孔素芬，朱明明，朱建國(guó)，方曙光

（武漢微康益生菌研究院有限公司，湖北武漢 430000）

凝結(jié)魏茨曼氏菌（曾用名凝結(jié)芽孢桿菌）是一種既能產(chǎn)乳酸又能產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，最早于1915 年由Hammer[1]分離得到。凝結(jié)魏茨曼氏菌是美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）和歐盟食品安全局（EFSA）共同認(rèn)證的可以安全使用的益生菌。同時(shí)，凝結(jié)魏茨曼氏菌也列入了Generally Recognized As Safe（GRAS 普遍公認(rèn)安全）和Qualified Presumption of Safety（QPS 合格安全推定）菌株名單。此外，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）和美國(guó)飼料控制官員協(xié)會(huì)也將凝結(jié)魏茨曼氏菌列入到可用于飼料的安全微生物菌種名單[2?3]。

近年來(lái)，凝結(jié)魏茨曼氏菌作為新型微生態(tài)制劑，由于其益生作用和高抗逆特性，在畜牧[4]、水產(chǎn)養(yǎng)殖[5]、農(nóng)業(yè)[6]和環(huán)境保護(hù)[7]等行業(yè)中被廣泛應(yīng)用。劉彬等[8]發(fā)現(xiàn)凝結(jié)魏茨曼氏菌增加異育銀鯽幼魚血液中髓過氧化物酶和抗超氧陰離子自由基活性，有效緩解宿主重金屬中毒反應(yīng)。苗華彪等[9]研究發(fā)現(xiàn)凝結(jié)魏茨曼氏菌在生豬養(yǎng)殖應(yīng)用中具有改善生豬腸道健康、提高機(jī)體免疫力和抗病能力、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡和提高動(dòng)物生產(chǎn)性能等作用?？梢娔Y(jié)魏茨曼氏菌作為一種新的微生態(tài)制劑正在成為一種趨勢(shì)。但是由于菌株的挑選不規(guī)范，菌株配伍不科學(xué)，是否具有耐藥性等依然影響著微生態(tài)制劑的應(yīng)用與發(fā)展。本研究對(duì)一株從仔豬糞便中分離獲得的凝結(jié)魏茨曼氏菌進(jìn)行了形態(tài)特征的觀察，評(píng)價(jià)了該菌株的益生特性和安全性，同時(shí)，初步考察了與其他飼用益生菌的復(fù)配情況，證明其具備開發(fā)利用和研究?jī)r(jià)值，為凝結(jié)魏茨曼氏菌進(jìn)一步的功能評(píng)價(jià)、應(yīng)用擴(kuò)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

病原菌：大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、腸炎沙門氏菌ATCC14028、福氏志賀氏菌ATCC12022、化膿性鏈球菌ATCC19615

購(gòu)于廣東微生物菌種保藏中心；干酪乳桿菌W189、乳酸片球菌W172、嗜酸乳桿菌W211、屎腸球菌W362、糞腸球菌W471 武漢微康益生菌研究院實(shí)驗(yàn)室分離、編號(hào)、保藏；仔豬糞便 采集自湖北省種豬養(yǎng)殖場(chǎng)斷奶仔豬；小鼠 購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(鄂）2020-0084，小鼠實(shí)驗(yàn)倫理審批編號(hào)為HZAUMO-2023-0140；蛋白胨、酵母粉 安琪酵母股份有限公司；葡萄糖、K2HPO4、MgSO4、MnSO4、NaCl、CaCO3、硫酸銨（均為分析純?cè)噭?、豬膽鹽（膽酸含量≥60%）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胃蛋白酶（1:3000）上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑為分析純?cè)噭?/p>

JY10002 型電子天平 上海衡平儀器儀表廠；SW-CJ-2FD 型雙人單面超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SPX-250B-2 型恒溫培養(yǎng)箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；CX-23 顯微鏡 奧林巴斯公司；UV-1700 紫外分光光度計(jì) 上海美析儀器有限公司；pHS-3C 型pH 計(jì) 上海儀電科股份有限公司公司；D（24 L）型高壓蒸汽滅菌鍋 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；DK-8D 型水浴加熱鍋 常州國(guó)宇儀器制造有限公司；5415D 臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基和溶液配制 MRS 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10 g，牛肉浸粉10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，KH2PO42 g，檸檬酸氫二銨2 g，無(wú)水乙酸鈉5 g，MgSO40.2 g，MnSO40.6 g，Tween 80 1 mL，蒸餾水1000 mL，pH6.0～6.2，115 ℃，30 min 滅菌。

