劉曉麗，柴文君，孫 磊，閆明霞，潘洪玉，孫躍喜

1.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032；

2.同濟大學附屬同濟醫(yī)院急診醫(yī)學科，上海 200065

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。2018年，全球癌癥統(tǒng)計報告估計有209萬肺癌新發(fā)病例和176萬肺癌死亡病例［1］。肺癌分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌占全部肺癌的80% ～ 90%，包括肺鱗癌和肺腺癌，其中肺腺癌為最常見的病理學類型。雖然目前關(guān)于肺腺癌的治療已取得較大進步，但是由于肺腺癌患者的個體差異性、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變及對化療藥物的耐藥性，導致其死亡率仍較高，因此急需發(fā)掘腫瘤特異性新抗原，從而為肺腺癌治療提供新靶點。

可變剪接也稱為選擇性剪接，可使前體mRNA產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體，導致不同的蛋白產(chǎn)物形成，從而形成新的細胞表位。作為基因調(diào)控較為普遍的機制之一，可變剪接在細胞增殖、生長、凋亡及分化中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，參與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程［2］。在胰腺癌［3-4］、卵巢癌［5-6］、乳腺癌［7-8］、黑色素瘤［9-10］和膠質(zhì)母細胞瘤［11-12］等多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了大量高信度的可變剪接事件，剪接調(diào)控因子在過表達或敲減后，能夠引起可變剪接的發(fā)生，從而導致細胞致瘤特性的改變。KH型剪接調(diào)控蛋白（KHtype splicing regulatory protein，KHSRP）在調(diào)節(jié)RNA剪切、RNA轉(zhuǎn)運、RNA編輯、mRNA穩(wěn)定及降解等過程中均具有重要作用，從而調(diào)控細胞增殖、分化、生長、凋亡及腫瘤形成等多種生物學過程［13］。目前，KHSRP與異質(zhì)性核糖核蛋白C（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C，HNRNPC）相互作用后如何調(diào)控下游靶分子，從而影響Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子（Janus kinase-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT）信號通路變化的具體機制尚未闡明。考慮到KHSRP對可變剪接的可能調(diào)控作用，本研究旨在研究KHSRP對下游差異可變剪接基因的調(diào)控，以確定KHSRP是否通過調(diào)控下游基因可變剪接促進肺腺癌進展。

1 材料和方法

1.1 細胞總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

研究中使用的所有細胞樣本的總RNA均采用TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）提取，然后使用PrimeScript RT試劑（日本TaKaRa公司）進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.2 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）

以cDNA為模板，設計ADD3、LIMCH1及NUMB引物，采用PrimeScript RT試劑進行PCR，15 μL PCR反應體系如下：3 μL 5×PrimeSTAR、1.2 μL脫氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）、10 μmol/L正向引物和反向引物各0.6 μL，使用稀釋10倍的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.5 μL作為模板，將0.15 μL DNA聚合酶用ddH2O補至15 μL。按照以下程序進行PCR：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，退火5 ～ 15 s（退火溫度≥55 ℃，5 s；退火溫度＜55 ℃，15 s），72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。所使用的基因引物序列如下：ADD3正向引物序列為GCTCCTCCTAACCCATTT，反向引物序列為CATATCATCCTTGCCATTTA；LIMCH1正向引物序列為AACCAGTACCTCCCGAACA，反向引物序列為CCAACGAGCCAGGTCATC；NUMB正向引物序列為CTCCGATGACCAAACCAG，反向引物序列為GGACGCTCTTAGACACCTC。引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 DNA非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

配制8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，10 mL凝膠液配方如下：5.224 mL H2O，2.666 mL 30%丙烯酰胺（北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司），2 mL 5×TBE（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），100 μL 10% APS（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），10 μL TEMED（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。以1×TBE作為緩沖液，120 V電泳30 min左右，電泳完成后，將凝膠浸泡于3×核酸染料［天根生化科技（北京）有限公司］中，30 min后用凝膠成像儀拍照。

