǎng)基，實驗組發(fā)酵培養(yǎng)基成分簡單，取消了傳統有機氮源豆餅水解液和玉米漿等工業(yè)原料，而這些工業(yè)原料在發(fā)酵過程中除了提供生物素和氮源外，還有很多供菌體生長的營養(yǎng)物質，因此，導致實驗組即使是在最適PVH條件下，由于整體培養(yǎng)基營養(yǎng)不夠，菌體量不能進一步生長，進而導致L-谷氨酸的產量不夠高，達不到正常水平。所以，常規(guī)發(fā)酵實驗中，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加豆餅水解液和同一批次且生物素含量確定的玉米漿等有機原料，以提高菌體量，增大產酸量，結果見圖2。

圖2中F組和G組磷酸鹽與生物素濃度配比分別為5∶14、3∶14，由圖2中a可知，在相同生物素的條件下，隨著磷酸鹽濃度的增加，菌體量F組＞G組，由圖2中c可知，菌體量生長速度在4 h時出現最大值，表明在同生物素、不同磷酸鹽的條件下，高磷酸鹽的菌體量長得更快，衰退時間更晚，在F組中，其最大菌體量為86，終菌體量為73，G組最大菌體量為73.2，終菌體量為62，相較于G組，F組菌體量提高了14.8%，終菌體量提高了15%，終菌體量升高幅度為11，最大菌體量升高幅度為12.8，兩組曲線趨勢大致相同，起始都以較高的生長速率生長，4 h達到最高比生長速率，菌體量達到峰值，伴隨著實際發(fā)酵時間的不斷增長，比生長速率有一定程度的降低，數值接近0，此時，菌體增幅不大，開始積累L-谷氨酸，18 h以后，該數據是負值的情況下，意味著該階段的菌體量有所降低，F組比G組比生長速率數值絕對值小，因此菌體量比G組下降緩慢，所以可以分析出高磷酸鹽、高生物素菌體量更大，生長速率更快。

由圖2中b可知，F組和G組的曲線趨勢大致一致，2 h細胞轉型，4 h后開始大量產酸，F組最高產量為178 g/L，G組最高產量為98 g/L，相較于G組，F組L-谷氨酸產量提高了44.9%，升高幅度為80；F組L-谷氨酸終產量為170 g/L，G組L-谷氨酸終產量為92.8 g/L，相較于G組，F組L-谷氨酸終產量提高了45.4%，升高幅度為77.2。由圖2中d可知，單位時間內，谷氨酸產量越大，合成速率越高，F組的L-谷氨酸合成速率比G組整體要高，說明F組在發(fā)酵過程中更早進入產酸期，更早轉型，0～16 h合成速率快，因為發(fā)酵前期生物素和磷酸鹽比例合適，加上培養(yǎng)基成分豐富，營養(yǎng)高，菌體量迅速升高，細胞快速度過長菌型，進而更早進入產酸期，代謝方向會有所轉變，依靠管控脂肪酸生物合成，進一步調整細胞的滲透性，導致大量谷氨酸排入發(fā)酵液中，高磷酸鹽、高生物素菌體量迅速提升的同時，糖耗加快，進而提高了糖酸轉化率。

由表2可知，F組的糖酸轉化率為77%，遠大于G組，當生物素亞適量的情況下，使得菌體量進入到最優(yōu)狀況，菌體轉型快，有著優(yōu)秀的產酸表現，最終的糖酸轉化率表現較樂觀，菌體生物素與磷酸鹽不匹配時，菌體生長緩慢，競爭生物素能力不足，進而使得菌體無法轉型或者轉型慢，從而影響菌體產酸和糖酸轉化率。

3 結論

本研究在對磷酸鹽和生物素濃度配比進行調配時發(fā)現，當磷酸鹽濃度為3 g/L時，菌體量整體較低，最大菌體量較高磷酸鹽組降低了約47%；當生物素濃度為10 μg/L及以下時，細胞轉型慢，L-谷氨酸產量低，其最大產量較高，生物素濃度組降低了約31.6%；當磷酸鹽濃度為5 g/L、生物素濃度為14 μg/L時，對于菌體生長及生產性能的提高最大。在此條件下，最大OD600 nm達到了86，較對照組提高了14.8%，最終的菌體量為73，較對照組提高了15%，升高幅度為11，最終的L-谷氨酸產量為178 g/L，提高了44.9%，糖酸轉化率由40%提高至77%，因此，該磷酸鹽與生物素最適濃度配比在傳統谷氨酸發(fā)酵工業(yè)中，對提升菌體活力等有巨大價值，對于高效產酸等也有一定的參考價值。

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