秦 姣，姜洪雪，劉全生

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南果蔬綠色防控重點實驗室/廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.廣東省科學院動物研究所，廣東 廣州 510260）

【研究意義】近年來，國內(nèi)對不育劑治理害鼠開展了大量系統(tǒng)的研究和應用工作，一方面，不育技術可以有效地解決抗凝血殺鼠劑存在的防治效果持續(xù)時間短、抗藥性個體和種群增加以及誤傷非靶標動物等問題；另一方面，避免了因化學滅殺導致種群數(shù)量的急劇縮小，從而引起生態(tài)系統(tǒng)失衡［1-3］。已有許多研究證實炔雌醚（Quinestrol）、左炔諾孕酮和炔雌醚復合劑（EP-1）可有效控制多種野鼠的繁殖，其中，炔雌醚為甾體類雌激素，其活力是乙炔雌二醇的8～10 倍，不育活性很高。此外，炔雌醚口服后經(jīng)消化道吸收貯存于體內(nèi)脂肪，轉變?yōu)槿泊拼季徛尫?，藥效可持續(xù)1 個月以上，可以達到很好的長效避孕作用［4］。對布氏田鼠（Lasiopodomys brandtii）、長爪沙鼠（Meriones unguiculatus）、東方田鼠（Microtus fortis）和大倉鼠（Tscherskia triton）等鼠的不育效果顯著［5-13］。然而炔雌醚難溶于水，滲透力較差，鼠類對浸泡法和粘附法制作的炔雌醚藥餌攝食量較低［11-14］。因此，保證不育劑的控制效果、提高不育藥物的利用率、節(jié)約害鼠防控成本以及降低生態(tài)風險成為亟待解決的問題?！厩叭搜芯窟M展】國內(nèi)學者通過混合不育劑與餌料粉劑制成顆粒餌料來提高炔雌醚的適口性［15］，或通過物理作用完成2-羥丙基-β-環(huán)糊精對藥物的包合作用來提高其水溶性［16］。但在溫熱潮濕的南方地區(qū)，鼠類多以稻谷作餌料。因稻殼的阻滯和吸附，鼠藥很難滲入米粒，導致鼠類攝入的藥物有效濃度較低［17］，嚴重限制了藥效的發(fā)揮。

【本研究切入點】針對炔雌醚難溶于水、適口性較差、稻谷藥餌利用率低等問題，研究添加農(nóng)藥助劑或（和）改變藥餌配制方法等手段［18］，以提高稻谷藥餌的利用率。N,N-二甲基甲酰胺（N,N-Dimethylformamide，DMF）是一種用途極廣的優(yōu)良溶劑，能溶解多種有機化合物和無機化合物，可吸附各種氣體，在農(nóng)藥領域中常用于合成高效低毒農(nóng)藥殺蟲劑［19］?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過優(yōu)化使用DMF 溶解炔雌醚的方法，以提高炔雌醚對餌料的滲透性并改善其對鼠類的適口性。測定DMF 溶解炔雌醚后配制的藥餌對實驗鼠的適口性和不育效果，并比較分析不同配制方法對炔雌醚在谷殼和糙米中的分布影響，為害鼠不育劑的減量增效提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物：供試昆明小白鼠購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。

主要試劑：炔雌醚（購自北京市紫竹天工科技有限公司，純度＞99%），炔雌醚標準品（供含量測定用，按C25H32O2計，含量為98.6%），甲醇和無水乙醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

儀器設備：Agilent 1260 高效液相色譜儀，可變波長紫外檢測器，色譜柱：Agilent C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2 試驗方法

