王 艷，顧 悅，鄭硯學(xué)，張 悅，賀銀鳳

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特 010018）

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是細(xì)菌通過感知周圍環(huán)境中菌群濃度的變化，釋放信號分子，進(jìn)而啟動相關(guān)基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)調(diào)控菌體行為的一種生理活動[1]。目前發(fā)現(xiàn)QS 系統(tǒng)可以調(diào)控細(xì)菌多種生理行為，如毒力因子的表達(dá)、生物膜的形成、胞外多糖的產(chǎn)生、生物發(fā)光、細(xì)菌自溶以及細(xì)菌素的生物合成和對各種環(huán)境壓力的抗性等[2-6]。乳酸菌是一類兼性厭氧，能夠?qū)⑻妓衔锇l(fā)酵產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性菌，其群體感應(yīng)類型包括自身誘導(dǎo)和雙組分信號系統(tǒng)[7]。乳酸菌的信息交流分為種間交流信號分子AI-2 和種內(nèi)調(diào)節(jié)信號分子AIP，其中，信號分子AI-2 是呋喃酮酰硼酸二酯，LuxS/AI-2 群體感應(yīng)系統(tǒng)在多種細(xì)菌信息交流中都起著重要的作用[8-9]。

前期研究表明LuxS/AI-2 群體感應(yīng)系統(tǒng)可調(diào)控乳酸菌形成生物膜，且對生物膜的形成能力具有一定的影響[10-11]。乳酸菌的生物膜主要是菌體外的大量胞外聚合物與細(xì)菌粘連形成的菌落聚集體[12]。胞外聚合物主要指細(xì)菌分泌的各種生物大分子物質(zhì)，如胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）和蛋白質(zhì)、核酸等。EPS 是指細(xì)菌在生長發(fā)育過程中通過自身代謝，將環(huán)境中含碳化合物通過一系列的反應(yīng)合成并分泌到細(xì)胞外的高分子、長鏈糖類聚合物。EPS 在生物膜中的比例占總有機(jī)物的50%～90%[13]。EPS 在微生物抵抗不良環(huán)境時發(fā)揮作用，助其存活[14]，具有改善腸道微生物的菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腸道健康，調(diào)節(jié)免疫功能，抗腫瘤及抗氧化等益生功能[15]。

目前研究主要集中在QS 系統(tǒng)對乳酸菌生物膜的形成，在研究QS 系統(tǒng)與生物膜的調(diào)控機(jī)制過程中發(fā)現(xiàn)QS 系統(tǒng)與細(xì)菌分泌EPS 在一定程度上存在某種聯(lián)系。吳榮[16]通過研究發(fā)現(xiàn)添加終濃度為60 μmol/L 的外源信號分子AI-2 時，植物乳桿菌5-4-1 各生長階段EPS 生成量均顯著提高。Smritikana 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，霍亂弧菌MO10 合成EPS 過程涉及群體感應(yīng)系統(tǒng)，該菌的群體感應(yīng)自誘導(dǎo)劑缺失會引起EPS 過度表達(dá)。楊維等[17]研究發(fā)現(xiàn)在不同濃度溴化呋喃酮作用下，單增李斯特菌EPS 含量均低于空白組，且隨著濃度的增加，EPS 含量逐漸減小。以上結(jié)果表明QS 系統(tǒng)對細(xì)菌EPS 合成有一定的影響，然而是否存在調(diào)控關(guān)系還需驗(yàn)證。

本研究首先通過測定發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）TG4-1-1 和乳酸片球菌（P.acidilactici）11-3不同培養(yǎng)時間EPS 分泌量和AI-2 活性，得出菌株分泌EPS 和AI-2 活性的變化規(guī)律；其次，采用添加外源AI-2 的方法，以兩株菌在外源AI-2 作用下生長量、菌體形態(tài)、EPS 分泌量以及微觀表面結(jié)構(gòu)的變化為指標(biāo)，研究信號分子AI-2 是否可以調(diào)控乳酸菌分泌EPS。最后，明確信號分子AI-2和乳酸菌產(chǎn)EPS 之間是否存在相關(guān)性，為LuxS/AI-2 群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控EPS 的研究提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）BB170、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）TG4-1-1、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）11-3 均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品生物技術(shù)團(tuán)隊(duì)提供。

