李 想，潘兆平，付復(fù)華*，劉承鑫，王 琛，何 雙

（1 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 長沙 410125 2 湖南大學(xué)隆平分院 長沙 410125 3 果蔬貯藏加工與質(zhì)量安全湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 長沙 410125 4 洞庭實(shí)驗(yàn)室 長沙 410125 5 桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院 廣西桂林 541000）

柑普茶是將陳皮與云南普洱熟茶結(jié)合，在普洱茶基礎(chǔ)上經(jīng)過挖果、填茶、干燥等工藝制作而成一種微生物發(fā)酵茶[1]。它兼具水果和普洱茶的優(yōu)點(diǎn)，不僅具有陳皮的香醇口感和柚類特有果香，還具有普洱茶消炎殺菌、減肥降脂等功效[2-3]，深受消費(fèi)者喜愛。湖南是柑橘種植大省，為了提高湖南柑橘資源與茶資源的綜合利用能力，戚賀亭等[4]和Qi 等[5]研究了湖南19 種柑橘的理化指標(biāo)和加工適應(yīng)性，最后選擇加工特性總分最高的金盆柚與云南普洱茶制成一種“湘式”柑普茶-湘柑茶。

無論是普洱茶還是陳皮，均有“愈陳愈好”“越陳越香”“陳久者良”之說[6-7]，因此只有貯藏超過3 年的湘柑茶才被視為合格。湘柑茶的自然陳化周期長，可能導(dǎo)致資金流轉(zhuǎn)不通、資源占用多且成本增加的問題。研究加速陳化可以縮短產(chǎn)品周期，降低成本，減少浪費(fèi)，提高資源利用度。目前加速陳化的方法有物理法、化學(xué)法和生物法。其中物理法，如超聲催陳、超高壓催陳、輻照催陳和微波催陳等[8]，具有簡便、穩(wěn)定、清潔、高效、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用。

超聲波的作用與聲空化有關(guān)，包括氣泡的生成和內(nèi)爆破裂，引發(fā)極高的溫度和壓力，誘導(dǎo)某些化學(xué)反應(yīng)并加快其反應(yīng)速率[9-12]。超聲波在物理法加速陳化中，由于方便快捷、安全高等優(yōu)點(diǎn)而應(yīng)用較多。Ma 等[13]利用超聲波技術(shù)處理鎮(zhèn)江醋，發(fā)現(xiàn)超聲處理的變化與自然陳化相似。超聲波加速陳化對(duì)柑普茶陳化過程有較好的促進(jìn)作用，如鄭敏[14]以橙皮苷為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)超聲波處理能增加其含量，達(dá)到加速陳化的目的。將超聲波加速陳化應(yīng)用在湘柑茶中，還未見報(bào)道。本課題研究超聲加速陳化湘柑茶的最佳工藝，以及加速陳化對(duì)湘柑茶的主要化學(xué)成分與揮發(fā)性物質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金盆柚：（Citrus junos Sieb.ex Tanaka'yuzu'）選擇果皮未著色、生理未成熟、果實(shí)直徑4～4.5 cm 的金盆柚，湖南省岳陽縣惠泰云有限公司。

普洱熟茶：潤元昌勐海茶廠。

沒食子酸、蘆丁、橙皮苷（均為標(biāo)準(zhǔn)品），成都曼思特生物科技有限公司；福林酚，合肥博美生物科技有限公司；乙醇、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、環(huán)己酮、氯化鈉、甲醇（均為分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J-26 XP 型高效離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特有限公司；KQ-700DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；T6 新世紀(jì)型紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Acquity 超高效液相色譜儀，美國Waters 公司；6890N-5973 型氣相色譜質(zhì)譜儀（NIST08 譜庫），美國安捷倫公司；二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷萃取頭（DVB/PDMS，50/30 μm，65 μm），德國默克公司。

1.3 方法

1.3.1 湘柑茶的制備及樣品處理 湘柑茶制備工藝流程[5]：金盆柚清洗→頂部開口→取肉→洗皮→晾干→填茶→殺青→干燥→成品包裝。

操作要點(diǎn)：1）晾干：日曬至柑皮表面無水珠；2）填茶：普洱茶填入柑皮五分之四，普洱茶含水量＜10%；3）殺青：85 ℃殺青30 min；4）干燥：白天日曬，夜晚45 ℃輕烘，持續(xù)7 d。