1.4 數(shù)據(jù)庫分析

可變剪接差異靶基因在肺腺癌組織中的轉(zhuǎn)錄組表達水平采用腫瘤免疫評估資源（Tumor IMmune Estimation Resource，TIMER）數(shù)據(jù)庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）和阿拉巴馬大學伯明翰分校癌癥數(shù)據(jù)分析門戶（the University of Alabama at Birmingham cancer data analysis portal，ULCAN）-癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）分析；采用肺腺癌Kaplan網(wǎng)站分析基因與肺腺癌患者預后的相關(guān)性；采用TIMER Gene（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）分析基因與肺腺癌中免疫細胞功能的相關(guān)性。

1.5 Transwell遷移和侵襲實驗

用于遷移和侵襲實驗的小室購自美國Corning公司。遷移實驗將空穿小室插入24孔板中，下室加入800 μL含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的細胞培養(yǎng)基作為化學引誘劑，上室加入0.5×105個重懸于200 μL無血清細胞培養(yǎng)基中的肺癌細胞。侵襲實驗將膠穿小室插入24孔板中，下室加入800 μL含有10% FBS的細胞培養(yǎng)基作為化學引誘劑，上室加入1×105個重懸于200 μL無血清細胞培養(yǎng)基中的肺癌細胞。遷移實驗的肺腺癌細胞培養(yǎng)16 h，侵襲實驗的肺腺癌細胞培養(yǎng)18 h，用棉簽擦去小室上室的細胞，用甲醇溶液固定從小室上室通過膜遷移到小室下室的細胞30 min，并使用結(jié)晶紫染色液染色細胞20 min，晾干后，對染色細胞進行拍照計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學處理

本研究中兩組數(shù)據(jù)之間的比較均采用GraphPad Prism 9軟件中的雙側(cè)Studentt檢驗，通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com/analysis/）分析基因與肺腺癌患者的預后相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 KHSRP調(diào)控的可變剪接事件及信號通路

分別提取A549細胞的KHSRP-siRNA（2條干擾片段）及對照載體的總RNA，采用RNA-Seq高通量測序和生物信息學分析，鑒定KHSRP敲除后發(fā)生的可變剪接事件。結(jié)果共鑒定出356個KHSRP調(diào)控的可變剪接事件［以偽發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05，P＜0.05作為判斷標準］，樣品中有外顯子跳躍、5’末端選擇性剪接、3’末端選擇性剪接等7種類型的可變剪接，其中，外顯子跳躍出現(xiàn)221個，占總數(shù)的62.08%。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)主要集中在腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、緊密連接、肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)等信號通路（圖1）。

圖1 KHSRP調(diào)控的下游可變剪接事件Fig.1 Downstream alternative splicing events regulated by KHSRP

2.2 KHSRP調(diào)控的差異剪接靶基因

為進一步驗證RNA-Seq測序結(jié)果的可靠性，因外顯子跳躍是最常見的可變剪接類型，本研究挑選了測序結(jié)果中KHSRP敲低后的前20個可變剪接靶基因，按照篩選條件（FDR＜0.05，P＜0.05）初步篩選到14個外顯子跳躍類型的可變剪接靶基因，進一步通過IGV軟件查詢外顯子的表達水平，排除肉眼可見的表達水平非常低的基因，從而縮小感興趣基因的范圍，通過以上方法，我們最終找到3個基因作為感興趣的KHSRP差異剪接靶基因。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription，RT）-PCR電泳證實在A549細胞中敲除KHSRP后，ADD3的17號外顯子和NUMB的13號外顯子表達顯著增加，并且Uniprot查詢外顯子序列發(fā)現(xiàn)，ADD3的17號外顯子和NUMB的13號外顯子均存在于基因的經(jīng)典轉(zhuǎn)錄本上，提示包含17號外顯子的經(jīng)典轉(zhuǎn)錄本ADD3 L-異構(gòu)體和包含13號外顯子的經(jīng)典轉(zhuǎn)錄本NUMBL-異構(gòu)體可能發(fā)揮抑癌作用；而LIMCH1的20號外顯子表達顯著下降，并且Uniprot查詢外顯子序列發(fā)現(xiàn)，LIMCH1的20號外顯子不在基因的經(jīng)典轉(zhuǎn)錄本，提示包含20號外顯子的LIMCH1 L-異構(gòu)體可能發(fā)揮促癌作用，而其不包含20號外顯子的經(jīng)典轉(zhuǎn)錄本LIMCH1S-異構(gòu)體可能發(fā)揮抑癌作用。由此推測ADD3、NUMB及LIMCH1可能為KHSRP調(diào)控的差異剪接靶基因，并且在肺腺癌中可能均發(fā)揮抑制肺腺癌進展的作用（圖2）。

