林穎珺，韓堯躍，栗 華，姜發(fā)琴*，傅 磊，張 倩，林秀芬

（1 上海交通大學藥學院 上海 200240 2 廈門藍灣科技有限公司 福建廈門 361026 3 廈門大學附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科 福建廈門 361003）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，簡稱Hp）寄生于腸道，是一種螺旋形、微厭氧革蘭氏陰性菌。目前感染超過全球50%以上的人群，與多種胃腸道疾病及胃腸外疾病密切相關(guān)，如消化性潰瘍、慢性胃炎及胃癌等，被歸類為第1 類致癌物[1-3]。

目前幽門螺旋桿菌的治療方案包括伴同療法、混合療法、包含左氧氟沙星的方案[4]。頻發(fā)的抗生素耐藥性問題以及臨床治愈后的復發(fā)率上升讓人重新審視幽門螺旋桿菌的治療方案。2010 年全球幽門螺旋桿菌的復發(fā)率呈現(xiàn)地區(qū)化分布規(guī)律，復發(fā)率已達4.8%，高于1990 年的3.9%。幽門螺旋桿菌對克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星的耐藥率（包括多重耐藥率）在2016 年被發(fā)現(xiàn)呈直線上升趨勢，其中克拉霉素為20%～50%，甲硝唑為40%～70%[5]。一線治療方案如克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑以及質(zhì)子泵抑制劑聯(lián)用的治療方案治愈率有所下滑，其最主要的原因在于克拉霉素的耐藥性上升[6]。因此臨床治療中常常需要延長臨床治療周期，由此常帶來多種胃腸道反應，如惡心、味覺障礙、消化不良、腹痛、腹瀉。腦腸同軸理論中指出，胃腸動力受大腦的調(diào)節(jié)主要表現(xiàn)在兩個方面，即神經(jīng)傳導和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)[7]。過度使用抗生素可能帶來的胃腸功能紊亂，腸易激綜合征（IBS）以及情緒問題，給人的正常生活帶來嚴重負擔。

近年來出現(xiàn)的益生元、益生菌療法可以很好地解決臨床治愈率下降以及副作用等多重問題[8]。殼寡糖及其相關(guān)化合物是一種以甲殼綱動物為來源的優(yōu)質(zhì)益生元，具有出色的生物活性[9]。據(jù)Zheng 等[10]研究，殼聚糖對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具備抗菌活性，以甲殼綱動物為原料的殼寡糖及其系列產(chǎn)物，被證明具有一定的抑菌效果。殼寡糖被列入我國新食品原料目錄，擁有極大的市場應用前景[11]。目前國內(nèi)外益生元抑制幽門螺旋桿菌的報道更多的集中在組合療法，如抗生素與益生菌結(jié)合療法[12-13]，還未見系統(tǒng)性的體外抗菌研究。本次研究中對比研究殼寡糖及其相關(guān)產(chǎn)物的體外抗幽效果，希望能夠為后續(xù)臨床抗幽門螺旋桿菌的新型療法提供參考。

1 試驗材料

1.1 菌株

幽門螺旋桿菌，編號GDMCC 1.1820，購自廣東省微生物菌種保藏中心，采用冷凍干燥保藏管進行保存。

1.2 主要試劑與耗材

腦心浸液粉，OXOID；哥倫比亞瓊脂，環(huán)凱微生物；無菌脫纖維羊血，南京茂捷微生物；真菌培養(yǎng)皿，BIOFIL；殼聚糖（脫乙酰度＞90%），羧甲基殼聚糖，殼寡糖A，殼寡糖B。

1.3 主要設(shè)備與儀器

HL-B 型厭氧工作站，LABIOPHY；HF100 型三氣培養(yǎng)箱，力康；STARTER3100 型pH 計，OHAUS。

2 試驗方法

2.1 主要物料及溶液的制備

2.1.1 主要物料的制備 本次研究試驗中所涉及的殼聚糖及殼寡糖、羧甲基殼聚糖均為自主研發(fā)制備而成，以阿拉斯加雪蟹殼為主要原料，通過“一步法”制備的高脫乙酰度殼聚糖，然后以反應工藝所獲得的殼聚糖，通過復合生物酶法制備的不同脫乙酰度的殼寡糖，并以化學法制備獲得的特定聚合度的羧甲基殼聚糖，將直接用于后續(xù)抑菌性試驗研究。

