劉洋，葉小梅，苗曉，王成成，賈昭炎，曹春暉，奚永蘭，3

（1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 南京 210014；2 江蘇大學(xué)農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014；4 徐州市環(huán)能生態(tài)技術(shù)有限公司，江蘇 徐州 221000）

我國提出“碳達(dá)峰碳中和”（雙碳）目標(biāo)為我國農(nóng)村生活垃圾處理提出了新的要求。在對農(nóng)村生活垃圾進(jìn)行處理時(shí)，還需考慮碳排放和碳減排問題，為早日實(shí)現(xiàn)“雙碳”目標(biāo)做出貢獻(xiàn)。農(nóng)村生活垃圾是制約我國農(nóng)村環(huán)境改善的重要因素，每年約2.94 億噸的農(nóng)村生活垃圾需要處理[1]。厭氧發(fā)酵是處理農(nóng)村生活垃圾有機(jī)部分極具潛力的技術(shù)[2]，在處理固廢的同時(shí)生產(chǎn)清潔能源沼氣，對碳減排的貢獻(xiàn)同樣潛力巨大[3]。因此進(jìn)一步提高厭氧發(fā)酵效率，深挖厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷潛力是必要的。

提高厭氧發(fā)酵罐內(nèi)總固體（total solid，TS）含量可以提高池容產(chǎn)氣率，降低沼液產(chǎn)出，具有加熱能耗低和沼渣后處理容易等優(yōu)點(diǎn)，因此近年來TS含量較高的干式厭氧發(fā)酵技術(shù)受到更多關(guān)注[4-6]。干式厭氧發(fā)酵一般指TS≥20%（樣品烘干后重量/樣品重量）的厭氧發(fā)酵[7]，農(nóng)村有機(jī)生活垃圾的含水率在80%（樣品水分重量/樣品重量）左右[8]，可直接用于干式厭氧發(fā)酵而不需加水調(diào)節(jié)TS。提高發(fā)酵罐內(nèi)TS 含量會直接導(dǎo)致系統(tǒng)內(nèi)部揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids，VFAs）和氨氮快速積累，對產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制，破壞發(fā)酵系統(tǒng)平衡[9-12]。本文作者課題組先前的研究表明農(nóng)村有機(jī)生活垃圾厭氧發(fā)酵TS含量達(dá)到8%已經(jīng)出現(xiàn)氨氮抑制[13]，TS達(dá)到20%時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重氨氮抑制[14]。解決氨氮抑制包括接種物馴化、共發(fā)酵和氨氮吸附材料等方法，均對高濃度氨氮抑制有顯著效果[8,15-16]，其中共發(fā)酵是增加農(nóng)業(yè)廢棄物厭氧發(fā)酵甲烷產(chǎn)量的最常用方法[17]。畜禽糞便作為農(nóng)業(yè)碳排放的主要來源之一，直接對其進(jìn)行厭氧發(fā)酵由于其產(chǎn)沼氣潛力低而不具有經(jīng)濟(jì)性。其中牛糞具有提高厭氧發(fā)酵系統(tǒng)緩沖能力，緩解氨氮抑制的作用[18]，同時(shí)其高碳含量可以作為生活垃圾等富氮原料干式厭氧發(fā)酵的共發(fā)酵底物[19]。因而將農(nóng)村有機(jī)生活垃圾與牛糞進(jìn)行干式厭氧共發(fā)酵的研究是有意義的，可以通過兩種原料的性質(zhì)互補(bǔ)，提高產(chǎn)甲烷效率。同時(shí)對農(nóng)村有機(jī)生活垃圾的研究多集中在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，其工程化應(yīng)用研究尚少。

