李六水，成華，劉憲軍

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院 臨床藥學(xué)中心，北京 101149

腦梗死又稱缺血性卒中，是指腦血管堵塞或嚴(yán)重狹窄，使腦組織血流灌注降低，進(jìn)而缺血、缺氧，導(dǎo)致腦血管供血區(qū)腦組織死亡的一類腦血管疾病，具有高發(fā)病率、高致死率、高致殘率等特點(diǎn)，給患者、家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)[1]。阿司匹林既是腦梗死急性期抗小板治療的重要藥物，又是腦梗死二級(jí)預(yù)防的首選藥物[2]。在臨床實(shí)踐中觀察到，部分患者在服用阿司匹林期間仍會(huì)發(fā)生腦血管事件，部分學(xué)者使用“阿司匹林抵抗”這一術(shù)語(yǔ)來(lái)描述或定義這一現(xiàn)象。阿司匹林抵抗顯著增加了腦梗死復(fù)發(fā)和其他腦血管事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[3]，但阿司匹林抵抗發(fā)生的機(jī)制目前尚不清楚。研究表明，基因多態(tài)性是導(dǎo)致阿司匹林抵抗的重要因素[4]。GPⅢa PLA2、PEAR1、PTGS1等基因多態(tài)性對(duì)阿司匹林抗血小板作用正常發(fā)揮具有重要影響[5]。本研究對(duì)GPⅢa PLA2、PEAR1、PTGS1基因中與阿司匹林抵抗密切相關(guān)的3 個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNPs）在漢族腦梗死患者中的分布特征進(jìn)行調(diào)查研究，以期為深入探討這些SNPs 對(duì)阿司匹林藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)、不良反應(yīng)和阿司匹林抵抗的具體機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般臨床資料

選擇2016 年1 月—2022 年12 月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院收治的475 例腦梗死患者，其中男性352 例，女性123 例；年齡33～100 歲，平均（68.13±11.65）歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；（2）漢族；（3）已完成GPⅢa PLA2(rs5918)、PEAR1(rs12041331)和PTGS1(rs10306114) 3 個(gè)SNPs 檢測(cè)；（4）病歷資料完整。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）不符合腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)，或疑似腦梗死但未確診；（2）非漢族；（3）未完成GPⅢa PLA2(rs5918)、PEAR1(rs12041331) 和PTGS1(rs10306114) 3 個(gè)SNPs 檢測(cè)，或僅完成其中的1～2 個(gè)SNPs 檢測(cè)；（4）病歷資料不完整。

1.2 SNPs 測(cè)定

SNPs 采用熒光染色原位雜交的方法進(jìn)行測(cè)定。先用一次性真空抗凝采血管（EDTA 抗凝，紫帽管）采集患者外周靜脈血標(biāo)本2～3 mL，輕搖采血管，充分混勻，使血樣與抗凝劑充分混勻；取150 μL 血樣，加入1 mL 紅細(xì)胞裂解液，充分混勻，靜置10 min；3 000 r/min 離心10 min，棄上清；加入50 μL 核酸純化試劑（北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司），充分混勻；分別取1.5 μL 混懸液至對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的測(cè)序反應(yīng)通用試劑管（北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司）中，充分混勻，置于TL988A雙通道實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀（西安天隆科技有限公司）中的相應(yīng)位置，打開(kāi)計(jì)算機(jī)Microseq微測(cè)序程序，設(shè)定參數(shù)，檢測(cè)GPⅢa PLA2(rs5918)、PEAR1(rs12041331)和PTGS1(rs10306114) 3 個(gè)位點(diǎn)SNPs。

1.3 樣本的群體代表性檢驗(yàn)

運(yùn)用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)樣本的群體代表性[7]。對(duì)所選取的腦梗死患者人群的PEAR1(rs12041331)位點(diǎn)的基因型分布進(jìn)行遺傳平衡檢驗(yàn)，以判斷該樣本群體對(duì)漢族腦梗死患者群體是否具有良好的代表性。