2.1.2 主要溶液的配制

1）幽門螺旋桿菌培養(yǎng)基的配制：稱取腦心浸液粉9.6 g、哥倫比亞瓊脂23.4 g，加入蒸餾水780 mL，100 mL 分裝后高壓滅菌15 min，當溫度降至46 ℃時每100 mL 加入5 mL 無菌脫纖維羊血，倒板待用。

2）不同濃度的殼聚糖溶液配制方法如下：殼聚糖溶液（10 mg/mL）：稱取0.5 g 殼聚糖粉末，加入1%醋酸溶解，定容至50 mL，測得pH 值為4.08，使用0.22 μm 濾膜進行過濾除菌。5 mg/mL殼聚糖和1 mg/mL 殼聚糖溶液以相應倍數(shù)進行稀釋。殼聚糖溶液（20 mg/mL）：稱取1 g 殼聚糖粉末，加入2%醋酸溶解，定容至50 mL。

3）不同脫乙酰度殼寡糖原料，具體分類如下：

根據(jù)試驗需求，分別取不同種類的殼寡糖原料，配制不同濃度梯度的殼寡糖原料，范圍為1～50 mg/mL，配制方法如下所示：

表1 不同脫乙酰度的殼寡糖Table 1 Chitosan oligosaccharide with degree of deacetylation

殼寡糖溶液（50 mg/mL）：稱取2.5 g 殼寡糖粉末，加入去離子水進行溶解，定容50 mL，使用0.22 μm 濾膜進行過濾除菌。

殼寡糖溶液（10 mg/mL）：稱取0.5 g 殼寡糖粉末，加入去離子水溶解，定容至50 mL，測得pH 值為5.45，使用0.22 μm 濾膜進行過濾除菌。5 mg/mL 殼寡糖和1 mg/mL 殼寡糖溶液以相應倍數(shù)進行稀釋。

4）羧甲基殼聚糖溶液（10 mg/mL）：稱取0.5 g 羧甲基殼聚糖粉末，加入去離子水溶解，定容至50 mL，測得pH 值為9.65，使用0.22 μm 濾膜進行過濾除菌。5 mg/mL 羧甲基殼聚糖和1 mg/mL 羧甲基殼聚糖溶液以相應倍數(shù)進行稀釋。羧甲基殼聚糖溶液（20 mg/mL）：稱取1 g 羧甲基殼聚糖粉末，加入去離子水溶解，定容至50 mL。

5）甲硝唑溶液（10 mg/mL）：稱取0.2 g 甲硝唑，加入1%醋酸進行溶解，定容至20 mL。

2.2 體外抑菌試驗檢測殼寡糖及其衍生物抑制幽門螺旋桿菌

根據(jù)周蓉等[15]改進的體外抑菌性研究方法，以2.1 節(jié)中配置的溶液為試驗組，研究在不同濃度下的殼寡糖、殼聚糖以及羧甲基殼聚糖的體外抗幽門螺旋桿菌的作用，陽性對照為甲硝唑溶液，陰性對照組為無菌ddH2O 或醋酸溶液，空白對照為不添加任何試液。以下是具體方案：

從-80 ℃冰箱取出保藏的Hp 菌種，37 ℃水浴迅速解凍后，涂布于新鮮的平板上，37 ℃、5% O2、10% CO2培養(yǎng)48 h。觀察菌落形態(tài)為透明，灰白色，邊緣平整濕潤，革蘭氏染色為陰性，挑取單菌落，純化培養(yǎng)3 代后，再進行48 h 培養(yǎng)后，從平板上刮取少量Hp，重懸于1 mL 無菌ddH2O，根據(jù)OD625的大小將菌懸液濃度控制在107CFU/mL。