樣品處理：將湘柑茶除去包裝，用真空包裝袋抽真空包裝，后進(jìn)行超聲處理，超聲介質(zhì)為水。處理好的湘柑茶經(jīng)液氮急速冷凍后再機(jī)械粉碎，過45 目篩，真空包裝后于4 ℃貯藏待測(cè)。

1.3.2 超聲加速陳化優(yōu)化試驗(yàn) 總黃酮作為陳皮和普洱茶中含量最高、最穩(wěn)定的重要活性成分，含量會(huì)隨著貯藏時(shí)間的延長而增加，可為湘柑茶“陳久者良”的說法提供科學(xué)理論依據(jù)[15-16]，因此本試驗(yàn)以總黃酮含量作為陳化衡量指標(biāo)。

1.3.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 分別設(shè)置不同的超聲功率、超聲時(shí)間、超聲介質(zhì)溫度，各因素固定值為超聲功率70 W，超聲時(shí)間35 min，超聲介質(zhì)為水（40℃）。保持2 個(gè)因素不變，每次改變1 個(gè)因素，測(cè)定總黃酮的含量。

表1 OFAT 單因素實(shí)驗(yàn)水平表Table 1 Factors and levels used in OFAT experiments

1.3.2.2 正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇A 超聲功率、B 超聲時(shí)間、C 超聲溫度3 個(gè)因素進(jìn)行三因素三水平的L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以確定最佳超聲條件組合。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 主要化學(xué)成分的測(cè)定 總酚的測(cè)定參照《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) 茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》（GB/T 8313-2018）；

總黃酮的測(cè)定參照《食品中的總黃酮測(cè)定 分光光度法》（SZDB/Z 349-2019）；

橙皮苷的測(cè)定采用UPLC 法[4]，UPLC 條件：Waters Acquity UPLC BEH Ci 鍵合色譜柱（180 mm×2.1 mm×1.7 pirn）；流動(dòng)相：甲醇（流動(dòng)相A），水（流動(dòng)相B）；洗脫條件：采用梯度洗脫，0～3 min，40%～45%流動(dòng)相A；3～7 min，45%～40%流動(dòng)相 A；7～50 min，40%流動(dòng)相 A。流速 0.15 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長283 nm；橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=13283x+8021.7，R2=0.9999。

1.3.3.2 揮發(fā)性成分測(cè)定

1）HS-GC-MS 檢測(cè)條件 參照文獻(xiàn)[17]。取3.00 g 樣品移入20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中，加入6 mL飽和氯化鈉溶液和20 μL 的內(nèi)標(biāo)物環(huán)己酮（0.1894 g/mL，乙醇稀釋）后，立即用聚四氟乙烯隔墊密封，60 ℃水浴5 min，頂空萃取30 min，插入老化好的萃取頭，于250 ℃的氣相色譜進(jìn)樣器中無分裂解吸5.5 min。

2）質(zhì)譜條件[18]電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度275 ℃；離子源溫度230 ℃；母離子m/z 285；激活電壓1.5 V；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～550。

通過質(zhì)譜與標(biāo)準(zhǔn)NIST 08 文庫的保留指數(shù)比較，采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算揮發(fā)性化合物含量[19]。

1.3.3.3 感官評(píng)價(jià) 沸水醒茶10 s 后倒掉，按茶/水：1 g/50 mL 的比例用煮茶器煮茶20 min 后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。組成20 人評(píng)定小組（男女各10 人），對(duì)湯色（20 分），香氣（30 分），滋味（30 分）和接受度（20 分）進(jìn)行評(píng)定[4]，具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 湘柑茶感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria of Xianggan teas

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用IBM SPSS Statistics 23 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA 方差分析（P＜0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異），采用Origin 2021 軟件作圖；所有試驗(yàn)平行3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲條件優(yōu)化

2.1.1 超聲功率的篩選 超聲功率對(duì)湘柑茶總黃酮的影響如圖1 所示。由圖1 可知，隨著超聲功率的增加，總黃酮的含量呈先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)超聲功率為70W 時(shí)，總黃酮達(dá)到了最高為（3.945±0.073）g/100 g。其原因可能是超聲功率的增加會(huì)使樣品中的酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為黃酮類物質(zhì)，而超聲功率過高，加劇產(chǎn)生的空化效應(yīng)導(dǎo)致了黃酮類物質(zhì)的環(huán)鏈鍵斷開，造成黃酮類物質(zhì)的損失分解[20-22]。因此，最適超聲功率為70 W。