圖2 KHSRP調(diào)控的下游可變剪接事件驗證Fig.2 Verification of downstream alternative splicing events regulated by KHSRP

2.3 差異剪接靶基因在肺腺癌腫瘤組織和細胞系中的表達水平

為進一步驗證這3個基因在肺腺癌中的表達情況，本研究利用TIMER和ULCAN兩個癌癥數(shù)據(jù)庫進行轉(zhuǎn)錄組表達分析，發(fā)現(xiàn)ADD3、LIMCH1和NUMB基因在肺腺癌腫瘤組織中均低表達（圖3A ～ 3C）。

通過查詢美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）發(fā)現(xiàn)，ADD3編碼2個可變剪接異構(gòu)體，LIMCH1編碼20個可變剪接異構(gòu)體，NUMB編碼4個可變剪接異構(gòu)體，本研究挑選編碼剪接異構(gòu)體最少的ADD3進行進一步的實驗驗證。首先，在20對肺癌臨床樣本cDNA中檢測了ADD3可變剪接異構(gòu)體的轉(zhuǎn)錄本表達情況，發(fā)現(xiàn)在20對肺癌樣本中，ADD3 L/S-異構(gòu)體在65%肺癌腫瘤組織中的表達高于配對癌旁組織，在10%肺癌腫瘤組織中的表達低于配對癌旁組織，在25%肺癌腫瘤組織中的表達與配對癌旁組織接近（圖3D）。另外，在8個肺腺癌細胞系中檢測ADD3可變剪接異構(gòu)體的表達，發(fā)現(xiàn)ADD3 L-異構(gòu)體在H1975、PC9、H292和H358細胞中的表達比S-異構(gòu)體高，而ADD3 L-異構(gòu)體在A549、H1299、H838和H1650細胞中的表達比S-異構(gòu)體少（圖3E），ADD3可變剪接異構(gòu)體在多種肺腺癌細胞系中的表達模式差異顯著。

2.4 差異剪接靶基因在肺腺癌腫瘤組織中低表達與患者預后不良有關(guān)

為進一步分析ADD3、LIMCH1及NUMB基因與肺腺癌患者的預后相關(guān)性，本研究利用肺腺癌生存分析數(shù)據(jù)庫Kaplan進行分析，發(fā)現(xiàn)ADD3、LIMCH1和NUMB基因在肺腺癌中低表達與肺腺癌患者預后不良有關(guān)，提示ADD3、LIMCH1及NUMB基因與肺腺癌惡性表型相關(guān)（圖4）。

圖4 差異剪接基因與肺腺癌預后相關(guān)性分析Fig.4 Analysis of the correlation between differential alternative genes and overall survival of lung cancer

2.5 差異剪接靶基因與肺腺癌中免疫細胞功能呈正相關(guān)

可變剪接和免疫細胞功能在癌癥中均發(fā)揮重要作用，因此，本研究將KHSRP可能的差異剪接靶基因與肺腺癌中免疫細胞的功能進行分析，發(fā)現(xiàn)ADD3、NUMB與B細胞、T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞及樹突狀細胞功能呈正相關(guān)，而LIMCH1與巨噬細胞功能呈正相關(guān)（圖5），提示ADD3、NUMB及LIMCH1可能作為肺腺癌特異性新抗原，在肺腺癌中可能通過調(diào)節(jié)免疫細胞功能，使免疫系統(tǒng)功能總體呈激活狀態(tài)，從而起到抑制肺腺癌進展的作用。

圖5 差異剪接基因與免疫細胞功能相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis between differential splicing genes and immune cell function