將該濃度的菌懸液進行涂布試驗，其中每個平板涂布100 μL 菌液，每個平板上打4 個孔，每孔加入50 μL 待測藥物，放入培養(yǎng)箱中以上述相同條件培養(yǎng)48 h，觀察并用游標卡尺測量抑菌環(huán)半徑（mm），并拍照保存，陽性對照和陰性對照的處理方法同上。

2.3 殼寡糖及其相關(guān)產(chǎn)物對幽門螺旋桿菌體外生長的影響

以2.2 節(jié)中驗證獲得具備體外抑菌作用的物料，甲硝唑等加入幽門螺旋桿菌進行共培養(yǎng)，控制初始幽門螺旋桿菌的濃度為107CFU/mL，觀察幽門螺旋桿菌的生長情況，液體培養(yǎng)的發(fā)酵條件為事先摸索的幽門螺旋桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶微需氧（6%O2、80%N2、10%CO2）的培養(yǎng)技術(shù)，置于恒溫搖床中37 ℃振蕩培養(yǎng)，以不添加任何其它溶液的培養(yǎng)基作為調(diào)零溶液，記錄不同時間段的吸光度值OD625，運用orgin2018 繪制菌體生長曲線圖，討論殼寡糖對幽門螺旋桿菌生長的影響。

3 結(jié)果與分析

3.1 殼聚糖、羧甲基殼聚糖對幽門螺旋桿菌的抑菌作用研究

打孔法測定生物活性物質(zhì)的抑菌性是藥敏學中常用的方法，該方法需要所研究的物料在平板上擴散性較好，所以需要考察不同溶劑對于目標產(chǎn)物的溶解性，選擇合適的溶劑和濃度作為載體，進行后續(xù)的抑菌性試驗。

3.1.1 不同溶劑溶解殼聚糖、殼寡糖及羧甲基殼聚糖的效果 殼聚糖是一種在酸性條件下溶解性好的生物大分子多糖，常用的溶解溶劑包括無機酸和有機酸。選擇不同種類的酸，配置成質(zhì)量濃度20 mg/mL 的殼聚糖溶液，觀察溶液的溶解情況，試驗結(jié)果如表2 所示：殼聚糖溶液在無機酸中的溶解速度和效果優(yōu)于有機酸，其中醋酸溶解速度快，所形成的溶液性質(zhì)為透明均一的液體。

表2 不同種類酸溶解殼聚糖（20 mg/mL）的情況Table 2 Dissolving description of Chitosan（20 mg/mL）with different kind of acid

目前大多關(guān)于殼聚糖溶液的研究一般以充分溶解的低濃度殼聚糖溶液為研究對象，溶液多以醋酸稀溶液為主，質(zhì)量分數(shù)為1%～2%。故后續(xù)選擇質(zhì)量分數(shù)為1%，2%的醋酸溶液作為溶劑，研究不同濃度下的殼聚糖的抑菌效果。由于殼寡糖、羧甲基殼聚糖極易溶于水，所以本次抑菌性試驗所選擇的溶劑為無菌ddH2O，羧甲基殼聚糖是一種由殼聚糖的羧甲基化衍生物，水溶性較好，其在水中的最大溶解度為20 mg/mL。

3.1.2 殼聚糖及羧甲基殼聚糖的抑菌效果情況本研究中以醋酸溶液為溶劑，配置不同濃度的殼聚糖溶液，空白對照為1%，2%的醋酸（圖1 右下），以2.2 節(jié)中所提及方法，進行抑菌性試驗，測定平板形成抑菌圈大小，試驗結(jié)果如表3 所示，結(jié)論顯示：以1%醋酸溶液為溶劑，質(zhì)量濃度為1，5，10，20，50 mg/mL 的殼聚糖溶液均未產(chǎn)生抑菌環(huán)，說明以1%醋酸溶液為溶劑配置的不同質(zhì)量濃度的1～50 mg/mL 殼聚糖溶液以及對照1%醋酸對幽門螺旋桿菌生長均沒有抑制作用，但以2%醋酸溶液為溶劑，配置的殼聚糖溶液，質(zhì)量濃度為20，50 mg/mL 的殼聚糖溶液均出現(xiàn)極小的抑菌環(huán)，陰性對照2%的醋酸溶液的抑菌圈半徑為1 mm，從結(jié)果分析可能是2%醋酸溶液對幽門螺旋桿菌有抑菌作用，陽性對照為10 mg/mL 甲硝唑溶液。