1.4 基因型頻率的計(jì)算

分別根據(jù)GP Ⅲa PLA2(rs5918)、PEAR1(rs12041331)和PTGS1(rs10306114) 3 個(gè)位點(diǎn)SNPs的檢測(cè)結(jié)果，將所選取的漢族腦梗死患者個(gè)體歸屬為野生型純合子、突變型雜合子或突變型純合子。某基因型頻率＝該基因型個(gè)體的數(shù)量/樣本總數(shù)，如PEAR1(rs12041331)位點(diǎn)上，野生型純合子基因型頻率的計(jì)算方法為：野生型純合子個(gè)體的數(shù)量/樣本總數(shù)，突變型雜合子、突變型純合子基因型頻率的計(jì)算方法與之類似；GPⅢa PLA2(rs5918)和PTGS1(rs10306114) 2 個(gè)位點(diǎn)上野生型純合子、突變型雜合子和突變型純合子基因型頻率的計(jì)算方法與PEAR1(rs12041331)位點(diǎn)也相同。

1.5 等位基因頻率的計(jì)算

依照Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律[7]，若某個(gè)基因位點(diǎn)上只存在等位基因A、B，則A 等位基因頻率P（A）＝（AA 型純合子基因型樣本數(shù)×2＋AB 型雜合子基因型樣本數(shù)×1）/（樣本總數(shù)×2）；B 等位基因頻率P（B）＝（BB 型純合子基因型樣本數(shù)×2＋AB 型雜合子基因型樣本數(shù)×1）/（樣本總數(shù)×2），或P（B）＝100%－P（A）。

將本研究中漢族腦梗死患者樣本中GPⅢa PLA2(rs5918)、PEAR1(rs12041331) 和PTGS1(rs10306114) 3 個(gè)位點(diǎn)上所存在的等位基因頻率與PharmGKB Aggregated、1000 Genomes（https://www.pharmgkb.org/）等數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的其他人群中相應(yīng)等位基因頻率進(jìn)行比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0 軟件對(duì)本研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（百分?jǐn)?shù)）表示，不同人群之間基因型頻率和等位基因頻率分布的差異性比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確概率法。

2 結(jié)果

2.1 樣本的群體代表性檢驗(yàn)結(jié)果

本研究中GP Ⅲa PLA2(rs5918)和PTGS1(rs10306114) 2 個(gè)基因位點(diǎn)上均出現(xiàn)了基因型的實(shí)際頻數(shù)為0 的情況，故根據(jù)PEAR1(rs12041331)位點(diǎn)基因型的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)。對(duì)本研究中475 例漢族腦梗死患者PEAR1(rs12041331)位點(diǎn)基因型的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)，該位點(diǎn)中3 種基因型，即GG、AG 和AA 分布的實(shí)際頻數(shù)與理論頻數(shù)基本一致（χ2＝0.53，P＝0.77＞0.05），說(shuō)明該樣本對(duì)漢族腦梗死患者人群具有良好的代表性，見(jiàn)表1。

表1 PEAR1 (rs12041331)位點(diǎn)基因型的遺傳平衡檢驗(yàn)Table 1 Genetic balance test of genotype at PEAR1(rs12041331) locus

2.2 各基因型的計(jì)數(shù)和頻率

本研究中GP Ⅲa PLA2(rs5918)、PEAR1(rs12041331)和PTGS1(rs10306114) 3 個(gè)位點(diǎn)上基因型的計(jì)數(shù)與頻率見(jiàn)表2。其中GPⅢa PLA2(rs5918)位點(diǎn)上野生型純合子（TT）占近99%，突變型雜合子（TC）所占的比例很低，未檢測(cè)到突變型純合子（CC）；PEAR1(rs12041331)位點(diǎn)上基因型變異程度較大，其中野生型純合子（GG）和突變型雜合子（GA）所占比例均超過(guò)40%，而突變型純合子（AA）較少；PTGS1(rs10306114)位點(diǎn)上全部為野生型純合子（AA），未見(jiàn)突變型雜合子（AG）、突變型純合子（GG）。