平板篩選培養(yǎng)基參考辛國(guó)芹等[10]報(bào)道篩選培養(yǎng)基：MRS 培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加0.25% CaCO3和1.5%瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，酵母粉5 g，無(wú)水乙酸鈉5 g，硫酸錳0.2 g，硫酸鎂0.2 g，磷酸氫二鉀4 g，水1000 mL，pH6.8～7.0，115 ℃滅菌 30 min。

PCA 培養(yǎng)基：葡萄糖1 g，胰蛋白胨5 g，酵母浸粉2.5 g，瓊脂粉1.8 g/L，水 1000 mL，pH7.0～7.2，121 ℃滅菌 20 min。

胃液配制[11]：NaCl 0.5%、胃蛋白酶 0.3%，用1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 至3.0，用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后備用。

膽鹽培養(yǎng)基[12]：取一定量的豬膽鹽加入含0.2%（w/v）的巰基乙酸鈉的MRS 培養(yǎng)基中，使膽鹽終濃度（g/mL）分別為0%，0.1%，0.3%，0.5%，1.0%，用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后備用。

1.2.2 菌株的篩選與鑒定

1.2.2.1 菌種初篩純化 采集健康仔豬糞便樣品10 份，各取樣品1 g 分別放入裝有 9 mL 無(wú)菌生理鹽水50 mL 離心管中，振蕩15 min，使之充分混勻，靜置20～30 s，每個(gè)樣品吸取2 mL 懸液置于80 ℃水浴處理10 min[13]，分別取1 mL 進(jìn)行10 倍梯度稀釋，再選擇適宜梯度的懸液涂布于含0.25%碳酸鈣的MRS 瓊脂培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)48～72 h。挑取初篩平板不同形態(tài)的單菌落在PCA培養(yǎng)基平板上反復(fù)劃線純化，單菌落形態(tài)穩(wěn)定后，編號(hào)保存。

1.2.2.2 菌株形態(tài)學(xué)觀察 平板菌落觀察：觀察菌落形態(tài)、大小、顏色、凸起有無(wú)等；菌體形態(tài)觀察：觀察油鏡下菌體的形態(tài)、大小、排列等；掃描電鏡觀察：觀察掃描電鏡下放大20000 倍菌體的立體形態(tài)、芽孢著生特點(diǎn)等。

1.2.2.3 16S rDNA 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 使用通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：2×Buffer MIX 25 μL，引物27F 和1492R 各2 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 補(bǔ)足至50 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 °C 3 min；94 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 1.5 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將PCR 產(chǎn)物通過凝膠電泳檢測(cè)后，產(chǎn)物送往武漢金開瑞生物工程有限公司測(cè)序。將測(cè)得基因序列提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 分析比對(duì)，以16S rDNA 序列同源性≥99%為鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 生理生化實(shí)驗(yàn) 參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行。

1.2.4 生長(zhǎng)特性的初步探究 將凝結(jié)魏茨曼氏菌單菌落接種至MRS 液體培養(yǎng)基進(jìn)行二級(jí)活化，按照5%接種量接入裝有30 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃，250 r/min，搖床培養(yǎng)，以pH、OD 值為指標(biāo)，觀察菌株24 h 的生長(zhǎng)特性。

1.2.5 抗逆性實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 培養(yǎng)液制備 取BC66 甘油管接種至30 mL MRS 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行一級(jí)活化，37 ℃，250 r/min搖床培養(yǎng)12～15 h，取一級(jí)培養(yǎng)液按5%接種量接入裝有30 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，37 ℃，250 r/min，搖床培養(yǎng)18～24 h 得到所需培養(yǎng)液。

1.2.5.2 耐酸實(shí)驗(yàn) 取1 mL 培養(yǎng)液10000 r/min 離心1 min 后去上清加入10 mL pH3.0 的模擬胃液，置于37 °C 培養(yǎng)箱恒溫孵育，分別于0、2、3、4 h 不同耐受時(shí)間取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。以0 h 測(cè)定值作為空白對(duì)照，計(jì)算菌株存活率。

