■ 陳建福

（1.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院石油化工學(xué)院，福建漳州363000；2.福建省精細(xì)化工應(yīng)用技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，福建漳州363000）

虎尾草（Chloris virgataSw.）又名盤草、棒錘草等，為禾本科一年生草本植物[1]。虎尾草種群生態(tài)位較寬，為農(nóng)田常見(jiàn)的雜草之一，在全國(guó)各地均有分布[2-3]?；⑽膊萸o葉柔軟、營(yíng)養(yǎng)豐富，是放牧家畜重要的飼草來(lái)源之一[4]。另外，虎尾草還是鹽堿地的先鋒植物之一，在改良?jí)A化荒地和堿化草原中具有重要的作用。目前，虎尾草的研究主要集中在分類、生態(tài)應(yīng)用、抗鹽堿性等[5]，關(guān)于虎尾草有效成分提取工藝的研究還較少。多糖是一種存在于動(dòng)植物體內(nèi)、由多個(gè)單糖聚合而成的天然生物活性大分子，因其具有多種活性功能而成為研究的熱點(diǎn)。目前多糖提取方法主要有溶劑提取、微波輔助、超聲波輔助和酶輔助等幾種提取方法[6]，其中超聲波法是利用超聲波的空化、機(jī)械和剪切等作用，提高溶劑分子與植物組織細(xì)胞的碰撞頻率和速率，以促進(jìn)細(xì)胞破壁或變形，從而增加多糖溶出的一種方法，具有操作方便、提取時(shí)間短、提取效率高、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)[7]。蝸牛酶是從蝸牛消化道和嗉囊中提取的一種由淀粉酶、果膠酶、纖維素酶等20 多種酶所組成的復(fù)合酶，具有同時(shí)破壞細(xì)胞壁上果膠和纖維素，以達(dá)到提高細(xì)胞通透能力[8]。目前關(guān)于超聲協(xié)同蝸牛酶輔助提取虎尾草多糖的工藝還有待進(jìn)一步研究。文章設(shè)計(jì)了超聲協(xié)同蝸牛酶輔助提取虎尾草多糖工藝的單因素試驗(yàn)，并利用響應(yīng)面法確定了最佳的提取工藝，再進(jìn)一步利用紅外光譜（FTIR）對(duì)所提取虎尾草多糖進(jìn)行表征，最后探討了虎尾草多糖對(duì)油脂的抗氧化性能，該研究為虎尾草開發(fā)成油脂產(chǎn)品添加劑提供應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

虎尾草：采于漳州市馬鞍山；蝸牛酶：生物試劑，福州飛凈生物科技有限公司；大豆油：實(shí)驗(yàn)室壓榨；豬油，自制；特丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）：食品級(jí)，江西凱泰食品科技有限公司；其他試劑為市售分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 虎尾草多糖的提取工藝

將采摘的新鮮虎尾草洗凈，自然干燥，切碎，冷凍后放入LGJ10-C 型冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠）中干燥，粉碎過(guò)濾備用。取5 g 虎尾草粉，加入無(wú)水乙醇浸泡，過(guò)濾后，繼續(xù)加入石油醚浸泡脫脂脫色，過(guò)濾后，濾渣加入燒瓶中，并按工藝要求設(shè)置，繼續(xù)加入蒸餾水、緩沖溶液、蝸牛酶，在KQ-100DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）中加熱提取，結(jié)束后，加入一定比例的氯仿和正丁醇混合液進(jìn)行振蕩，然后去除蛋白質(zhì)及有機(jī)溶劑并過(guò)濾，濾液定容至250 mL，測(cè)量多糖含量，然后醇沉，干燥，得虎尾草多糖。