1.2 試劑與材料

氯化鈉、七水合硫酸鎂、三氯乙酸，國藥化學(xué)集團(tuán)；透析袋（MD34，截留分子質(zhì)量為8 000～14 000 d），北京索萊寶科技有限公司；L-精氨酸、酸水解酪蛋白，Coolaber 公司；MRS 肉湯，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

HF-SAFE 1500 型生物安全柜、SMART-N 純水機(jī)，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；SX-500全自動高壓滅菌鍋，日本TOMY 公司；PB 10 型酸度計(jì)，德國Satorius 公司；5810 型高速低溫離心機(jī)，德國Eeppendorf 公司；Neofuge 18R 高速冷凍離心機(jī)，上海力申科學(xué)儀器有限公司；Free Zone真空冷凍干燥機(jī)，美國Laconco 公司；紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。BioTek Epoch 全波長酶標(biāo)儀，美國BioTek 公司；Perkin Elmer victor X 酶標(biāo)儀，美國Perkin Elmer 公司；TM4000 形桌上顯微鏡，日本株式會社日立高新技術(shù)那珂事業(yè)所。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌株不同生長階段EPS 產(chǎn)量的測定 將發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 以2%（體積分?jǐn)?shù)）接種比接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，在37℃下活化培養(yǎng)二代，將二代菌液制備成供試菌液[18]。將供試菌液以2%（體積分?jǐn)?shù)）接種比接種于新鮮的MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)0，4，7，10，13，16，19，22，25 h 后測定不同時間點(diǎn)菌株的生長量、EPS 產(chǎn)量、AI-2 活性。

1.4.1.1 EPS 的粗提取 EPS 的粗提取參照紀(jì)亞楠[19]的試驗(yàn)方法。

1.4.1.2 EPS 的測定 采用苯酚-硫酸法測定乳酸菌EPS 含量，取稀釋后的透析樣品200 μL，依次加入6%苯酚溶液200 μL，濃硫酸1 mL，搖勻，室溫放置30 min 使用酶標(biāo)儀測OD490nm值。將不同培養(yǎng)時間粗多糖的OD490nm代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中即可算出EPS 的含量。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以無水葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[20]。配制100 μg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，按表1 加入各種試劑，混勻，靜置30 min，以1 號管為空白對照，在490 nm處測定吸光度，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制Table 1 Standard curve drawing by phenol-sulfuric acid method

以糖含量（mg/L）為橫坐標(biāo)，吸光度（A490nm）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，回歸線性方程為Y=0.0112X-0.0064，R2=0.999。R2＞0.99，表示具有可行度和線性關(guān)系，R2值越接近1，吻合程度越高。

1.4.2 菌株不同生長階段AI-2 活性測定

1.4.2.1 無細(xì)胞發(fā)酵上清液的制備（cell-free fermentation supernatant，CFS）將試驗(yàn)菌株以1.4.1節(jié)的方法進(jìn)行培養(yǎng)，待測培養(yǎng)液8 000 r/min 離心5 min（4 ℃），使用0.22 μm 水系濾膜對上清液過濾除菌，即得到試驗(yàn)菌株的CFS。將哈維氏弧菌BB170 以2%（V/V）接種于AB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 代至OD600nm為0.9～1.1，4 ℃ 4 000 r/min 離 心10 min，使用0.22 μm 水系濾膜對上清液過濾除菌，即得到陽性對照。AB 培養(yǎng)基過濾除菌即得到陰性對照，MRS 培養(yǎng)基過濾除菌即得乳酸菌介質(zhì)對照。所取上清液與對照樣品于-80 ℃保存。