其中，N1表示經(jīng)過處理后菌株體系中的活菌數(shù)，CFU/mL；N0表示菌株體系中初始活菌數(shù)，即0 h測(cè)得的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.5.3 耐膽鹽實(shí)驗(yàn) 取1 mL 培養(yǎng)液10000 r/min離心1 min 后去上清分別加入不同膽鹽濃度0.1%、0.3%、0.5%、1.0%（w/v）的10 mL 膽鹽培養(yǎng)基，置于37 °C 恒溫培養(yǎng)，分別于0、2 h 取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。以0 h 測(cè)定值作為空白對(duì)照，計(jì)算菌株存活率。

其中，N1表示經(jīng)過處理后菌株體系中的活菌數(shù)，CFU/mL；N0表示菌株體系中初始活菌數(shù)，即0 h測(cè)得的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.5.4 耐高溫實(shí)驗(yàn) 將凝結(jié)魏茨曼氏菌菌株接種至PCA 固體斜面培養(yǎng)基上，菌體培養(yǎng)至形成芽孢后，取菌苔制成懸液各2 mL，分別置于70、80、90、100 ℃水浴中處理10 min，處理完后立即冷卻，取0.1 mL 懸液進(jìn)行梯度稀釋活菌計(jì)數(shù)，以未水浴菌液為對(duì)照，培養(yǎng)48 h 后計(jì)算存活率[14]。

其中，N1表示水浴中處理10 min 后的活菌數(shù)，CFU/mL；N0表示未水浴菌液的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.6 體外抑菌實(shí)驗(yàn) 采用瓊脂擴(kuò)散法[15]，按1.2.5培養(yǎng)液制備方法進(jìn)行二級(jí)活化，二級(jí)培養(yǎng)液37 ℃250 r/min 搖瓶培養(yǎng)10～15 h，離心收集上清液。指示菌采用LB 液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在 37 ℃、220 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng) 24 h，制成1×108CFU/mL 菌懸液。指示菌懸液按1:100 的比例加入LB 瓊脂培養(yǎng)基溶液中，充分混勻后傾注加到放置牛津杯的平板中，凝固后取出牛津杯。將200 μL 上清液加入到7 mm 的孔中，以空白LB 培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)適宜時(shí)間后，測(cè)量抑菌圈的大小，檢測(cè)加入培養(yǎng)上清液對(duì)指示菌的抑制作用。

1.2.7 凝結(jié)魏茨曼氏菌與不同菌株的拮抗關(guān)系 參考徐秀偉[16]采用的菌種劃線拮抗方法，分別將凝結(jié)魏茨曼氏菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳酸片球菌、屎腸球菌，糞腸球菌的甘油管菌種接種至MRS 液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，取不同菌株菌液離心，留菌體。將凝結(jié)魏茨曼氏菌分別和干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳酸片球菌、屎腸球菌，糞腸球菌在平板上兩兩呈“井”字劃線，觀察交叉菌線生長(zhǎng)狀況，是否出現(xiàn)透明圈，以此判斷兩個(gè)菌株間是否存在拮抗作用。

1.2.8 安全性評(píng)價(jià)

1.2.8.1 溶血性實(shí)驗(yàn) 取1.2.5 離心后的凝結(jié)魏茨曼氏菌菌體以劃線的形式接種在含1.5%瓊脂和5%脫纖維羊血的血液瓊脂（BHI 培養(yǎng)基）中37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察溶血情況。在菌落周圍產(chǎn)生綠色帶（α-溶血）或在血平板上不產(chǎn)生任何溶血（γ-溶血）的菌株被認(rèn)為是非溶血的，菌落周圍出現(xiàn)溶血帶（透明色帶）的菌株被歸類為具有溶血（β-溶血）特性的微生物，出現(xiàn)透明β-溶血環(huán)為溶血表型陽(yáng)性，使用化膿性鏈球菌作為陽(yáng)性質(zhì)控菌株[17]。

1.2.8.2 抗生素敏感實(shí)驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散試驗(yàn)法[18]。將200 μL 含108CFU/mL 的凝結(jié)魏茨曼氏菌發(fā)酵液均勻涂布于MRS 瓊脂平板上，待平板表面稍干后，放入常用抗生素藥敏紙片，貼在培養(yǎng)基表面中央，輕輕按壓紙片使其固定。在37 ℃培養(yǎng)24 h 后，測(cè)量抑制圈直徑大小。