圖1 殼聚糖以及羧甲基殼聚糖抑菌平板示意圖Fig.1 Inhibit circle picture of Chitosan and carboxymethyl chitosan

圖2 殼寡糖對幽門螺旋桿菌的抑菌平板示意圖Fig.2 Inhibit circle picture of chitosan oligosaccharide

表3 不同濃度下殼聚糖溶液和羧甲基殼聚糖溶液的抑菌環(huán)情況Table 3 Chitosan and carboxymethyl chitosan's inhibit circle in different concentration

以無菌水為溶劑溶解，配置不同濃度的羧甲基殼聚糖，根據(jù)表2 抑菌環(huán)測試顯示，不同濃度的羧甲基殼聚糖均未形成抑菌環(huán)，說明這些濃度的羧甲基殼聚糖不具備抑制幽門螺旋桿菌的作用，另外表中的陽性對照為10 mg/mL 甲硝唑溶液，陰性對照為無菌ddH2O。

3.2 不同脫乙酰度的殼寡糖原料對幽門螺旋桿菌的抑菌作用研究以及最小抑菌濃度的確定

脫乙酰度是殼寡糖產(chǎn)品好壞的重要指標，脫乙酰度的高低直接決定其在溶液中的溶解性，脫乙酰度越高，抑菌性越高；目前，大部分已有報道推測殼寡糖對于幽門螺旋桿菌的抑菌作用可能與酶切方式、pH 值、濃度有關(guān)，但還并未有報道研究脫乙酰度對于抗幽作用的影響。

通過對比兩種不同脫乙酰度的殼寡糖原料，以無菌水為溶劑分別溶解配置成不同濃度的殼寡糖溶液，以2.2 節(jié)中介紹的試驗方法測定殼寡糖A和B 的體外抑菌情況，以下是通過抑菌試驗獲得的抑菌環(huán)數(shù)據(jù)。

表4 不同脫乙酰度下的殼寡糖抑菌環(huán)情況Table 4 Inhibit circle of chitosan oligosaccharide in degree of deacetylation

通過試驗結(jié)果可以看到，不同濃度的殼寡糖A 未能在平板上生成抑菌環(huán)，而殼寡糖原料B 能夠具備抑制幽門螺旋桿菌的作用，最小抑菌質(zhì)量濃度為50 mg/mL。在該濃度下，所配置而成的殼寡糖溶液能有效抑制幽門螺旋桿菌的生長，生成半徑約為4 mm 的抑菌圈，陽性對照為配置而成的10 mg/mL 甲硝唑溶液，陰性對照為無菌ddH2O。

3.3 高脫乙酰度殼寡糖B 對于幽門螺旋桿菌生長曲線的影響

分別選擇殼寡糖A（50 mg/mL），殼寡糖B（50 mg/mL）以及甲硝唑（10 mg/mL）作為研究對象，與幽門螺旋桿菌進行培養(yǎng)，對照組（control）為不添加殼寡糖的幽門螺旋桿菌，初始菌濃度與試驗組相同，所有組別保證溶液的初始菌濃度為107CFU/mL，以空白培養(yǎng)基溶液為吸光度值調(diào)零，以菌體吸光度OD625為考察指標，討論不同殼寡糖溶液對于幽門螺旋桿菌生長曲線的影響。