試驗于2019 年6 月至2020 年3 月在廣東省科學院動物研究所進行。

1.2.1稻谷藥餌和空白餌料的配制 將20 mL Tween-80 加入1 000 mL 純凈水中混勻后，再加入1.5 g 炔雌醚，磁力攪拌至完全溶解。稱取新鮮稻谷3 kg，加入配制好的炔雌醚溶液1 000 mL，攪拌均勻，浸泡10 h 后晾干，制得0.05%炔雌醚藥餌；秤取炔雌醚1.5 g，加入DMF100 mL，攪拌至完全溶解；將20 mL Tween-80 加入1 000 mL純凈水中混勻；將含有炔雌醚的DMF 溶液倒入Tween-80+水的溶液中，攪拌混勻，配制成炔雌醚母液，配制0.05%DMF-炔雌醚藥餌（方法同上）；將20 mL Tween-80 加入1 000 mL 純凈水中攪拌混勻，再加入3 kg 新鮮稻谷，攪拌均勻，晾干，制得空白餌料。

1.2.2小鼠對不同餌料取食量的測定 選擇成年（4 月齡）、健康、非孕、無外傷的雄、雌小鼠各24 只，分別單籠飼養(yǎng)于不透明的塑料鼠籠中（30 cm×15 cm×20 cm），自由取食［標準鼠飼料，廣東省醫(yī)學實驗動物中心生產(chǎn)，SCXK（粵）2013-0002］和飲水，室溫保持在25（±2）℃，飼養(yǎng)房光照保持12L ∶12D(8：00 —20：00)。雄、雌鼠隨機分為3 組［空白餌料處理，C；炔雌醚藥餌處理，T1；DMF-炔雌醚藥餌（簡稱DMF-炔）處理，T2］，每組8 對，體重差異不顯著（雄鼠：35～44 g；雌鼠：29～37g）。先以純稻谷飼養(yǎng)1 周，此后每天給C、T1 和T2 組的每只鼠分別投放20 g空白餌料、炔雌醚藥餌和DMF-炔藥餌，每隔3 d稱體重，收取剩余餌料烘干稱重（3 d 累計攝食量計為1 次）（±0.1 g），更換新餌。攝食實驗持續(xù)9 d 后，清除藥餌，改用正常飼料飼養(yǎng)。

1.2.3不同餌料對小鼠繁殖力的影響 不同餌料飼喂小鼠試驗結束后，分別將3 個處理組的每對雄、雌鼠合籠，合籠期間正常飼料喂養(yǎng)。合籠7d后將雄鼠斷頸處死，取睪丸和腎臟稱重。記錄每組雌鼠懷孕及產(chǎn)仔情況。

1.2.4谷餌中炔雌醚含量測定 采用高效液相色譜法，流動相：甲醇-水（90∶10）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：279 nm；進樣量：20 μL；柱溫：30℃。秤取炔雌醚標準品，用甲醇溶液配制成濃度為10、20、30、40、50、60 μg/mL 的炔雌醚標準工作液。分別吸取20 μL 不同濃度的炔雌醚標準工作液進樣分析，以對照品進樣量為橫坐標X、色譜峰面積為縱坐標Y繪制標準曲線，得到回歸方程：Y=5.612X-3.02（R2=0.9999）。稱取10 g炔雌醚藥餌、DMF-炔藥餌各3份，分離藥餌（稻谷）為糙米和稻殼，糙米用粉碎機研磨粉碎。甲醇溶液反復多次溶解，過微孔濾膜，上機進行測定（回收率＞90%）。分別計算炔雌醚藥餌和DMF-炔藥餌糙米和稻殼中炔雌醚含量。

1.3 統(tǒng)計分析

文中數(shù)據(jù)以平均值±標準誤（Mean ± SE）表示，檢驗正態(tài)性和齊次性。以One-way ANOVA檢驗鼠對不同餌料的攝食量以及不同處理組鼠體重和內(nèi)臟器官鮮重的差異。以配對樣本T檢驗比較不用藥餌中炔雌醚濃度差異；采用Least Significant Difference test（LSD）檢驗組間差異。雌鼠產(chǎn)仔率和存活子代個體數(shù)差異用卡方檢驗（Chi-Square Test）。數(shù)據(jù)采用 SPSS 18.0 軟件統(tǒng)計分析，P＜ 0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 DMF 對小鼠攝食的影響