2.6 ADD3 L-異構(gòu)體抑制肺腺癌細胞系A549細胞遷移和侵襲潛能

為進一步驗證ADD3可變剪接異構(gòu)體在肺腺癌中的功能，針對ADD3 L-異構(gòu)體和S-異構(gòu)體分別設計了2條siRNA，在A549細胞中敲低L-異構(gòu)體和S-異構(gòu)體（圖6A），transwell實驗發(fā)現(xiàn)，敲低ADD3 L-異構(gòu)體可以促進肺腺癌細胞的體外遷移和侵襲潛能，而敲低ADD3 S-異構(gòu)體后A549細胞的體外侵襲和遷移潛能無顯著變化（圖6B），提示KHSRP可能通過下調(diào)ADD3基因L-異構(gòu)體剪接體的表達促進肺腺癌進展。

圖6 ADD3可變剪接異構(gòu)體在A549細胞中對遷移和侵襲潛能的影響Fig.6 The effect of ADD3 variable splicing isomers on migration and invasive potential in A549 cells

3 討 論

選擇性剪接的異常變化可能會影響腫瘤進展［14］，還可能破壞腫瘤進展中的蛋白質(zhì)相互作用途徑［15-16］。前期研究［17］發(fā)現(xiàn)，可變剪接調(diào)控蛋白KHSRP在肺癌中顯著促進肺癌細胞增殖、侵襲和遷移功能。KHSRP基因編碼一種多功能RNA結(jié)合蛋白，參與多種細胞生物學過程，包括轉(zhuǎn)錄、選擇性前信使核糖核酸剪接和信使核糖核酸定位［18］。我們推測KHSRP可能通過調(diào)控下游蛋白的可變剪接促進肺腺癌細胞增殖、侵襲及遷移潛能。因此，在肺腺癌細胞A549中敲低KHSRP后，按照篩選條件（FDR＜0.05，P＜0.05）進行初步篩選，通過IGV軟件查詢外顯子的表達水平，排除肉眼可見的表達水平非常低的基因，從而縮小感興趣基因的范圍，最終找到3種基因作為感興趣的KHSRP差異剪接靶基因。通過PCR電泳對測序結(jié)果進行實驗驗證，發(fā)現(xiàn)ADD3的17號外顯子及NUMB的13號外顯子表達顯著增加，LIMCH1的20號外顯子表達顯著下降，3個基因均發(fā)生顯著的外顯子跳躍現(xiàn)象，提示KHSRP可能通過調(diào)控ADD3、NUMB及LIMCH1的外顯子跳躍這一最常見的可變剪接類型進而影響肺癌進展。2013年Bechara等［19］發(fā)現(xiàn)NUMB在肺癌細胞中發(fā)生可變剪接，并被RNA結(jié)合蛋白RBM5/6/10調(diào)控；2021年Wang等［20］發(fā)現(xiàn)細胞骨架蛋白ADD3被RNA結(jié)合蛋白QKI-5調(diào)控從而影響肺癌進展，這兩項研究與本研究相呼應，進一步說明本研究的可變剪接測序結(jié)果是可靠的。本研究發(fā)現(xiàn)并證實ADD3、NUMB及LIMCH1在肺腺癌中作為KHSRP的可變剪接靶基因影響肺腺癌進展。