本文通過對農(nóng)村有機(jī)生活垃圾和牛糞進(jìn)行1m3規(guī)模的中溫干式厭氧共發(fā)酵中試試驗(yàn)，考察了農(nóng)村有機(jī)生活垃圾在中試規(guī)模下的產(chǎn)甲烷、氨氮、VFAs 和微生物群落的特征，以期獲得農(nóng)村有機(jī)生活垃圾氨脅迫下中試規(guī)模的發(fā)酵特征和潛力，給農(nóng)村有機(jī)生活垃圾沼氣工程建設(shè)提供技術(shù)支持，為農(nóng)村有機(jī)生活垃圾無害化處理和“雙碳”目標(biāo)實(shí)現(xiàn)做出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參考江蘇省徐州市沛縣大屯街道大王莊生活垃圾分類處置中心的組分[20]，農(nóng)村有機(jī)生活垃圾由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食堂的餐廚垃圾尾菜、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動物科學(xué)試驗(yàn)基地的蔬菜秸稈和農(nóng)作物秸稈粉碎混合而成，混合后采用粉碎機(jī)粉碎在-20℃保存。執(zhí)行試驗(yàn)時(shí)至南京優(yōu)然牧業(yè)有限責(zé)任公司獲取鮮牛糞。農(nóng)村有機(jī)生活垃圾和牛糞的理化性質(zhì)見表1。接種物取自徐州市環(huán)能生態(tài)技術(shù)有限公司，在發(fā)酵罐中使用農(nóng)村有機(jī)生活垃圾37℃±1℃馴化后使用。

表1 底物理化性質(zhì)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置發(fā)酵罐內(nèi)TS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，生活垃圾與牛糞濕重比為3∶1，生活垃圾共進(jìn)料330kg，牛糞進(jìn)料110kg，揮發(fā)性固體含量（volatile solid，VS）為56.354kg。進(jìn)料完成后將農(nóng)村有機(jī)生活垃圾、牛糞與接種物攪拌均勻，取樣測得發(fā)酵罐內(nèi)TS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.94%。厭氧發(fā)酵裝置為太陽能厭氧罐系統(tǒng)（徐州市環(huán)能生態(tài)技術(shù)有限公司，徐州），容積為1m3，臥式發(fā)酵罐，初始pH 7.5，37℃±1℃中溫發(fā)酵，發(fā)酵周期為130天。發(fā)酵裝置配置有甲烷含量檢測器，實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)可自動上傳至云端，沼氣產(chǎn)量采用燃?xì)獗碛?jì)量，通過監(jiān)控實(shí)時(shí)傳輸數(shù)據(jù)。每10天取樣測VFAs濃度和氨氮濃度，在發(fā)酵第0 天（B20_1）、第65 天（B20_2）和第130 天（B20_3）取樣進(jìn)行微生物群落分析。

1.3 分析方法

TS 和VS 采用APHA 的方法[21]。試驗(yàn)樣品有機(jī)碳測定采用稀釋熱法，全氮測定采用凱氏定氮法[22]。pH 使用pH 計(jì)（LAQ UAtwin-pH-22，日本）直接測定。VFAs 由氣相色譜儀測定（島津GC-2014，日本），色譜柱為：DB-FFAP 30m×0.25mm 0.25μm，F(xiàn)ID檢測器，氮?dú)鉃檩d氣，進(jìn)樣口溫度為250℃，F(xiàn)ID溫度為300℃，分流比為1∶10，柱箱升溫程序?yàn)椋合仍?00℃下保持5min，然后以10℃/min速度升到250℃，保持312min，進(jìn)樣量為1μL[13]。氨氮的測定采用氨氮快速測定儀（5B-6D，連華）。微生物群落分析取樣時(shí)在發(fā)酵罐出料口直接出料取發(fā)酵混合物，后離心取樣品固體部分，采用干冰保溫箱寄送至上海美吉生物科技有限公司進(jìn)行測序系列工作。微生物群落分析包括DNA 抽提、設(shè)計(jì)合成引物接頭、PCR 擴(kuò)增、構(gòu)建文庫和Ⅰllumina 測序。分析完成后在美吉生物云平臺進(jìn)行分析（https://cloud.majorbio.com）。古菌的引物名稱為524F10extF_Arch958RmodR，細(xì)菌的引物名稱為338F_806R。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)氣量分析

本批次中試試驗(yàn)共進(jìn)行130天，發(fā)酵過程中日沼氣產(chǎn)量和累積沼氣產(chǎn)量變化如圖1所示。發(fā)酵系統(tǒng)啟動迅速，第2天出現(xiàn)最大峰值。同時(shí)由于發(fā)酵時(shí)間持續(xù)較長，發(fā)酵過程中出現(xiàn)多次峰值，可能是由于發(fā)酵過程中季節(jié)跨度較大，環(huán)境溫度變化導(dǎo)致發(fā)酵罐內(nèi)溫度出現(xiàn)波動。本試驗(yàn)采用的接種物為中溫發(fā)酵所用，因此溫度變化可能導(dǎo)致不同時(shí)間微生物生命活動水平不同，造成沼氣產(chǎn)量的波動。發(fā)酵結(jié)束時(shí)累積沼氣產(chǎn)量為70.585m3，單位VS 沼氣產(chǎn)量達(dá)到了1.253m3/kg，其沼氣產(chǎn)率遠(yuǎn)超實(shí)驗(yàn)室小試的最大值（0.509m3/kg和0.633m3/kg）[2,8]。