由圖1 可知，3 組雄、雌性小鼠對不同餌料的攝食量差異顯著（P＜0.05），T1 和T2 組雄性小鼠對餌料的取食量均低于C 組，且雄性小鼠第6 d 對炔雌醚藥餌的攝食量為DMF-炔藥餌攝食量的1.2 倍（P=0.047）。T1 和T2 組雌性小鼠對餌料的取食量均低于C 組，且雌性小鼠對炔雌醚藥餌的攝食量與對DMF-炔藥餌的攝食量差異不顯著，表明餌料中添加DMF 并不影響雌鼠的取食量。

圖1 小鼠對不同餌料的攝食量比較Fig.1 Comparison of food consumption of different baits of mice

2.2 DMF 對小鼠體重和內(nèi)臟器官的影響

2.2.13 種餌料對小鼠體重的影響 3 組雄、雌性小鼠取食不同餌料后體重差異均顯著（P＜0.05）（圖2）。T1和T2 組雄性和雌性小鼠體重均顯著低于C 組（P＜0.05），但雄、雌性小鼠取食炔雌醚藥餌后的體重與取食DMF-炔藥餌后的體重差異不顯著。表明在炔雌醚藥餌中添加DMF 并不影響雄、雌鼠的體重。

圖2 不同處理組小鼠體重比較Fig.2 Comparison of body weight of mice in different treatment groups

2.2.23 種餌料對雄鼠內(nèi)臟器官的影響 3 組不同餌料飼喂的雄性小鼠處死后，取睪丸和腎臟稱重，結果如圖3 所示，T2組雄性小鼠睪丸鮮重顯著低于T 1組和C 組（P＜0.05）；T1 組和T2組鼠腎臟器官鮮重分別比C 組顯著低16.4%和19.7%(P＜0.05)。

圖3 不同處理組雄性小鼠內(nèi)臟器官鮮質(zhì)量比較Fig.3 Comparison of wet weight of visceral organs from male mice in different treatment groups

2.3 DMF 對炔雌醚不育效果的影響

試驗期間C、T1、T2 組雌鼠繁殖后代情況如表1 所示，結果表明，炔雌醚對雌性小鼠的繁殖有明顯的抑制作用，T1組和T2 組產(chǎn)仔率降低至37.5%和25.0%。T1 組和T2 組的產(chǎn)仔數(shù)僅為C組的35.0%和11.1%。各組子代小鼠的存活數(shù)差異顯著（χ2=8.12，P=0.017）。

表1 不同處理組雌性小鼠繁殖能力比較Table 1 Comparison of breeding performance of female mice in different treatment groups

2.4 DMF 增加炔雌醚滲透的作用

10 g 炔雌醚藥餌和DMF-炔藥餌樣品中炔雌醚含量如表2 所示，結果顯示炔雌醚藥餌中稻殼含藥量占總藥量的91.7%，糙米含藥量占總藥量的8.3%；DMF-炔藥餌稻殼含藥量占總藥量的87.2%，糙米含藥量占總藥量的12.8%。DMF-炔藥餌糙米中炔雌醚的含量為炔雌醚藥餌糙米中的1.5 倍（t=-2.121，df=2，P=0.101），DMF-炔藥餌稻殼中炔雌醚的含量顯著低于炔雌醚藥餌稻殼中炔雌醚的含量（t=3.674，df=2，P=0.021）。

表2 兩種藥餌在糙米和稻殼中的炔雌醚含量Table 2 Content of quinestrol in brown rice and rice husk in two kinds of bait