通過Uniprot網(wǎng)站查詢發(fā)生外顯子跳躍的序列，判斷包含跳躍外顯子的L-異構(gòu)體是否位于基因的經(jīng)典轉(zhuǎn)錄本上，發(fā)現(xiàn)ADD3的17號外顯子和NUMB的13號外顯子均存在于基因的經(jīng)典轉(zhuǎn)錄本上，提示包含17號外顯子的經(jīng)典轉(zhuǎn)錄本ADD3 L-異構(gòu)體和包含13號外顯子的經(jīng)典轉(zhuǎn)錄本NUMBL-異構(gòu)體可能發(fā)揮抑癌作用；而LIMCH1的20號外顯子則不在基因的經(jīng)典轉(zhuǎn)錄本上，提示不包含20號外LIMCH1 S-異構(gòu)體為經(jīng)典轉(zhuǎn)錄本，可能發(fā)揮抑癌作用。由此推測ADD3、NUMB及LIMCH1為KHSRP調(diào)控的差異剪接靶基因，并且在肺腺癌中可能均發(fā)揮抑制肺腺癌進展的作用。為驗證這一猜想，本研究分別通過TIMER-Diff EXP基因表達模塊和ULCAN-TCGA模塊分析了ADD3、NUMB及LIMCH1在肺腺癌中的表達情況，發(fā)現(xiàn)這3種基因在肺腺癌中均呈低表達狀態(tài)。另外，本研究進一步檢測了本實驗室收集的20對肺癌臨床樣本中ADD3的可變剪接異構(gòu)體的表達情況，ADD3 L/S-異構(gòu)體在65%肺癌腫瘤組織中的表達高于配對癌旁組織，在10%肺癌腫瘤組織中的表達低于配對癌旁組織，在25%肺癌腫瘤組織中的表達與配對癌旁組織接近，此結(jié)果與上述數(shù)據(jù)庫表達分析結(jié)果不一致，原因可能是本研究的臨床樣本量較少，需要擴大樣本量以進一步驗證。2019年Lechuga等［21］發(fā)現(xiàn)在肺癌細胞H1573中敲低ADD3可以促進肺癌細胞的遷移潛能；而2021年Wang等［20］發(fā)現(xiàn)ADD3可變剪接異構(gòu)體在肺癌細胞系A549和H520中促進細胞遷移和生長，兩項研究結(jié)果相反，原因可能是ADD3在不同細胞系中發(fā)揮的功能不同。因此本研究繼續(xù)檢測了ADD3可變剪接異構(gòu)體在不同肺腺癌細胞系中的表達情況，發(fā)現(xiàn)ADD3可變剪接異構(gòu)體在不同肺腺癌細胞中差異較大，這也許可以解釋ADD3在不同細胞系中對細胞遷移能力具有雙重影響的現(xiàn)象。本研究又通過肺腺癌Kaplan網(wǎng)站分析了這3種基因與肺腺癌預后的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)3種基因在肺腺癌中呈低表達，且低表達者預后不良，以上分析結(jié)果進一步證實了ADD3、NUMB及LIMCH1可能抑制肺腺癌進展的推測。

腫瘤細胞可以修飾其表面抗原，從而改變腫瘤組織的微環(huán)境，逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視、識別和攻擊，并繼續(xù)生長和增殖。腫瘤突變負荷與免疫檢查點阻斷反應之間存在正相關(guān)。來自體細胞突變的腫瘤新抗原激活適應性免疫反應，殺死癌細胞。同樣，具有新抗原生成能力的腫瘤相關(guān)剪接事件被認為是免疫治療反應的重要預測因子［22-23］。越來越多的臨床研究［24-26］表明，針對癌癥種系抗原的T細胞受體工程化T（T-cell receptor engineered T，TCR-T）細胞治療和基于新抗原的疫苗都具有顯著效果。腫瘤特異性新抗原可以由編碼突變衍生，也可以由其他過程產(chǎn)生，如剪接事件的改變。一些分析高通量測序數(shù)據(jù)的研究［27-29］顯示，腫瘤特異性選擇性剪接非常豐富，并可能產(chǎn)生有助于表位庫的新表位。研究［30］表明，剪接障礙直接影響在免疫途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用的基因，從而影響癌癥免疫治療效果。識別不同剪接異構(gòu)體在特定癌癥中的作用和剪接因子的調(diào)節(jié)作用，對于揭示腫瘤逃避免疫反應機制具有重要意義。因此，本研究進一步利用TIMER網(wǎng)站分析了ADD3、LIMCH1及NUMB與肺腺癌中免疫細胞功能的相關(guān)性，結(jié)果顯示，ADD3、NUMB與B細胞、T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞及樹突狀細胞功能均呈正相關(guān)，而LIMCH1與巨噬細胞功能呈正相關(guān)，提示ADD3、NUMB及LIMCH1可能作為肺腺癌特異性新抗原，在肺腺癌中可能通過調(diào)節(jié)免疫細胞功能，使免疫系統(tǒng)功能總體呈激活狀態(tài)，從而起到抑制肺腺癌進展的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌中ADD3、LIMCH1及NUMB為可變剪接調(diào)控因子KHSRP的下游關(guān)鍵差異剪接靶基因，且其在肺腺癌中低表達與患者預后不良有關(guān)；免疫相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)ADD3、LIMCH1及NUMB可能與免疫細胞功能增強相關(guān)。雖然以上結(jié)果還需進一步驗證，但本研究有望為尋找有效的肺腺癌治療靶點提供新的線索。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。