圖1 超聲功率對(duì)總黃酮的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on total flavonoids

2.1.2 超聲時(shí)間的篩選 超聲時(shí)間對(duì)湘柑茶總黃酮含量的影響如圖2 所示，隨著超聲時(shí)間的增加，總黃酮的含量呈增加趨勢(shì)，并在65 min 時(shí)總黃酮的含量最高，之后隨著時(shí)間的增加樣品總黃酮含量降低。超聲作用時(shí)間過長，會(huì)使樣品中的黃酮結(jié)構(gòu)遭到破壞，影響黃酮穩(wěn)定性。因此，選擇的超聲時(shí)間為65 min。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on total flavonoids

2.1.3 初始溫度的篩選 試驗(yàn)分別在20，30，40，50，60 ℃條件下進(jìn)行，由圖3 可知，湘柑茶在初始超聲溫度為30 ℃時(shí)總黃酮的含量最高，大于30℃溫度下樣品總黃酮的量開始降低，可能是過高的溫度會(huì)使黃酮結(jié)構(gòu)破壞分解，因此試驗(yàn)中選擇超聲初始溫度為30 ℃。

圖3 超聲溫度對(duì)總黃酮的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on total flavonoids

2.1.4 正交試驗(yàn)結(jié)果 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總黃酮的含量為指標(biāo)，選擇超聲功率（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲溫度（C）為考察因素進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 超聲加速陳化條件優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of optimizing orthogonal test of ultrasonic acceleration of aging conditions

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 ANOVA analysis of orthogonal test results

由表3 可知，8 號(hào)試驗(yàn)組合（A2B1C2）總黃酮含量最高，為（3.516±0.03）g/100 g，根據(jù)極差分析可知，影響總黃酮含量的因素主次順序?yàn)镃＞A＞B，即超聲溫度＞超聲功率＞超聲時(shí)間；最優(yōu)超聲加速陳化工藝組合為A2B1C2，即超聲功率為70 W、超聲時(shí)間55 min、超聲溫度30 ℃。由表4 可知，超聲溫度對(duì)總黃酮含量影響顯著（P＜0.05），方差分析結(jié)果與極差分析結(jié)果一致。在最優(yōu)條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，總黃酮含量平均為（4.011±0.10）g/100 g，高于試驗(yàn)組。因此，確認(rèn)最優(yōu)超聲加速陳化工藝組合為A2B1C2，即超聲功率為70 W、超聲時(shí)間55 min、超聲溫度30 ℃。

2.2 主要化學(xué)成分研究

在最優(yōu)超聲條件下對(duì)湘柑茶進(jìn)行加速陳化試驗(yàn)，得到主要化學(xué)成分含量如圖4 所示。由圖可見超聲處理的湘柑茶總多酚含量僅僅增加了4.48%，其結(jié)果與龔淑英等[23]在常溫下貯藏，初始含水量為7%貯藏45 d、含水量12%貯藏90 d 的普洱茶總多酚含量增加量相似。他們認(rèn)為總多酚在貯藏過程中含量較穩(wěn)定、變化不明顯，但在普洱茶在貯藏初期中，多酚含量有一個(gè)緩慢上升的過程。經(jīng)過超聲處理的湘柑茶中總黃酮和橙皮苷均有顯著性增加（P＜0.05），其中總黃酮含量增加了22.63%，橙皮苷增加了11.11%，與劉素娟[24]研究變化趨勢(shì)相似，隨著貯藏時(shí)間的增加，陳皮的總黃酮和橙皮苷均呈增加趨勢(shì)，在劉的研究中，陳皮貯藏12 個(gè)月時(shí)，總黃酮含量增加了25%左右、橙皮苷含量增加了約9%。結(jié)果表明，超聲處理能加速湘柑茶陳化，本試驗(yàn)加速效果與普通陳化1 年左右相當(dāng)。

圖4 不同處理湘柑茶主要化學(xué)成分的變化Fig.4 Changes of main chemical components of Xianggan tea in different treatments