1.2.2 虎尾草多糖含量的測(cè)定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定虎尾草多糖的含量，配制一系列濃度梯度的葡萄糖溶液，按苯酚-硫酸法[9]要求加入相應(yīng)試劑后在UV-1800PC-DS2型分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）上測(cè)定溶液的吸光度（波長(zhǎng)490 nm），繪制曲線并回歸得到方程。y=0.110 9x-0.001 1[x為質(zhì)量濃度（mg/L），y為吸光度]，R2=0.999 7。

虎尾草多糖提取率由下式計(jì)算得：

式中：b——多糖質(zhì)量濃度（mg/L）；

V——提取液的體積（mL）；

m——虎尾草質(zhì)量（g）。

1.2.3 虎尾草多糖的紅外光譜分析

采用德國(guó)Bruker 公司的Vertex70 型傅立葉紅外光譜儀，利用κBr 壓片法在500～4 000/cm 的波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)多糖進(jìn)行紅外光譜測(cè)試。

1.2.4 虎尾草多糖對(duì)油脂的抗氧化能力測(cè)定

在5 個(gè)燒杯中分別加入50 g 的油脂（大豆油/豬油），任選一份為空白（CK），一份添加0.02%（以油脂質(zhì)量為基準(zhǔn)）的TBHQ，剩下三份依次添加0.02%、0.04%和0.06%的虎尾草多糖，攪拌均勻后存放于60 ℃的烘箱中，定期取樣測(cè)定油脂的過(guò)氧化值，做三組平行試驗(yàn)，取均值。

1.3 單因素試驗(yàn)

固定單因素的基礎(chǔ)條件為超聲溫度50 ℃、酶用量1.5%、超聲時(shí)間40 min 和pH 5.0，在固定其他條件不變的情況下，分別考察各單因素（5 個(gè)水平）對(duì)虎尾草多糖提取率的影響，具體如下：超聲溫度（40、45、50、55、60 ℃）、酶用量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、超聲時(shí)間（20、30、40、50、60 min）和pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0），每個(gè)水平試驗(yàn)做3次平行，取均值。

1.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素的最佳取值范圍，再通過(guò)Box-Behnk‐en 試驗(yàn)方法，以虎尾草多糖提取率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)超聲溫度（A）、酶用量（B）、超聲時(shí)間（C）和pH（D）四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，具體如表1所示。

表1 Box-Bohnken因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲溫度對(duì)虎尾草多糖提取率的影響

由圖1 可知，超聲溫度在50 ℃時(shí)，虎尾草多糖提取率達(dá)到峰值。虎尾草多糖提取體系在一定的超聲溫度作用下，可以促進(jìn)蝸牛酶對(duì)虎尾草顆粒細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的作用，提高了虎尾草多糖提取率，但超聲溫度過(guò)高時(shí)，蝸牛酶的酶活性逐漸下降，虎尾草多糖提取率也下降[10]，因此超聲溫度選擇為50 ℃。

圖1 超聲溫度對(duì)虎尾草多糖提取率的影響

2.1.2 酶用量對(duì)虎尾草多糖提取率的影響

由圖2 可知，當(dāng)蝸牛酶用量在1.5%時(shí)，虎尾草多糖提取率達(dá)到峰值?；⑽膊荻嗵翘崛◇w系在一定蝸牛酶用量范圍內(nèi)，增加蝸牛酶的用量，蝸牛酶與虎尾草多糖顆粒的作用面積增加，水解更加徹底，提高了虎尾草多糖的溶出，但酶用量過(guò)大時(shí)，過(guò)多的蝸牛酶將虎尾草多糖顆粒完全包裹，使得虎尾草多糖提取率下降[11]，因此蝸牛酶用量選擇為1.5%。

圖2 酶用量對(duì)虎尾草多糖提取率的影響

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)虎尾草多糖提取率的影響

由圖3 可知，超聲時(shí)間在40 min 時(shí)，虎尾草多糖提取率達(dá)到峰值。虎尾草多糖提取體系在蝸牛酶和超聲波雙重作用一定的時(shí)間后，虎尾草顆粒細(xì)胞膜及細(xì)胞壁充分受損而使得虎尾草多糖溶出增加，提高了虎尾草多糖提取率，但作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，虎尾草多糖內(nèi)結(jié)構(gòu)較不穩(wěn)定的化學(xué)鍵會(huì)斷裂，使得虎尾草多糖提取率的下降[12]。因此超聲時(shí)間選擇為40 min。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)虎尾草多糖提取率的影響