圖2為農(nóng)村有機(jī)生活垃圾干式厭氧共發(fā)酵過程中甲烷含量及甲烷產(chǎn)量變化。甲烷含量的高低可以直觀判斷厭氧發(fā)酵系統(tǒng)運(yùn)行狀況[23]，一般認(rèn)為甲烷體積分?jǐn)?shù)大于50%發(fā)酵系統(tǒng)處于正常運(yùn)行狀態(tài)[23-24]。發(fā)酵開始后甲烷含量迅速上升，隨后維持在70%小幅度波動。發(fā)酵第63 天甲烷含量出現(xiàn)了降低，在57%穩(wěn)定3天后又上升至70%左右。此次波動與該時(shí)間段內(nèi)氣溫降低有關(guān)，較低的氣溫影響太陽能系統(tǒng)傳熱效率，需要更長的時(shí)間維持發(fā)酵罐內(nèi)溫度，造成罐內(nèi)溫度較低。高甲烷含量可能與發(fā)酵過程中較高的氨氮濃度有關(guān)，在未達(dá)到氨氮抑制濃度之前，更高的氨氮濃度會導(dǎo)致更高的甲烷含量[7]。發(fā)酵結(jié)束時(shí)單位VS 甲烷產(chǎn)量達(dá)到了0.815m3/kg，對 比 已 有 文 獻(xiàn)[25-26]報(bào) 道（0.490～0.737m3/kg、0.633m3/kg）的生活垃圾均處于領(lǐng)先水平。這與本次中試試驗(yàn)采用的厭氧發(fā)酵設(shè)備有關(guān)，發(fā)酵罐為臥式厭氧發(fā)酵罐，罐內(nèi)的攪拌裝置可以提供更加充分的攪拌效果，增強(qiáng)發(fā)酵罐內(nèi)傳質(zhì)效率，最終提高甲烷產(chǎn)量。

2.2 氨氮濃度變化分析

氨氮可用作細(xì)胞生長所需氮源，但過多的氨氮在發(fā)酵過程中積累會對甲烷合成產(chǎn)生抑制作用[27-29]。分析農(nóng)村有機(jī)生活垃圾干式厭氧共發(fā)酵過程中氨氮濃度變化，結(jié)合甲烷產(chǎn)生情況可以判斷發(fā)酵系統(tǒng)的穩(wěn)定性。圖3為厭氧發(fā)酵過程中氨氮濃度變化。發(fā)酵過程氨氮濃度整體在4200～5200mg/L范圍內(nèi)變化，氨氮濃度顯著高于已有報(bào)道厭氧發(fā)酵過程中的抑制閾值[30-31]。

圖3 氨氮濃度變化

而穩(wěn)定于70%的甲烷含量和累積0.815m3/kg的甲烷產(chǎn)量說明發(fā)酵系統(tǒng)在高效運(yùn)行，該氨氮濃度并未對系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用。本試驗(yàn)發(fā)酵系統(tǒng)始終處于較高的氨氮環(huán)境中，其甲烷產(chǎn)量說明系統(tǒng)是具有高氨氮耐受能力的，產(chǎn)甲烷菌沒有因?yàn)楦甙钡獫舛榷罅克劳?，這可能與本次發(fā)酵所采用的優(yōu)質(zhì)接種物有關(guān)。接種物使用農(nóng)村有機(jī)生活垃圾進(jìn)行馴化后具有較強(qiáng)的氨氮耐受能力，較高的氨氮濃度為細(xì)菌生命活動提供充足的氮源，使得產(chǎn)甲烷菌始終保持較高的活性和數(shù)量，為生產(chǎn)甲烷提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