2.3 揮發(fā)性成分

揮發(fā)性成分是湘柑茶陳化品質(zhì)的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)對(duì)比了未經(jīng)處理和最優(yōu)超聲加速陳化條件處理的湘柑茶香氣成分的變化。結(jié)果表明，未處理和超聲的湘柑茶中均有53 種揮發(fā)性成分，D-檸檬烯、反式-β-金合歡烯、γ-松油烯在二者之間均有較高含量，超聲之后的湘柑茶中D-檸檬烯含量降低，反式-β-金合歡烯和γ-松油烯含量則有所增加。在超聲陳化過程中，發(fā)現(xiàn)有14 種香氣成分消失，14 種物質(zhì)生成。新生成了4-萜烯醇、4-甲基-1-（1-甲基乙基）-二氫衍生物-雙環(huán)[3.1.0]己烷、1-甲基-4-（1-甲基乙基）苯和11 種烯類，消失的揮發(fā)性成分有鄰甲氨基苯甲酸甲酯、鄰-異丙基苯、1-甲基-3-[（1-甲基亞乙基）環(huán)丙基]-苯和11種烯類。

α-松油醇是具有海桐花香的醇類，經(jīng)過超聲處理，其含量顯著增加（P＜0.05），與鮑曉華[25]發(fā)現(xiàn)其在普洱茶貯藏過程中含量會(huì)上升結(jié)果一致，對(duì)湘柑茶的陳香有較好的協(xié)調(diào)作用，新生成的萜烯醇類-4-萜烯醇則能調(diào)和湘柑茶陳香風(fēng)味[26]。3-甲基-4-異丙基苯酚在超聲處理下也呈增加趨勢(shì)，與研究報(bào)道的酚類香氣在貯藏中會(huì)增加相一致[27]，有利于湘柑茶陳香風(fēng)味的形成。醚類物質(zhì)在超聲作用下略微降低，烷類物質(zhì)有一種新物質(zhì)的生成；鄰甲氨基苯甲酸甲酯為柑皮特有的香精油成分，隨著貯藏時(shí)間的延長，湘柑茶中柑皮油包層的香精油會(huì)逐漸減少至消失，超聲后的湘柑茶鄰甲氨基苯甲酸甲酯消失符合這一規(guī)律[28]。

烯烴類成分中，檸檬烯是碳?xì)浠衔镏凶顬樨S富的香氣成分，呈刺激性檸檬味，由表5 可知，經(jīng)過超聲處理的湘柑茶D-檸檬烯降低，可使湘柑茶香味更香醇優(yōu)雅，與易倫朝等[29]研究結(jié)果相似，無論是自然陳化還是人工陳化，D-檸檬烯均呈降低趨勢(shì)；在超聲處理下湘柑茶新生成了（+）-3-蒈烯，有研究表明貯藏1 年的普洱茶中（+）3-蒈烯含量較高，不同品種普洱茶中（+）3-蒈烯在第3 年后含量均會(huì)降低[25]，表明超聲處理有一定的陳化效果。在超聲處理下新生成的（Z）-β-羅勒烯、α-愈創(chuàng)木烯均為湘柑茶陳化香氣中的代表性物質(zhì)[25，30]。1，2，3-甲氧基苯是普洱茶中陳香含量最豐富的香氣成分，對(duì)陳香味起重要作用[31-32]，在試驗(yàn)中其含量增加，說明超聲處理有利于湘柑茶產(chǎn)生陳香香氣。

表5 不同處理湘柑茶揮發(fā)性成分的變化Table 5 Changes of volatile components of Xianggan tea in different treatments

表6 不同處理湘柑茶主要?dú)馕痘钚曰衔锏腛AV 值Table 6 OAV values of main odorant active compounds in Xianggan tea in different treatments

綜上所述，超聲處理有加速陳化的效果，可使湘柑茶風(fēng)味更接近自然陳化，香味更醇厚優(yōu)雅。

2.4 感官評(píng)價(jià)