表2 檢測(cè)位點(diǎn)的基因型計(jì)數(shù)和頻率Table 2 Genotype count and frequency of gene locus

2.3 各位點(diǎn)上的等位基因頻率

本研究中GP Ⅲa PLA2(rs5918)、PEAR1(rs12041331)和PTGS1(rs10306114) 3 個(gè)位點(diǎn)上的各等位基因頻率見(jiàn)表3。其中GPⅢa PLA2(rs5918)位點(diǎn)上，T 等位基因頻率超過(guò)99%，C 等位基因頻率不足1%；PEAR1(rs12041331)位點(diǎn)上，G、A 等位基因分別占64%、36%；PTGS1(rs10306114)位點(diǎn)上全部為A 等位基因，未見(jiàn)G 等位基因。

表3 各位點(diǎn)上的等位基因頻率Table 3 Allele frequency of gene locus

2.4 其他人群中相關(guān)等位基因頻率

將所調(diào)查的其他人群中GPⅢa PLA2(rs5918)、PEAR1(rs12041331)和PTGS1(rs10306114) 3 個(gè)位點(diǎn)上的等位基因的分布情況進(jìn)行匯總，見(jiàn)表4。T 等位基因在GPⅢa PLA2(rs5918)位點(diǎn)上的頻率在不同人群中均較高，其中在西雙版納傣族人群中為100%，在北京漢族和越南京族人群中也接近100%，在孟加拉、英格蘭和蘇格蘭、哥倫比亞麥德林以及巴巴多斯加勒比人群中均超過(guò)86%；所調(diào)查人群中A 等位基因在PTGS1(rs10306114)位點(diǎn)上的頻率也較高，其中北京漢族、西雙版納傣族和越南京族人群中均為100%，在孟加拉、英格蘭和蘇格蘭以及哥倫比亞麥德林人群中均超過(guò)90%；G 等位基因在PEAR1(rs12041331)位點(diǎn)上的頻率在不同人群中分布的差異性較大，如在越南京族人群中為44%，而在英格蘭和蘇格蘭人群中接近94%。

表4 其他人群中相關(guān)等位基因頻率Table 4 Frequency of related alleles in other populations

2.5 相關(guān)等位基因的分布差異性

本研究中，GP Ⅲa PLA2(rs5918)、PEAR1(rs12041331)和PTGS1(rs10306114) 3 個(gè)位點(diǎn)上各等位基因在漢族腦梗死患者人群中的分布情況與所調(diào)查的其他人群進(jìn)行差異性比較見(jiàn)表5。GPⅢa PLA2(rs5918)位點(diǎn)上，漢族腦梗死患者人群中T 等位基因頻率（99.37%）與北京漢族、西雙版納傣族或越南京族人群相比，分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但都明顯高于孟加拉、英格蘭和蘇格蘭、哥倫比亞麥德林以及巴巴多斯加勒比人群（P＜0.01）；PEAR1(rs12041331)位點(diǎn)上，漢族腦梗死患者人群中G 等位基因頻率（64.21%）與北京漢族人群（60.19%）或孟加拉人群（63.37%）相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯著高于西雙版納傣族、越南京族和巴巴多斯加勒比人群（P＜0.01），又顯著低于英格蘭和蘇格蘭人群以及哥倫比亞麥德林人群（P＜0.01）；PTGS1(rs10306114)位點(diǎn)上，漢族腦梗死患者人群中未見(jiàn)等位基因G 分布，A 等位基因頻率為100%，等位基因分布與檢索到的北京漢族、西雙版納傣族或越南京族人群的情況相同，A 等位基因頻率都顯著高于孟加拉、英格蘭和蘇格蘭、哥倫比亞麥德林以及巴巴多斯加勒比人群（P＜0.01）。