2.1.4 pH對(duì)虎尾草多糖提取率的影響

由圖4可知，pH在5.0時(shí)，虎尾草多糖提取率達(dá)到峰值?；⑽膊荻嗵翘崛◇w系在一定的pH環(huán)境下，蝸牛酶具有最高的活性，此時(shí)蝸牛酶與虎尾草顆粒作用的效率最高，虎尾草多糖提取率最大，而過(guò)高或過(guò)低的pH均使得蝸牛酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，而影響了蝸牛酶的活性，導(dǎo)致了虎尾草多糖提取率的下降[13]，因此pH選擇為5.0。

圖4 pH對(duì)虎尾草多糖提取率的影響

2.2 超聲協(xié)同蝸牛酶輔助提取虎尾草多糖工藝

2.2.1 響應(yīng)面及回歸模型分析

采用Design Expert 8.05b軟件中的Box-Benhnken方法對(duì)影響虎尾草多糖提取率的超聲溫度（A）、酶用量（B）、超聲時(shí)間（C）和pH（D）四個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，具體試驗(yàn)方案和試驗(yàn)結(jié)果如表2，分析結(jié)果如表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

通過(guò)Design-Expert 8.05b 軟件對(duì)表2 的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理，確定了超聲溫度（A）、酶用量（B）、超聲時(shí)間（C）和pH（D）對(duì)虎尾草多糖提取率（Y）的四元二次回歸方程。

回歸方程的方差分析可得到回歸方程的顯著性及各工藝因素與提取率的影響關(guān)系，通過(guò)表3 可知該回歸方程F=21.93，P<0.000 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.956 4，表明該回歸方程差異極顯著；虎尾草多糖提取率的變化數(shù)據(jù)有95%以上可以用該回歸方程來(lái)描述。失擬項(xiàng)F=4.09，P=0.093 3>0.05，差異不顯著，說(shuō)明該回歸方程的預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)的真實(shí)值具有較好的擬合度，綜上分析，通過(guò)該回歸方程來(lái)預(yù)測(cè)與分析試驗(yàn)的真實(shí)值具有一定的可信度和準(zhǔn)確性。在回歸方程中，各因素對(duì)虎尾草多糖提取率的影響程度不一，其中對(duì)虎尾草多糖提取率影響極顯著的分別有一次項(xiàng)A、B、D，交互項(xiàng)BC、BD和二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2；其余的均對(duì)虎尾草多糖提取率影響不顯著，說(shuō)明超聲溫度、酶用量、超聲時(shí)間和pH 等工藝與虎尾草多糖提取率之間是特定的數(shù)學(xué)關(guān)系而不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。通過(guò)方差分析中的參數(shù)可以直觀地得到工藝對(duì)多糖提取率影響的大小順序?yàn)椋簆H>超聲溫度>酶用量> 超聲時(shí)間。

2.2.2 響應(yīng)面分析

超聲溫度、酶用量、超聲時(shí)間和pH四個(gè)工藝因素之間交互作用可通過(guò)Design-Expert 8.05b軟件繪制出，并以響應(yīng)曲面和等高線的圖形呈現(xiàn)，如圖5所考察的四個(gè)工藝因素中固定任意兩因素時(shí)，剩余兩因素間的交互作用程度，并可以通過(guò)響應(yīng)曲面的坡度和等高線的圓率來(lái)判斷兩因素交互作用對(duì)多糖提取率的顯著程度。通過(guò)分析和對(duì)比六個(gè)響應(yīng)面曲面圖和等高線可知，各因素間的交互作用對(duì)多糖提取率的影響均不顯著，另外各因素間的顯著程度順序?yàn)椋築C>CD>AB>AD>BD>AC。