1.2.8.3 急性毒性實(shí)驗(yàn) 安全性評(píng)價(jià)采用急性毒性實(shí)驗(yàn)，參照GB15193.9-2014 最大耐受劑量法進(jìn)行。取體重18～22 g 的小鼠雌雄各15 只，觀察3 d 后，1 日內(nèi)分2 次經(jīng)口給予0.2 mL 注菌液（按小鼠體重20 g計(jì)算相當(dāng)于每千克體重20 mL），連續(xù)灌胃14 d，觀察小鼠是否有中毒和死亡現(xiàn)象。注菌液使用0.85%生理鹽水制成含量為1×109CFU/mL 的凝結(jié)魏茨曼氏菌懸液[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。原始數(shù)據(jù)用Excel 2010 整理后采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS statistics 21.0 進(jìn)行差異顯著性分析，比較實(shí)驗(yàn)中不同處理間差異。P<0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選與鑒定

2.1.1 菌株的形態(tài)學(xué)特征及鑒定結(jié)果 對(duì)獲取的10 份仔豬糞便樣品進(jìn)行熱處理，并利用菌株的耐高溫特性獲取芽孢桿菌4 株，經(jīng)鑒定分別為凝結(jié)魏茨曼氏菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌，具體結(jié)果見表1 和圖1。

圖1 不同芽孢桿菌的單菌落形態(tài)Fig.1 Single colony of different Bacillus

表1 不同芽孢桿菌菌落形態(tài)Table 1 Morphological characteristies of different Bacillus

2.1.2 形態(tài)特征觀察 將獲得的凝結(jié)魏茨曼氏菌在PCA 平板上進(jìn)行稀釋涂布，得到純化后的菌株并編號(hào)為BC66，菌落形態(tài)如圖2 所示。對(duì)菌落進(jìn)行革蘭氏染色在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征，10×100光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)呈桿狀，芽孢端生。20000 倍掃描電鏡狀態(tài)下觀察，芽孢一端膨大，呈鼓槌狀。菌株個(gè)體形態(tài)如圖3 所示。

圖2 菌落形態(tài)Fig.2 The morphology of the colony

圖3 BC66 細(xì)胞形態(tài)Fig.3 The cellular morphology of BC66

2.1.3 16S rDNA 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 使用通用引物對(duì)BC66 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物通過凝膠電泳檢測(cè)后，產(chǎn)物送往武漢金開瑞生物工程有限公司測(cè)序。將測(cè)得基因序列提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 分析比對(duì)，通過比對(duì)確定菌株BC66 為凝結(jié)魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans），曾用名為凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）。比較分析同源性較高的序列，構(gòu)建出凝結(jié)魏茨曼氏菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖4。以Paenibacillus agarexedensDSM 1327（MT568608）為外枝構(gòu)建的Neighbor-Joining 系統(tǒng)發(fā)育樹，BC66 與凝結(jié)魏茨曼氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7050的16S rDNA 序列同源性99.68%，使用MEGA Ⅹ 對(duì)菌株與其他菌株進(jìn)行16S rDNA 序列一起構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，可以看到BC66 與凝結(jié)魏茨曼氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株親緣關(guān)系較近，處于同一分支。

圖4 基因序列比對(duì)結(jié)果Fig.4 The results of gene sequence alignment

2.1.4 生理生化實(shí)驗(yàn) 生理生化指標(biāo)是進(jìn)行細(xì)菌分類的重要依據(jù)，BC66 菌株主要依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[20]的分類原則進(jìn)行，菌株的生理生化特征如表2 所示。

表2 BC66 的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of BC66

從表2 可以看出菌株BC66 能利用葡萄糖產(chǎn)酸，尿酶反應(yīng)陰性，不產(chǎn)H2S，吲哚實(shí)驗(yàn)陰性。

2.2 生長(zhǎng)特性初步探究

將篩選到的BC66 菌株進(jìn)行初步的生長(zhǎng)特性研究，分別在0、3、9、15、18 及24 h 取樣測(cè)定OD 值和pH，觀察菌株培養(yǎng)24 h 的生長(zhǎng)特性。

微生物的生長(zhǎng)繁殖分為4 個(gè)時(shí)期，分別為停滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期[21]，從圖5 可以看出，活化后的菌株轉(zhuǎn)入到新鮮培養(yǎng)基后停滯期較短，18 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，之后進(jìn)入穩(wěn)定期。從pH 變化曲線來(lái)看，菌株BC66 的發(fā)酵液pH 在15 h 達(dá)到最低點(diǎn)4.61，辛國(guó)芹等[10]研究發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)魏茨曼氏菌在代謝中產(chǎn)生有機(jī)酸，主要為乳酸和乙酸。乳酸和乙酸對(duì)于提高飼料消化率，降低胃部及后腸道pH，抑制有害菌及腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖，維持腸道有益微生物的生長(zhǎng)，同時(shí)抑制腸道致病菌，改善腸道環(huán)境具有重要作用[22]。