表5 漢族腦梗死患者人群與其他人群相關(guān)等位基因的分布差異Table 5 Difference of allele frequencies between Chinese Han population with cerebral infarction and some other populations

3 討論

阿司匹林抵抗現(xiàn)象的發(fā)生會(huì)對(duì)其抗血小板臨床療效產(chǎn)生嚴(yán)重影響，如Krasopoulos 等[8]進(jìn)行了1項(xiàng)Meta 分析，共納入20 項(xiàng)研究，2 930 例心血管疾病（部分合并腦梗死等腦血管疾?。┗颊?，其中810 例患者（28%）存在阿司匹林抵抗，發(fā)現(xiàn)存在阿司匹林抵抗的患者發(fā)生心腦血管事件的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高；Guo 等[9]也發(fā)現(xiàn)，存在阿司匹林抵抗的急性腦梗死患者發(fā)生腦梗死復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)較不存在阿司匹林抵抗的患者更高。阿司匹林抵抗的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，目前其發(fā)生原因也尚未明確。近年來(lái)，基因多態(tài)性導(dǎo)致阿司匹林抵抗現(xiàn)象越來(lái)越引起相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者的廣泛關(guān)注，基因多態(tài)性也被證實(shí)為導(dǎo)致阿司匹林抵抗的重要原因[4,10-11]。大量研究表明，GPⅢa PLA2、PEAR1和PTGS1等基因多態(tài)性可能與阿司匹林抵抗的發(fā)生具有密切關(guān)系[12-14]。本研究選取475 例漢族腦梗死確診患者，經(jīng)Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)被證實(shí)為一個(gè)具有良好代表性的樣本群體，對(duì)該群體中GPⅢa PLA2、PEAR1和PTGS1基因上的3 個(gè)重要SNPs 的分布特征進(jìn)行系統(tǒng)研究。

血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（GPⅡb/Ⅲa）是位于血小板表面上的數(shù)量最多的一種受體，可與纖維蛋白原和血管性血友病因子結(jié)合[15]。GPⅡb/Ⅲa 與纖維蛋白原結(jié)合是血小板聚集及血栓形成的最終共同途徑[16]。編碼GPⅢa亞基的基因主要存在PLA1、PLA2兩種等位基因亞型，已被證實(shí)在人群中普遍存在[17]。目前GPⅢa基因在冠心病人群中研究較多，在腦梗死人群中研究卻較少[18]。有證據(jù)表明，PLA2等位基因可能與急性血栓形成或腦卒中發(fā)生有關(guān)[17]。本研究調(diào)查的漢族腦梗死人群中，GPⅢa PLA2(rs5918)位點(diǎn)上野生型純合子（TT 型）占98.74%，突變型雜合子（TC 型）占1.26%，無(wú)突變型純合子（CC 型）。李達(dá)偉[18]報(bào)道76 例腦梗死患者（未限定為漢族）中，TT 型占74 例（97.37%），TC 型占2 例（2.63%），也無(wú)CC 型，與之相比，本研究GPⅢa PLA2(rs5918)位點(diǎn)上基因型的分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究中，該位點(diǎn)上的等位基因頻率（T＝99.37%，C＝0.63%）也與李達(dá)偉[18]報(bào)道（T＝150/152＝98.68%，C＝2/152＝1.32%）類似。此外，GPⅢa PLA2(rs5918)位點(diǎn)上等位基因頻率與北京漢族、西雙版納傣族或越南京族人群相比也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，由于本研究中研究對(duì)象為腦梗死患者人群，而后3 類人群為一般人群，故提示GPⅢa PLA2基因多態(tài)性盡管可能與阿司匹林抵抗的發(fā)生有關(guān)，但與腦梗死疾病本身的發(fā)生可能并無(wú)關(guān)聯(lián)。