2.3 VFAs濃度變化分析

VFAs主要在厭氧發(fā)酵過程水解酸化階段產(chǎn)生，水解酸化階段產(chǎn)生更多的VFAs 說明對發(fā)酵底物的分解更加徹底，當(dāng)VFAs 濃度超過發(fā)酵系統(tǒng)閾值后發(fā)酵系統(tǒng)失衡，產(chǎn)甲烷菌活性被抑制，系統(tǒng)發(fā)生酸化[32]。圖4為農(nóng)村有機(jī)生活垃圾干式厭氧共發(fā)酵過程中的VFAs濃度變化。圖中可以看出，發(fā)酵前10天VFAs 濃度處于上升階段，發(fā)酵主要處于快速水解和酸化階段，大量的有機(jī)物被細(xì)菌降解為VFAs。高濃度的VFAs 往往伴隨著酸化，本次試驗(yàn)中甲烷含量和產(chǎn)量都處于較高的范圍內(nèi)變化表明該濃度的VFAs并未對產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生脅迫作用。較高的VFAs濃度也說明對農(nóng)村有機(jī)生活垃圾含有的難降解的纖維素類物質(zhì)可能得到了更充分的降解，最終提高甲烷產(chǎn)量。達(dá)到峰值后VFAs 濃度開始下降，甲烷含量也快速趨于穩(wěn)定，表明產(chǎn)甲烷菌在正常工作，將利用大量的VFAs生產(chǎn)甲烷。

圖4 VFAs濃度變化

2.4 微生物群落變化

厭氧發(fā)酵過程中3 個(gè)階段分別由特定的水解菌、產(chǎn)酸菌和產(chǎn)甲烷菌群介導(dǎo)，如果3個(gè)階段失衡則會出現(xiàn)嚴(yán)重的酸化和氨氮抑制等問題，最終導(dǎo)致無法正常產(chǎn)甲烷[33-34]。農(nóng)村有機(jī)生活垃圾干式厭氧共發(fā)酵中試各階段微生物群落組成變化如圖5所示。

圖5 微生物群落結(jié)構(gòu)變化

古菌在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)顯示，干式厭氧發(fā)酵過程中甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）的相對豐度遠(yuǎn)高于其他菌屬，在發(fā)酵的3個(gè)階段其相對豐度均超過80%。啟動階段Methanosarcina的絕對優(yōu)勢地位說明馴化的接種物具有良好的產(chǎn)甲烷微生物環(huán)境，且為馴化過程中成長起來的適宜進(jìn)行農(nóng)村有機(jī)生活垃圾厭氧發(fā)酵的菌。運(yùn)行階段和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)相對豐度仍超過80%，說明馴化的接種物完美適配農(nóng)村有機(jī)生活垃圾干式厭氧共發(fā)酵中試。

細(xì)菌的門分類水平顯示厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度3個(gè)階段均超過77%，最高為啟動階段的85.39%，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)為83.58%。發(fā)酵過程中出現(xiàn)了輕微波動，但在發(fā)酵系統(tǒng)中仍處于絕對優(yōu)勢地位，可以保證有充足的細(xì)菌環(huán)境將有機(jī)物代謝成酸，供產(chǎn)甲烷菌利用生產(chǎn)甲烷。擬桿菌門（Bacteroidota）從啟動階段的3.87%增長至運(yùn)行階段的13.44%，發(fā)酵過程中Firmicutes 相對豐度的輕微降低與Bacteroidota 的增長有關(guān)。Bacteroidota 可以分泌多種細(xì)胞外水解酶，將葡萄糖、淀粉等轉(zhuǎn)化為乙酸、丁酸、H2和CO2等[35]，同樣利于水解酸化階段的充分進(jìn)行。