圖5 BC66 生長(zhǎng)趨勢(shì)圖Fig.5 The growth trend of BC66

2.3 抗逆性研究

2.3.1 耐酸特性 菌株的耐酸特征決定其通過胃液在腸道中的存活能力。正常情況下，胃酸 pH2.0～3.0，食物通過胃排空時(shí)間一般在2～4 h[23]。實(shí)驗(yàn)研究了菌株在pH3.0 酸性條件下的存活情況。圖6 顯示了不同耐受時(shí)間凝結(jié)魏茨曼氏菌BC66 菌株生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，該菌株在pH3.0 的模擬胃液中處理2 h時(shí)，菌株存活率可達(dá)98%；處理4 h 時(shí)，菌株存活率還保持在60%以上。說(shuō)明菌株BC66 具有較強(qiáng)的耐酸能力，在通過胃液時(shí)，能有足夠數(shù)量的活菌在胃腸道中發(fā)揮益生作用。

圖6 BC66 在pH3.0 酸性條件下的耐受情況Fig.6 Tolerance of BC66 in pH3.0 acidic condition

2.3.2 耐膽鹽特性 膽鹽是腸道中參與機(jī)體營(yíng)養(yǎng)消化和吸收的主要成分。益生菌在腸道中存活和定殖，必須能對(duì)小腸中的膽汁有抗性。腸道中的膽鹽濃度不是固定不變的，膽鹽濃度主要在0.03%～0.3%范圍內(nèi)波動(dòng)[24]。若菌株在該條件下能存活才有可能正常生長(zhǎng)代謝[25]，菌株耐膽鹽的特性決定了其在腸道中的存活能力。實(shí)驗(yàn)研究了菌株對(duì)不同濃度膽鹽的耐受能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7 所示，在0.3%膽鹽濃度下，菌株存活率為79%，在0.5%膽鹽濃度下其存活率保持在63%。說(shuō)明菌株BC66 具有較好的膽鹽耐受性，能在腸道中生長(zhǎng)，并發(fā)揮益生作用。

圖7 BC66 在不同膽鹽濃度中存活情況Fig.7 Survival of BC66 in different bile salt concentrations

2.3.3 耐高溫實(shí)驗(yàn) 高溫在實(shí)際生產(chǎn)中會(huì)影響產(chǎn)品的活性，同時(shí)也是影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的重要因素，凝結(jié)魏茨曼氏菌由于其芽孢具有良好的抗逆性，能耐受工業(yè)生產(chǎn)中的高溫高壓等不利環(huán)境[26]，本研究對(duì)BC66的耐高溫特性進(jìn)行考查，將芽孢菌懸液分別置于不同溫度水浴中處理10 min 后，進(jìn)行梯度稀釋活菌計(jì)數(shù)，結(jié)果見圖8，水浴溫度90 ℃處理10 min 菌體存活率達(dá)到92%，水浴溫度為100 ℃時(shí)，菌體存活率還保持約50%，金迅等[27]研究顯示凝結(jié)魏茨曼氏菌13002 在80 ℃條件下存活率可達(dá)到72%，遠(yuǎn)低于本研究中的80 ℃高溫處理后的存活率96%，表明凝結(jié)魏茨曼氏菌BC66 具有較強(qiáng)的耐高溫特性，在益生菌產(chǎn)品加工應(yīng)用領(lǐng)域具有更大的多樣性[28]。

圖8 BC66 耐高溫存活率情況Fig.8 High temperature survival rate of BC66

2.4 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

有動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)顯示，飼料中添加凝結(jié)魏茨曼氏菌能抑制大腸桿菌、沙門氏菌等腸道主要有害菌，顯著改善畜禽生長(zhǎng)性能[29?31]，本研究對(duì)凝結(jié)魏茨曼氏菌進(jìn)行常見病原菌體外抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3，菌株BC66 對(duì)大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，腸炎沙門氏菌，福氏志賀氏菌均表現(xiàn)出不同程度的抑菌能力，與陳宇等[32]報(bào)道一致，凝結(jié)魏茨曼氏菌可分泌多種凝固素、雙乙酰、L-乳酸等抑菌物質(zhì)，能抑制腸道內(nèi)大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、變形桿菌等有害菌。