1.4.2.2 信號分子AI-2 活性的測定 將哈維氏弧菌BB170 接種到AB 培養(yǎng)基中，30 ℃100 r/min振蕩培養(yǎng)活化二代，以2%接種比培養(yǎng)3 代至OD600nm為0.9～1.1，按1 ∶5 000（V/V）將菌液和AB培養(yǎng)基混合，得到稀釋后約為105 CFU/mL 的哈維氏弧菌BB170 菌液。陽性對照為哈維氏弧菌BB170 的CFS，陰性對照為無菌的AB 培養(yǎng)基，介質(zhì)對照為無菌MRS 培養(yǎng)基。將待測樣品、陽性、陰性、介質(zhì)對照與稀釋后的哈維氏弧菌BB170 菌液以1 ∶100（V/V）進(jìn)行混合，30 ℃100 r/min 振蕩培養(yǎng)。在0～6 h 內(nèi)，每隔30 min 取200 μL 混合液在化學(xué)發(fā)光模式測定其熒光強(qiáng)度值。在陰性對照熒光強(qiáng)度值達(dá)到最低點(diǎn)時對各個樣品的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定，計(jì)算其相對熒光強(qiáng)度用以代表信號分子AI-2 的活性。計(jì)算公式如下：

待測樣品相對熒光強(qiáng)度=待測樣品的熒光強(qiáng)度值/介質(zhì)對照的熒光強(qiáng)度值[21]

1.4.3 外源信號分子AI-2 最佳添加濃度的確定 根據(jù)顧悅[22]的試驗(yàn)方法，完成了信號分子AI-2的體外合成。反應(yīng)體系為：1 mmol/L 的SAH 與1 mg/mL 的LuxS 和Pfs 蛋白在10 mmol/L 磷酸鈉緩沖液（pH 7.5）中，37 ℃水浴反應(yīng)1 h。使用10 ku超濾管以除去未反應(yīng)的蛋白，使用0.22 μm 水系濾膜過濾除菌，保藏于-80°C。利用埃爾曼試劑測定AI-2 濃度可達(dá)1.362 mmol/L，同時采用哈維氏弧菌BB170 生物發(fā)光法測得合成AI-2 的相對熒光強(qiáng)度可達(dá)139.350±0.384。

將外源信號分子AI-2 添加到MRS 培養(yǎng)基中至終濃度分別為50，100，150 μmol/L，將活化培養(yǎng)至二代的發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 按2%（V/V）接種比接入含有不同濃度外源AI-2 的MRS 培養(yǎng)基中作為試驗(yàn)組，將菌按2%（V/V）接入含有等體積pH 7.5 磷酸鈉緩沖液的MRS 培養(yǎng)基中作為對照組，測定AI-2 活性最高點(diǎn)時處理組生長量和AI-2 活性變化，測定EPS 產(chǎn)量最高點(diǎn)時生長量和EPS 產(chǎn)量變化，篩選出最佳外源AI-2 添加濃度便于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4.4 外源信號分子AI-2 對菌株的影響 將1.4.3 節(jié)中篩選得到的最佳濃度作為試驗(yàn)濃度，同時以未添加外源AI-2（0 μmol/L）為對照，分別培養(yǎng)0，4，7，10，13，16，19，22，25 h 后，測定外源AI-2對菌株TG4-1-1 和11-3 不同培養(yǎng)時間生長量、EPS 產(chǎn)量的影響。同時利用掃描電鏡觀察兩株菌培養(yǎng)13 h 的菌體形態(tài)以及培養(yǎng)22 h 的多糖冷凍干燥后的表面結(jié)構(gòu)。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，用SPSS19.0 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)時間EPS 產(chǎn)量和AI-2 活性的變化規(guī)律