對(duì)于湘柑茶來說，陳化是其向著香、醇、濃、甘方向轉(zhuǎn)變的重要步驟，陳化可使茶滋味更加醇和溫潤、湯亮香高。本試驗(yàn)對(duì)超聲加速陳化處理的湘柑茶的湯色、香氣、滋味和接受度進(jìn)行評(píng)定，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過超聲處理的湘柑茶與未處理的在感官特征中存在一定差異，其中，經(jīng)過超聲處理的湘柑茶各特征分值均高于未處理的，湯色、香氣、滋味和接受度的變異系數(shù)依次為1.06%，1.96%，4.96%和4.35%，這說明對(duì)感官評(píng)價(jià)差異影響最大的是滋味和接受度。從表7 的分值中可以看出，超聲處理的湘柑茶柑橘香、茶香比未超聲處理的更濃郁協(xié)調(diào)；超聲產(chǎn)生的茶多酚氧化產(chǎn)物、降解產(chǎn)物和衍生物等使湘柑茶湯色更深、更明亮通透；湘柑茶在貯藏一段時(shí)間后，感官表現(xiàn)為苦澀味減少，滑順、濃醇感增加，可能是茶黃素減少使樣品的帶刺激性澀味減少，符合湘柑茶超聲后在滋味上較未超聲處理的更醇厚、細(xì)膩的結(jié)果[25]；因此，超聲處理的湘柑茶在接受度上優(yōu)于未處理的。

表7 不同處理湘柑茶感官評(píng)價(jià)表Table 7 Sensory evaluation table of Xianggan tea with different treatments

綜上所述，超聲處理后的湘柑茶感官品質(zhì)優(yōu)于未超聲處理的，因此超聲處理不僅可以加速陳化，還可以提高品質(zhì)。

2.5 主成分分析

主成分分析（Principal component analysis，PCA）[34]是將湘柑茶的主要化學(xué)成分、感官評(píng)價(jià)和20 種關(guān)鍵香氣化合物（OAV＞1，表6）共27 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分析，得到圖5。PCA 分析結(jié)果共提取到6 個(gè)主成分，第1 個(gè)主成分貢獻(xiàn)率為73.17%，第2 個(gè)主成分貢獻(xiàn)率為16.07%，前3 個(gè)主成分的特征值均大于1，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到了95.85%。由圖5可知，未超聲處理的湘柑茶位于第二、三象限，超聲處理的則位于第一、四象限，不同處理的湘柑茶樣品可以得到很好的區(qū)分，說明其綜合品質(zhì)具有顯著差異。在雙重信息圖中，D-檸檬烯、反式茴香醚、（＋）-α-蒎烯等烯類香氣物質(zhì)與未處理的湘柑茶具有一致性。香氣、總多酚和一部分烯類、醇類等成分構(gòu)成了超聲加速陳化后湘柑茶的重要指標(biāo)。

圖5 主成分分析雙重信息圖Fig.5 Dual infographic of principal component analysis

綜上所述，超聲處理后影響湘柑茶品質(zhì)的主要成分與陳化相關(guān)成分相一致，說明超聲處理具有加速陳化作用，且能進(jìn)一步提升湘柑茶品質(zhì)。

3 結(jié)論

對(duì)“湘柑茶”這一湘式柑普茶進(jìn)行超聲加速陳化試驗(yàn)，同時(shí)結(jié)合主成分分析研究最優(yōu)超聲條件處理后的湘柑茶主要化學(xué)成分、揮發(fā)性成分以及感官評(píng)價(jià)的變化。結(jié)果表明，湘柑茶超聲陳化最優(yōu)條件為超聲功率70 W、超聲時(shí)間55 min、超聲溫度30 ℃；超聲處理后湘柑茶的總黃酮與橙皮苷含量顯著增加，符合陳化規(guī)律，與前人研究相比，達(dá)到了1 年左右的陳化效果；在超聲陳化過程中，有14 種香氣成分消失，14 種物質(zhì)生成，α-松油醇、3-甲基-4-異丙基苯酚、（Z）-β-羅勒烯等主要陳化風(fēng)味增加，鄰甲氨基苯甲酸甲酯、D-檸檬烯等新鮮湘柑茶特有風(fēng)味含量下降；超聲處理的湘柑茶香氣、湯色、滋味、接受度均優(yōu)于未處理的，且較未超聲處理湘柑茶的湯色更深、滋味更醇厚、優(yōu)雅細(xì)膩；主成分分析結(jié)果顯示共提取到6 個(gè)主成分，前3個(gè)主成分的特征值均大于1，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到了95.85%，超聲處理后影響湘柑茶品質(zhì)的主要成分與陳化相關(guān)成分相一致。由此可知，超聲處理具有加速陳化作用，且能進(jìn)一步提升湘柑茶品質(zhì)。