圖5 各工藝因素間交互作用關(guān)系

2.2.3 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

為進(jìn)一步確定回歸方程的可預(yù)測(cè)性，通過(guò)工藝試驗(yàn)對(duì)預(yù)測(cè)值進(jìn)行驗(yàn)證，軟件得到的預(yù)測(cè)最佳工藝條件為：超聲溫度52.12 ℃、酶用量1.43%，超聲時(shí)間40.52 min和pH 5.07，在此條件下，從軟件中得到多糖的最大提取率預(yù)測(cè)值為85.83 mg/g。通過(guò)對(duì)軟件中最佳的工藝條件進(jìn)行分析并結(jié)合試驗(yàn)條件，將工藝修正為：超聲溫度52 ℃、酶用量1.4%，超聲時(shí)間41 min 和pH 5.1，最后進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)以便對(duì)修正后的工藝進(jìn)行驗(yàn)證，得到虎尾草多糖提取率為85.12 mg/g，與最大的多糖提取率預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.83%，說(shuō)明該回歸方程誤差小，準(zhǔn)確性好，因此該方法應(yīng)用于超聲協(xié)同蝸牛酶輔助提取虎尾草多糖工藝的優(yōu)化具有一定的應(yīng)用意義。

2.3 虎尾草多糖的紅外光譜

由圖6可知，所提取的樣品具有多糖的基本特征，在3 286/cm處的寬峰是多糖分子中O—H基團(tuán)的伸縮振動(dòng)特征吸收峰[14]；2 875/cm處的吸收峰是多糖分子結(jié)構(gòu)中飽和碳上的C—H的伸縮振動(dòng)峰；1 650/cm是多糖分子中少量C＝O的伸縮振動(dòng)峰，1 413/cm是多糖分子中C—H變角的吸收峰，1 028/cm處的強(qiáng)吸收峰是多糖中β—吡喃糖環(huán)上醚鍵C—O—C和C—O—H的拉伸振動(dòng)峰，923/cm和850/cm處的雙峰是多糖中β-吡喃糖基的特征峰[15]，因此虎尾草多糖中存在β-吡喃糖基。

圖6 虎尾草多糖的紅外光譜

2.4 虎尾草多糖對(duì)油脂的抗氧化性能

食用油脂主要分為植物油脂和動(dòng)物油脂，其中植物油脂中含有豐富的不飽和脂肪酸，暴露在空氣中容易產(chǎn)生過(guò)氧自由基，而過(guò)氧自由基會(huì)進(jìn)一步分解生成活性氧自由基或搶奪其他分子的氫原子生成碳自由基，進(jìn)而產(chǎn)生自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，導(dǎo)致油脂酸敗[16]。而動(dòng)物油脂則以飽和脂肪酸為主，與植物油脂相比，化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定，但在光照或高溫環(huán)境下，油脂上羧基的α氫原子易被氧化成碳自由基，導(dǎo)致油脂酸敗。作為活性氫供體，抗氧化劑能有效抑制或鈍化油脂酸敗過(guò)程產(chǎn)生的自由基，以達(dá)到延緩或阻斷油脂酸敗的目的[17]。

2.4.1 虎尾草多糖對(duì)大豆油的抗氧化性能影響

由圖7 可知，各組大豆油的過(guò)氧化值均隨著氧化時(shí)間的增加而增大，與空白（CK）樣品相比，添加虎尾草多糖的大豆油其過(guò)氧化值均有不同程度的降低，并且隨著虎尾草多糖用量的增加，其過(guò)氧化值降低越多，說(shuō)明虎尾草多糖用量與大豆油的過(guò)氧化值呈現(xiàn)負(fù)向的量效關(guān)系，當(dāng)虎尾草多糖添加量為0.04%時(shí)，大豆油的過(guò)氧化值略大于添加量為0.02%的TBHQ，而當(dāng)虎尾草多糖添加量為0.06%時(shí)，虎尾草多糖對(duì)大豆油的抗氧化能力超過(guò)了添加量為0.02%的TBHQ，說(shuō)明虎尾草多糖具有一定的抗氧化能力，能有效地降低大豆油過(guò)氧化值。