2.1.1 發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3不同培養(yǎng)時間EPS 產(chǎn)量的變化規(guī)律 不同培養(yǎng)時間發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 EPS產(chǎn)量和生長量的變化規(guī)律如圖1 所示。由圖1a 可知，發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 的延滯期較短，培養(yǎng)4 h以后進(jìn)入對數(shù)生長期；13 h 以后開始進(jìn)入穩(wěn)定期，且穩(wěn)定期持續(xù)時間較長；培養(yǎng)16 h 時生長量達(dá)到最大（OD595nm=2.153±0.019），22 h 以后生長量逐漸降低進(jìn)入衰亡期。發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 不同時間點(diǎn)粗多糖產(chǎn)量差異較大，隨著培養(yǎng)時間延長，菌株粗多糖的產(chǎn)量呈逐漸上升的趨勢。0～4 h 為發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 EPS 合成的起始階段，4～13 h 內(nèi)是EPS 快速合成階段，13～22 h 進(jìn)入EPS 合成的穩(wěn)定期，培養(yǎng)22 h 后EPS 產(chǎn)量最高達(dá)到（195.863±1.643）mg/L，之后在25 h 時EPS 產(chǎn)量略有下降。由圖1b 可知菌株11-3 與菌株TG4-1-1 隨不同培養(yǎng)時間的生長量和EPS 產(chǎn)量的變化規(guī)律具有相似性，其在培養(yǎng)16 h 時OD595nm為2.061±0.022 達(dá)到最大，培養(yǎng)22 h 后EPS 產(chǎn)量為（125.179±1.458）mg/L 達(dá)到最大。說明菌株TG4-1-1 和11-3 從延滯期開始一直到穩(wěn)定期前期的生長量和EPS 產(chǎn)量都隨著時間的延長呈現(xiàn)大幅上升的趨勢，是因?yàn)榫暝谶@段時期內(nèi)生長旺盛導(dǎo)致其代謝產(chǎn)物也增多；當(dāng)菌株的生長量穩(wěn)定時，EPS 產(chǎn)量在小幅增加；當(dāng)菌株進(jìn)入衰亡期時，EPS 產(chǎn)量也隨之減少，推測可能是由于培養(yǎng)后期培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)不充分，菌體會分解一定量自身所產(chǎn)EPS，也可能是菌體發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶如糖苷水解酶將EPS 降解，導(dǎo)致后期出現(xiàn)EPS 產(chǎn)量減少現(xiàn)象[23]。

圖1 菌株不同培養(yǎng)時間的生長量和EPS 產(chǎn)量的關(guān)系Fig.1 Growth and EPS yield of strains at different culture time

2.1.2 發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3不同培養(yǎng)時間AI-2 活性的變化規(guī)律 利用哈維氏弧菌BB170 生物發(fā)光法對發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 培養(yǎng)不同時間下產(chǎn)AI-2 活性進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖2a，發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1隨著培養(yǎng)時間的延長AI-2 活性逐漸增強(qiáng)，達(dá)到最強(qiáng)后又減弱。在0～10 h 內(nèi)隨著時間的延長發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 的生長量（OD595nm）逐漸增大、AI-2活性逐漸增強(qiáng)；菌株在10 h 時AI-2 活性達(dá)到最大；之后菌株的生長量還在逐漸上升直至穩(wěn)定后又略有下降，在此期間菌株AI-2 活性則一直呈現(xiàn)下降趨勢。從圖2b 可知乳酸片球菌11-3 所產(chǎn)AI-2 活性隨著培養(yǎng)時間的延長在10 h 時達(dá)到最強(qiáng)，之后AI-2 活性減弱。發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 均在10 h 時所產(chǎn)AI-2 活性最強(qiáng)，這與其它研究證實(shí)細(xì)菌信號分子AI-2 產(chǎn)生的最強(qiáng)時期一般發(fā)生在對數(shù)末期和穩(wěn)定初期[24-25]的結(jié)果一致；后期AI-2 活性減弱可能與AI-2 不穩(wěn)定易分解的性質(zhì)有關(guān)[26]，也可能是因?yàn)锳I-2 附著在菌體細(xì)胞膜上導(dǎo)致其環(huán)境中減少[27]。

圖2 菌株不同培養(yǎng)時間的生長量和AI-2 活性的關(guān)系Fig.2 Growth and AI-2 activity of strains at different culture time

2.1.3 發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3不同培養(yǎng)時間EPS 和AI-2 的關(guān)系 從圖1 和圖2 可以看出，在0～10 h 試驗(yàn)菌株的EPS 產(chǎn)量、AI-2 活性隨時間的延長而呈現(xiàn)上升的趨勢。10 h 之后試驗(yàn)菌株的AI-2 活性開始逐漸下降，可能是被菌株內(nèi)化吸收后參與調(diào)控某些生理活動[28]，如EPS的產(chǎn)生，與此同時EPS 產(chǎn)量仍在不斷積累，因此可證明這一猜測合理。