表3 BC66 抑制病原菌作用Table 3 Antigonistic acticity of BC66

2.5 BC66 與其他乳酸菌的拮抗關(guān)系

凝結(jié)魏茨曼氏菌對(duì)腸道有害菌及飼料源有害菌[33]抑制作用的研究較多，對(duì)多種商業(yè)飼用益生菌的研究報(bào)道較少，考慮到商業(yè)復(fù)合飼用益生菌在凝結(jié)魏茨曼氏菌與其他飼用益生菌菌株之間可能的拮抗效應(yīng)[34]，本研究初步考查了BC66 和干酪乳桿菌W189、嗜酸乳桿菌W211、乳酸片球菌W172、屎腸球菌W362、糞腸球菌W471 的拮抗作用，結(jié)果如圖9所示，橫向劃線的菌株為BC66，縱向劃線的菌株為不同的益生菌，從圖中可以看出BC66 與干酪乳桿菌W189、嗜酸乳桿菌W211、乳酸片球菌W172 不存在拮抗關(guān)系，和糞腸球菌W471、屎腸球菌W362 存在較弱拮抗作用。

圖9 BC66 與幾株常規(guī)益生菌之間的拮抗作用Fig.9 The results of antagonism between BC66 and several strains of probiotics

2.6 安全性評(píng)價(jià)

2.6.1 溶血性實(shí)驗(yàn) 如圖10 所示，BC66 周圍未出現(xiàn)透明溶血圈，而作為陽(yáng)性質(zhì)控菌株的化膿性鏈球菌在血瓊脂平板上出現(xiàn)了透明的溶血圈，表明凝結(jié)魏茨曼氏菌BC66 沒有溶血活性。

圖10 溶血性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.10 The results of the hemolytic test

2.6.2 抗生素敏感性評(píng)價(jià) 抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)是考察益生菌安全性的重要檢查指標(biāo)，如果菌體對(duì)抗生素敏感，說(shuō)明細(xì)菌細(xì)胞中不存在抵抗這種抗生素的基因。參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）抗微生物藥物敏感實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[35]，對(duì)15 種抗生素進(jìn)行了耐抗生素的敏感性實(shí)驗(yàn)研究，由表4 可知，凝結(jié)魏茨曼氏菌BC66 對(duì)15 種抗生素均處于敏感狀態(tài)，此菌株不具有耐藥性，可認(rèn)為是安全菌株。

表4 BC66 對(duì)常用抗生素的敏感程度Table 4 The antibiotic susceptibility of BC66

2.6.3 急性毒性實(shí)驗(yàn) 觀察飼喂后的小鼠活力情況，所有小鼠生命體征活躍，未見不良反應(yīng)，均未出現(xiàn)中毒和死亡現(xiàn)象，說(shuō)明菌株BC66 在GB15193.9-2014推薦劑量下進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)無(wú)顯性致死作用。此外，毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)和大量臨床觀察表明凝結(jié)魏茨曼氏菌是安全菌種，沒有致突變性、致畸性和遺傳毒性[36]。

3 結(jié)論

本研究從健康仔豬糞便中分離篩選到一株耐高溫，產(chǎn)乳酸的凝結(jié)魏茨曼氏菌BC66，并對(duì)其作為益生菌的潛力和安全性進(jìn)行了初步研究和評(píng)價(jià)。結(jié)果表明該菌株在胃腸道苛刻條件（pH3.0；膽鹽 0.3%）下具有較強(qiáng)的生存能力，表現(xiàn)出良好的抗病原菌活性和抗生素敏感性，且沒有溶血活性。此外，該菌株產(chǎn)生抗逆性很強(qiáng)的芽孢，在90 ℃下處理10 min 還能保持較高的活性，能夠抵御高溫食品和飼料生產(chǎn)的工業(yè)化過程，可作為潛在的益生菌產(chǎn)品應(yīng)用于食品、飼料等領(lǐng)域。綜上所述，本研究從自然界分離到的新菌株凝結(jié)魏茨曼氏菌BC66 具有在飼料工業(yè)中應(yīng)用的明顯優(yōu)勢(shì)和潛力。然而，進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和相關(guān)基因功能分析仍然需要開展，以期對(duì)該菌株的優(yōu)良性狀進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，為芽孢益生菌的開發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。