圖7 虎尾草多糖對(duì)大豆油的抗氧化影響

2.4.2 虎尾草多糖對(duì)豬油的抗氧化性能影響

由圖8 可知，各組豬油的過(guò)氧化值均隨著強(qiáng)行氧化時(shí)間的增加而增大，與空白（CK）樣品相比，添加虎尾草多糖的豬油其過(guò)氧化值均有不同程度的降低，并且隨著虎尾草多糖用量的增加，其過(guò)氧化值降低越多，說(shuō)明虎尾草多糖用量與豬油的過(guò)氧化值呈現(xiàn)負(fù)向的量效關(guān)系，當(dāng)虎尾草多糖添加量為0.04%時(shí)，豬油的過(guò)氧化值略大于添加量為0.02%的TBHQ，而當(dāng)虎尾草多糖添加量為0.06%時(shí)，虎尾草多糖對(duì)豬油的抗氧化能力超過(guò)了添加量為0.02%的TBHQ，說(shuō)明虎尾草多糖具有一定的抗氧化能力，能有效地降低豬油過(guò)氧化值。

圖8 虎尾草多糖對(duì)豬油的抗氧化影響

綜上分析，虎尾草多糖對(duì)植物油脂和動(dòng)物油脂均表現(xiàn)出一定的脂質(zhì)抗氧化作用，其用量與油脂的過(guò)氧化值呈現(xiàn)出負(fù)向的量效關(guān)系，表明虎尾草多糖可作為提高油脂產(chǎn)品貨架期的添加劑。

3 討論

細(xì)胞壁破碎和多糖溶出是植物多糖提取的兩個(gè)關(guān)鍵步驟，其中細(xì)胞壁破碎是提取過(guò)程的關(guān)鍵步驟。細(xì)胞壁主要由果膠、纖維素和半纖維素組成，要破碎細(xì)胞壁，就得采用一定的破壁方法，而不同的破壁方法有不同的提取效率。因此，通過(guò)多種提取方法的結(jié)合，可以兼具各種提取方法的優(yōu)點(diǎn)，而使得提取方法具有省時(shí)、節(jié)能，多糖提取率高和生物活性好等優(yōu)勢(shì)。本研究利用超聲協(xié)同蝸牛酶輔助對(duì)虎尾草多糖進(jìn)行提取，確定了最佳的提取工藝為：超聲溫度52 ℃、酶用量1.4%，超聲時(shí)間41 min 和pH 5.1，得到虎尾草多糖提取率為85.12 mg/g，與多糖提取率預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.83%。油脂是動(dòng)物飼料中僅次于蛋白質(zhì)的第二大營(yíng)養(yǎng)素，在飼料的生產(chǎn)、加工和貯存過(guò)程中，油脂容易會(huì)發(fā)生氧化，攝入氧化酸敗的油脂會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成嚴(yán)重危害。本研究發(fā)現(xiàn)虎尾草多糖對(duì)植物油脂和動(dòng)物油脂均表現(xiàn)出一定的脂質(zhì)抗氧化作用，其用量與油脂的過(guò)氧化值呈現(xiàn)出負(fù)向的量效關(guān)系，表明虎尾草多糖可作為提高油脂產(chǎn)品貨架期的添加劑。

4 結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化的超聲協(xié)同蝸牛酶輔助提取工藝的條件可用于虎尾草多糖的提取，且提取的多糖中存在β-吡喃糖基，并表現(xiàn)出一定的脂質(zhì)抗氧化作用，可作為油脂產(chǎn)品添加劑。