2.2 最佳外源信號分子AI-2 添加量的確定

根據(jù)前期試驗(yàn)得出發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 均在培養(yǎng)10 h 時AI-2 活性最強(qiáng)以及22 h 時EPS 產(chǎn)量最高。為篩選出發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 最佳的外源信號分子AI-2 添加濃度，選取試驗(yàn)菌株10 和22 h 測定菌株生長量、信號分子AI-2 活性和EPS 產(chǎn)量。

2.2.1 不同濃度外源信號分子AI-2 對菌株生長量的影響 加入不同濃度外源信號分子AI-2 對發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 分別培養(yǎng)10 h 和22 h 的生長量的影響如圖3 所示。從圖3 中可以看出添加外源信號分子AI-2 對菌株TG4-1-1 和11-3 的生長量有一定的影響。添加終濃度為0，50 μmol/L 和100 μmol/L 時，發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌 11-3 在10，22 h 的OD595nm之間均無差異，表明0～100 μmol/L 外源信號分子AI-2 對該菌株的生長量均無顯著影響（P＞0.05）；而添加濃度為150 μmol/L 時，發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 在10，22 h 的OD595nm則顯著降低（P＜0.05），表明兩株菌的生長量受到明顯抑制。隨著外源信號分子AI-2 的濃度增加，其對菌株TG4-1-1 和11-3 10 h 和22 h生長量的影響逐漸顯著，說明信號分子的作用范圍受其濃度抑制，當(dāng)超過一定范圍后其作用效果受到影響[29]。出現(xiàn)這樣的結(jié)果可能是因?yàn)闈舛葹?50 μmol/L 時達(dá)到了菌體感受識別AI-2 的閾值，使得菌株的生長受到了影響造成其生長量低于未添加組。

圖3 不同濃度外源信號分子AI-2 對菌株10，22 h 生長量的影響Fig.3 Effects of different concentrations of exogenous AI-2 on the growth of strains at 10 and 22 h

2.2.2 不同濃度外源信號分子AI-2 對菌株22h EPS 產(chǎn)量的影響 不同濃度外源信號分子AI-2對發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 培養(yǎng)22 h 時EPS 產(chǎn)量的影響如圖4 所示。由圖可知，不同濃度添加外源信號分子AI-2 對發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 EPS 產(chǎn)量有一定的影響。添加終濃度分別為0，50，100 μmol/L 和150 μmol/L 外源信號分子AI-2 后提取測定菌株TG4-1-1 的EPS 產(chǎn)量分別為（194.077±1.174），（197.119±1.380），（202.012±1.172）和（176.964±2.030）mg/L，菌株11-3 的 EPS 產(chǎn)量分別為（122.054±2.770），（127.262±1.034），（132.768±1.021）mg/L 和（114.167±2.011）mg/L，外源信號分子AI-2 終濃度為100 μmol/L 時，兩株菌EPS 產(chǎn)量均得到促進(jìn)并顯著高于未添加組（P＜0.05）；當(dāng)外源信號分子AI-2 終濃度為150 μmol/L 時，兩株菌EPS 產(chǎn)量則受到抑制，顯著低于未添加組（P＜0.05）。

當(dāng)外源AI-2 終濃度在0～100 μmol/L 范圍內(nèi)，隨著外源信號分子AI-2 濃度增加，EPS 產(chǎn)量也略有增高，由此推測信號分子AI-2 的添加可能增強(qiáng)了乳酸菌的EPS 合成相關(guān)的生理活動，進(jìn)而提高了菌株產(chǎn)EPS 的能力。但外源信號分子AI-2濃度為150 μmol/L 時因其影響菌株TG4-1-1 和11-3 的生長量從而可能影響了EPS 的產(chǎn)量。