血小板內(nèi)皮聚集受體-1（PEAR1）是一種含有表皮生長(zhǎng)因子重復(fù)序列的跨膜受體，已被證實(shí)參與血小板接觸誘導(dǎo)的活化[19]。PEAR1基因多態(tài)性可影響血小板功能和血小板聚集過(guò)程而成為心血管疾病的危險(xiǎn)因素[20]；陳靜靜等[21]研究表明，PEAR1(rs12041331)位點(diǎn)多態(tài)性是阿司匹林抵抗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，該位點(diǎn)中等位基因A 與腦梗死患者發(fā)生阿司匹林抵抗有關(guān)。郭宏偉等[22]報(bào)道的150 例初發(fā)腦梗死患者中，PEAR1(rs12041331)位點(diǎn)AA 型59 例（39.33%），GA 型38 例（25.33%），GG 型53 例（35.33%），與本研究中該位點(diǎn)上基因型的分布存在顯著差異（χ2＝48.12，P＜0.01），可能與其研究對(duì)象并非全部為漢族患者有關(guān)，也可能與樣本量大小有關(guān)，還可能是由于其研究對(duì)象為初發(fā)腦梗死，而本研究中未對(duì)初發(fā)腦梗死或復(fù)發(fā)腦梗死患者進(jìn)行限定。本研究中漢族腦梗死患者人群中PEAR1(rs12041331)位點(diǎn)的基因型分布與西雙版納傣族、越南京族、英格蘭和蘇格蘭以及哥倫比亞麥德林人群存在顯著差異，但與北京漢族人群無(wú)差異，也可能是由于該位點(diǎn)基因多態(tài)性盡管可能與阿司匹林抵抗有關(guān)，但與腦梗死的發(fā)生無(wú)關(guān)。

阿司匹林抗血小板藥理作用的靶點(diǎn)COX-1 受其編碼基因PTGS1（前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合成酶1，也稱為環(huán)氧合酶或COX-1）影響[23]，故阿司匹林抵抗發(fā)生也與PTGS1基因多態(tài)性有關(guān)，許海寧等[24]研究發(fā)現(xiàn)，PTGS1基因多態(tài)性是急性腦梗死患者發(fā)生阿司匹林抵抗的危險(xiǎn)因素之一。本研究中漢族腦梗死患者人群中PTGS1(rs10306114)位點(diǎn)上全部（100%）為AA 型，未見(jiàn)等位基因G，該位點(diǎn)上等位基因頻率與數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的與北京漢族、西雙版納傣族或越南京族人群相同，后3 類人群該位點(diǎn)上也全部（100%）為等位基因A；而Cao 等[25]報(bào)道的858 例腦梗死患者中，PTGS1(rs10306114)位點(diǎn)上AA 型共856 例（99.77%），AG 型僅2 例（0.23%），與本研究相比，該位點(diǎn)上的基因型分布也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但其報(bào)道中出現(xiàn)了AG 型，可能與其樣本量更大也有關(guān)，也可能為其納入的腦梗死患者并非全部為漢族患者。

總之，本研究對(duì)漢族腦梗死患者中阿司匹林抵抗相關(guān)基因上3 個(gè)重要SNPs 的分布特征進(jìn)行了調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)GPⅢa PLA2(rs5918)位點(diǎn)上以野生型純合子為主，占近99%，PTGS1(rs10306114)位點(diǎn)上全部為野生型純合子，未見(jiàn)突變，而PEAR1(rs12041331)位點(diǎn)上突變常見(jiàn)，野生型純合子（GG型）僅占40%左右。部分研究結(jié)果與既往報(bào)道結(jié)果相同，也有部分研究結(jié)果與既往報(bào)道或相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的其他人群有所差異。建議腦梗死患者使用阿司匹林時(shí)進(jìn)行相關(guān)基因位點(diǎn)檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果精準(zhǔn)用藥。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突