3 討論

炔雌醚在控制害鼠繁殖方面的效果顯著，但其水溶性較低且適口性較差，本研究利用添加DMF 的方法對炔雌醚藥餌進行優(yōu)化配制。結果表明，雄、雌鼠對炔雌醚藥餌（包括DMF-炔藥餌組）和空白餌料的攝食量存在顯著差異，前者的取食量明顯低于后者。有研究表明，炔雌醚會降低鼠類對餌料的食欲，例如高原鼠兔（Ochotona curzoniae）和黑緣齒鼠（Rattus andamanensis）對炔雌醚藥餌的攝入量均顯著下降［11,15］。部分鼠類對炔雌醚藥餌的取食量存在性別差異。雄、雌鼠對炔雌醚藥餌攝食量的變化趨勢不同。如黃毛鼠連續(xù)取食炔雌醚餌料3～4 d 后，雄鼠取食量顯著降低［14］，而雌鼠取食炔雌醚藥餌與空白餌料之間并不存在差異。本研究中雄、雌鼠對含炔雌醚藥物的餌料取食趨勢一致，均低于空白餌料組。推測這種性別差異可能與不同物種/個體間嗅覺和味覺等生理特征差異有關［20］，其內(nèi)在機制仍需要進一步深入探究。

炔雌醚藥餌組和DMF-炔藥餌組的雄、雌鼠體重顯著低于空白餌料組，可能由這兩組鼠攝食量減少導致。炔雌醚對雌鼠有明顯的繁殖抑制作用，與空白餌料組相比，用藥組小鼠產(chǎn)仔數(shù)和存活數(shù)顯著降低，且DMF-炔藥餌對雌鼠繁殖抑制作用更為明顯，飼喂后的雌鼠繁殖率降低至25%，且產(chǎn)仔數(shù)僅為對照組的11%、炔雌醚藥餌組的32%。炔雌醚對雄鼠的睪丸和腎臟鮮重也有明顯影響，特別是DMF-炔藥餌組雄鼠睪丸明顯萎縮。已有研究表明，除了抑制雌性生殖進程外，炔雌醚還能干擾雄性的生殖功能［4，20］；可引起雄性睪丸、附睪和精囊腺萎縮，并導致精原細胞、精子細胞以及睪丸間質(zhì)細胞凋亡［21-24］。繁殖器官的萎縮也伴隨著LH、T 等激素水平下降，精子數(shù)量和質(zhì)量降低，以及生育率下降［21，23］。此外，炔雌醚還可以降低雄鼠腎臟鮮重，這與王宇杰等［25］使用劑量為5.0 mg/kg 的炔雌醚對雄性小鼠灌胃，小鼠腎臟系數(shù)顯著低于對照組的結果一致，炔雌醚對腎臟的影響可能與腎臟參與雌激素代謝有關，其功能受損或逐漸衰退，炔雌醚對腎臟的影響機制尚待研究。

添加DMF 能顯著提高炔雌醚在糙米中的含量，達到傳統(tǒng)配制（炔雌醚藥餌組）中含量的1.5倍；此外，本研究還對不同配制方案下炔雌醚藥餌中稻殼和糙米的含藥量占比進行了測算，結果顯示炔雌醚藥餌中谷殼藥物濃度為糙米的10 倍，鼠類取食的炔雌醚藥餌藥物濃度僅為配制濃度（0.5 mg/g）的8.3%。通過添加DMF 助劑，藥物濃度可提高至配制濃度（0.5 mg/g）的12.8%，該結果為準確估算鼠類實際攝入量提供了測算依據(jù)，并為制定更為科學精準的濃度提供了參考。

4 結論

本研究結果表明，選用DMF 作為助溶劑，不僅可以快速有效地溶解炔雌醚，而且增加鼠類取食部分（糙米）的藥物濃度至傳統(tǒng)配制的1.5 倍。同時，增強了炔雌醚對于雄、雌鼠的不育效果，使雌鼠繁殖率降低至對照組的25%，且繁殖個體數(shù)顯著減少，產(chǎn)仔數(shù)僅為對照組的11.1%。因此，DMF 作為助劑對炔雌醚藥餌有顯著的增效作用，可用于開發(fā)具有良好應用前景的不育劑配方，實現(xiàn)對農(nóng)田鼠害的經(jīng)濟、有效和可持續(xù)綜合管理。