2.2.3 不同濃度外源信號分子AI-2 對菌株10 h AI-2 活性的影響 不同濃度外源信號分子AI-2對發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 培養(yǎng)10 h 時所產(chǎn)AI-2 活性的影響見圖5。從圖5a 中可以看出不同濃度添加外源信號分子AI-2 對菌株TG4-1-1 AI-2 活性有一定的影響。與未添加外源AI-2（0 μmol/L）相比，當(dāng)外源信號分子AI-2終濃度為50 μmol/L 和100 μmol/L 時，發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 所產(chǎn)AI-2 活性都得到增強(qiáng)，且100 μmol/L 時菌株所產(chǎn)AI-2 活性顯著高于其它濃度（P＜0.05）；但當(dāng)外源信號分子AI-2 終濃度增大到150 μmol/L 時，菌株所產(chǎn)AI-2 的活性被減弱，顯著低于未添加時的AI-2 活性（P＜0.05）。從圖5b中可知添加50，100 和150 μmol/L 外源信號分子AI-2 均對乳酸片球菌11-3 10 h 時AI-2 活性有增強(qiáng)作用，且增強(qiáng)作用顯著（P＜0.05）；100 μmol/L外源信號分子AI-2 對菌株11-3 AI-2 活性的增強(qiáng)作用最好。出現(xiàn)這樣的結(jié)果可能是AI-2 對菌株的各種生理調(diào)控呈現(xiàn)濃度依賴，當(dāng)AI-2 濃度超出菌株的識別閾值范圍，導(dǎo)致部分AI-2 轉(zhuǎn)入了菌體細(xì)胞內(nèi)，對菌株的生理活動起到了負(fù)調(diào)控。

圖5 不同濃度外源信號分子AI-2 對菌株AI-2 活性的影響Fig.5 Effects of different concentrations of exogenous AI-2 on AI-2 activity of strain cultured for 10 h

綜合上述結(jié)果得出外源信號分子AI-2 終濃度為100 μmol/L 對發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 在10 h 的AI-2 活性以及22 h 的EPS 產(chǎn)量均有一定的促進(jìn)作用，且促進(jìn)作用顯著（P＜0.05）。因此，選擇100 μmol/L 的信號分子AI-2 為用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 100 μmol/L 外源信號分子AI-2 對菌株的影響

以100 μmol/L 為最終添加濃度，研究發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 不同培養(yǎng)時間下生長量、EPS 產(chǎn)量和AI-2 活性變化以探討信號分子AI-2 對菌株TG4-1-1 和11-3 產(chǎn)EPS 的調(diào)控。

2.3.1 外源信號分子AI-2 對菌株不同培養(yǎng)時間生長量的影響 外源信號分子AI-2 終濃度為100 μmol/L 對發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 不同培養(yǎng)時間生長量的影響見圖6。從圖6 中可以得出，與未添加組（0 μmol/L）相比，外源信號分子AI-2 終濃度為100 μmol/L 時，菌株TG4-1-1 和11-3 各階段的生長量（OD595nm）均未受到顯著影響（P＞0.05），且進(jìn)入各生長階段的時間也與未添加的保持一致，說明100 μmol/L 的外源信號分子AI-2 對菌株的生長無顯著影響。

圖6 外源信號分子AI-2 對菌株不同培養(yǎng)時間生長量的影響Fig.6 Effect of exogenous AI-2 on the growth of strains at different culture time

2.3.2 外源信號分子AI-2 對菌株不同培養(yǎng)時間EPS 產(chǎn)量的影響 外源信號分子AI-2 終濃度為100 μmol/L 時對發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 不同培養(yǎng)時間EPS 產(chǎn)量的影響見圖7。由圖可知，發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 在添加與不添加100 μmol/L 外源信號分子AI-2 的培養(yǎng)基中不同培養(yǎng)時間后產(chǎn)EPS 的變化趨勢具有一致的相似性。與未添加外源AI-2（0 μmol/L）相比，100 μmol/L 外源信號分子AI-2 對發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 不同培養(yǎng)時間的EPS 產(chǎn)量均在一定程度上起到促進(jìn)作用，產(chǎn)量均有所提高，相較于其它階段16，19，22 h 的EPS 產(chǎn)量得到了顯著提高（P＜0.05）。從圖7b 可知，100 μmol/L 外源信號分子AI-2 同樣對乳酸片球菌11-3 13～22 h 各時間點(diǎn)EPS 產(chǎn)量均有顯著促進(jìn)作用（P＜0.05）。以上結(jié)果表明100 μmol/L 外源信號分子AI-2 均對兩株菌產(chǎn)EPS 有促進(jìn)作用，可能是因?yàn)橥庠葱盘柗肿覣I-2 促進(jìn)菌株參與合成EPS 的相關(guān)基因的表達(dá)，但是本試驗(yàn)中并沒有對測定與EPS 合成相關(guān)基因的表達(dá)量，具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。Gu 等[30]研究發(fā)現(xiàn)添加外源信號分子AI-2 后，促進(jìn)了乳酸菌EPS 的產(chǎn)生和抑制了多糖水解的相關(guān)基因lamC 和ftsH 的表達(dá)。