根據(jù)圖3 的生長曲線試驗結(jié)果顯示：對照組的菌體正常生長，10～20 h 為菌體的對數(shù)生長期，20 h 后菌體生長進入穩(wěn)定期。而試驗組（COS B+HP）中由于加入質(zhì)量濃度為50 mg/mL 的殼寡糖，使得菌體的生長受到抑制作用，導致試驗組所積累的菌體生物量遠低于對照組（菌體的吸光度值下降），試驗組（COS A+HP）中的生長曲線與對照組的生長基本一致，生長趨勢和生物量無明顯區(qū)別，加入甲硝唑的組別菌體生長受到明顯抑制，生物量積累明顯低于所有其它試驗組和對照組，另外通過t 檢驗顯示所有試驗組與對照組結(jié)果有顯著差異（P＜0.05）。

圖3 不同物料對幽門螺旋桿菌的生長曲線的影響Fig.3 Effect on the HP's growth curve with different experiment group

4 結(jié)論

近年來，學者們對于殼寡糖及其相關(guān)產(chǎn)物的體外抑制幽門螺旋桿菌的作用有了初步的研究成果[16]。謝勇等[17]在研究中提出殼聚糖、羧甲基殼聚糖對幽門螺旋桿菌具有抑制作用；薛海波等[18]提出通過內(nèi)切酶制備工藝對產(chǎn)物抗幽作用的影響；李溫靜[19]在研究中提到特殊的殼寡糖具備一定的體外抗幽門螺旋桿菌作用。陳建國等[20]提到內(nèi)切酶、外切酶以及混合酶的制備工藝對于產(chǎn)物是否具有抗幽作用有重要影響。

在本次研究中選擇自主制備的甲殼質(zhì)衍生物中代表性產(chǎn)物、殼聚糖、殼寡糖以及羧甲基殼聚糖為研究對象，研究不同種物料對于幽門螺旋桿菌的最小抑菌濃度（MIC），一般來說，打孔法適用于溶解性好的樣品；但殼聚糖的水溶性較差，所以本研究中采用不同濃度的醋酸溶液溶解殼聚糖進行研究，而羧甲基殼聚糖及殼寡糖的水溶性較好，可以直接選用無菌ddH2O 進行溶解。采用不同濃度的殼聚糖和羧甲基殼聚糖進行試驗，未發(fā)現(xiàn)其具備體外抑制幽門螺旋桿菌的作用，可能于不同取代位置與分子質(zhì)量區(qū)間有關(guān)；而殼寡糖組試驗結(jié)論顯示，廈門藍灣科技有限公司自主生產(chǎn)的高脫乙酰度殼寡糖經(jīng)過驗證在質(zhì)量濃度為50 mg/mL時能夠?qū)τ拈T螺旋桿菌產(chǎn)生較強的體外抑菌作用，抑菌圈半徑為（4.1±0.23）mm，質(zhì)量濃度為10 mg/mL 陽性對照（甲硝唑）的條件下，所形成的抑菌環(huán)半徑為（5.5±0.15）mm，試驗中采用的低脫乙酰度的殼寡糖未產(chǎn)生抑菌圈，同時從共培養(yǎng)結(jié)果來看，高脫乙酰度的殼寡糖B（50 mg/mL）可以明顯抑制幽門螺旋桿菌的生物量積累，反之殼寡糖A（50 mg/mL）則不具備相應的抑制作用；分析原因可能是由于高脫乙酰度的殼寡糖擁有較高的生物利用度，水溶性更好，能夠更好的與細胞膜上的受體蛋白錨定并特異性結(jié)合，當與細胞體內(nèi)帶有陰離子的細胞質(zhì)發(fā)生物理聚合作用，進而擾亂細胞正常的生理活動，抑制幽門螺旋桿菌的正常代謝，進而影響菌體的生長。

綜上，在本研究中由廈門藍灣科技有限公司生產(chǎn)的高脫乙酰度的殼寡糖具備一定的體外抑制幽門螺旋桿菌作用，未來可以進一步完善在抗幽試驗的深入研究。