2.5 韋恩圖分析

韋恩圖可以直觀對比中試試驗(yàn)過程中不同階段共有物種和獨(dú)有物種，古菌和細(xì)菌在OTU 水平的韋恩圖分別如圖6 所示。3 個(gè)時(shí)間段的古菌在OTU水平上有87.50%的菌是共有的，表明古菌在發(fā)酵過程中保持較高的相似性，較高的相似性表明發(fā)酵系統(tǒng)比較穩(wěn)定，馴化的接種物發(fā)揮作用。啟動階段和運(yùn)行階段有1種菌共有，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)有2種菌獨(dú)有。這表明發(fā)酵前后微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒有其他雜菌生長影響與產(chǎn)甲烷菌形成競爭關(guān)系，為厭氧發(fā)酵的高效進(jìn)行提供保障。細(xì)菌在OTU水平3個(gè)階段共有核心物種占51.57%，相似性較古菌降低，這是由于在該水平下細(xì)菌物種較多，3個(gè)階段均超過了800，更多的物種帶來更多的差異性。古菌的多樣性則較低，3個(gè)階段為22～23。這可能是在高氨環(huán)境下造成的，能正常進(jìn)行生命活動的古菌種類較少，但其適應(yīng)了高氨環(huán)境，可以正常生產(chǎn)甲烷。發(fā)酵過程中3個(gè)階段的菌種類較接近，表明厭氧發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)細(xì)菌群落穩(wěn)定，厭氧發(fā)酵各階段功能菌群在適宜的環(huán)境發(fā)揮作用。

圖6 古菌和細(xì)菌在OTU水平韋恩圖

微生物群落分析表明，農(nóng)村有機(jī)生活垃圾干式厭氧共發(fā)酵中試試驗(yàn)中水解、酸化和產(chǎn)甲烷階段都有優(yōu)勢菌存在，生長情況良好，Methanosarcina和Firmicutes 分別為古菌和細(xì)菌的絕對優(yōu)勢菌。這為發(fā)酵生產(chǎn)甲烷提供了極佳的微生物環(huán)境，實(shí)現(xiàn)單位VS累積甲烷產(chǎn)量遠(yuǎn)高于已有報(bào)道。

綜上，農(nóng)村有機(jī)生活垃圾干式厭氧發(fā)酵中試試驗(yàn)過程中產(chǎn)氣情況、VFAs 濃度、氨氮濃度和微生物變化情況表明，此次發(fā)酵試驗(yàn)成功進(jìn)行。發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)部氨氮濃度處于高值，高于一般文獻(xiàn)所報(bào)道的產(chǎn)生抑制作用的閾值。在高氨環(huán)境中，發(fā)酵系統(tǒng)的甲烷體積分?jǐn)?shù)在70%作用，且累積甲烷產(chǎn)量達(dá)到了新的高度。說明此次干式厭氧發(fā)酵試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)合理，通過共發(fā)酵，專用接種物馴化和傳質(zhì)效率較高的太陽能發(fā)酵罐共同作用，使得發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)微生物比較契合農(nóng)村有機(jī)生活垃圾等高有機(jī)質(zhì)含量原料。共發(fā)酵使得發(fā)酵系統(tǒng)具有更高的緩沖能力；接種物馴化使得細(xì)菌保障水解更徹底，為產(chǎn)甲烷提供更充分底物，產(chǎn)甲烷古菌具有更高的耐氨能力，在高氨環(huán)境中保持生命活動，持續(xù)利用前階段底物生產(chǎn)甲烷；傳質(zhì)效率更高的發(fā)酵罐攪拌更充分，保證發(fā)酵底物與微生物接觸更加充分，防止局部酸化。以上方式共同保障發(fā)酵系統(tǒng)平穩(wěn)運(yùn)行。同時(shí)此次中試試驗(yàn)持續(xù)130天，充分挖掘了農(nóng)村有機(jī)生活垃圾的產(chǎn)氣潛力，這也解釋了其最終產(chǎn)氣量領(lǐng)先于已有研究。

3 結(jié)論

對農(nóng)村有機(jī)生活垃圾進(jìn)行了干式厭氧共發(fā)酵中試試驗(yàn)，累積甲烷產(chǎn)量達(dá)到了0.815m3/kg，相較于已有文獻(xiàn)報(bào)道處于領(lǐng)先水平。發(fā)酵過程VFAs 濃度呈現(xiàn)先增長后降低的趨勢，氨氮濃度變化穩(wěn)定，未出現(xiàn)酸化和氨氮抑制現(xiàn)象。微生物群落結(jié)構(gòu)分析表明此次干式厭氧發(fā)酵中試系統(tǒng)的微生物生長環(huán)境良好，Methanosarcina和Firmicutes分別為古菌和細(xì)菌的絕對優(yōu)勢菌群，發(fā)酵各階段達(dá)到了平衡。甲烷產(chǎn)量較高中試規(guī)模的干式厭氧發(fā)酵試驗(yàn)為農(nóng)村有機(jī)生活垃圾沼氣工程建設(shè)提供了有效的數(shù)據(jù)支持。