圖7 外源AI-2 對菌株不同培養(yǎng)時間EPS 產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of exogenous AI-2 on EPS production of strains at different culture time

2.3.3 外源信號分子AI-2 對菌體形態(tài)的影響 發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 培養(yǎng)13 h后菌體放大5 000 倍的掃描電鏡圖見圖8。由圖8a可知，未添加外源AI-2 時，發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1的菌體形態(tài)比較完整，個別菌表面不平整，菌體邊緣比較圓滑，菌體之間空隙較多、分布松散；由圖8b 可知，添加終濃度為100 μmol/L 外源AI-2 時，發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 的菌體形狀更加規(guī)則、形態(tài)更加豐滿、表面更加光滑，菌體之間的空隙較小使得其聚集生長，表明添加外源AI-2 有助于增加菌株產(chǎn)黏能力；菌體細(xì)胞體積相對變大，可能是因?yàn)榫w的胞外物質(zhì)包裹導(dǎo)致的。由圖8c、8d 可知乳酸片球菌11-3 的菌體形態(tài)也有相類似的變化。以上結(jié)果說明。兩株試驗(yàn)菌株均在添加100 μmol/L外源信號分子AI-2 時表現(xiàn)出明顯的聚集現(xiàn)象，進(jìn)一步說明AI-2 可促進(jìn)EPS 的產(chǎn)生。

圖8 外源AI-2 對菌株菌體形態(tài)的影響Fig.8 The effect of exogenous AI-2 on bacterial morphology

2.3.4 外源信號分子AI-2 對多糖形態(tài)的影響 發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 在添加外源信號分子AI-2 后培養(yǎng)22 h 時所產(chǎn)EPS 冷凍干燥后的多糖表面結(jié)構(gòu)見圖9。從圖9a、9c 中可看出發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 所產(chǎn)的EPS 結(jié)構(gòu)比較疏松，排列分布許多小孔表面粗糙，具有片狀和管狀相結(jié)合的穩(wěn)定和緊湊的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有的具有薄片緊的表面，有的具有褶皺而緊密的表面。添加終濃度為100 μmol/L 的外源信號分子AI-2 時，對兩株菌多糖表面沒有明顯的影響。EPS 的微觀結(jié)構(gòu)和表面形貌的差異很可能是由于樣品提取、制備、純化和干燥方法的不同以及EPS 的組成和結(jié)構(gòu)的不同造成的[31]。

圖9 外源信號分子AI-2 對菌株多糖形態(tài)的影響Fig.9 Effect of exogenous AI-2 on polysaccharide morphology of strain EPS

3 結(jié)論

發(fā)酵乳桿菌TG4-1-1 和乳酸片球菌11-3 均在10 h 時AI-2 活性最強(qiáng)，22 h 時EPS 產(chǎn)量均達(dá)到最高；添加50 和100 μmol/L 外源AI-2 對兩株試驗(yàn)菌株的生長量無明顯影響，但EPS 產(chǎn)量隨AI-2 濃度的增加而增加，當(dāng)濃度為150 μmol/L時，菌株的生長量和EPS 產(chǎn)量反而受到抑制；100 μmol/L 外源信號分子AI-2 對試驗(yàn)菌株的生長量無影響，但卻可以影響菌株的表面形態(tài)并能顯著促進(jìn)不同生長階段EPS 的產(chǎn)量。綜上所述，一定濃度的外源信號分子AI-2 對乳酸菌EPS 的產(chǎn)生具有調(diào)控作用，為進(jìn)一步深入研究LuxS/AI-2 QS 系統(tǒng)調(diào)控EPS 的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。