王貴珍，劉洪濤，楊秀柏，姜雨晴，楊麗麗，邱家章,

（1.吉林大學動物醫(yī)學學院，吉林長春 130062；2.吉林工程技術(shù)師范學院生物與食品工程學院，吉林長春 130052）

豬鏈球菌（Streptococcus suis，S.suis）是一種具有莢膜的革蘭氏陽性條件病原菌，也是一種重要的人獸共患病原菌[1?2]。根據(jù)莢膜抗原不同，豬鏈球菌被分為35 個血清型，其中2 型血清型被認為是毒力最強的豬鏈球菌，可引發(fā)人和動物產(chǎn)生多種疾病，如引發(fā)人產(chǎn)生細菌性腦膜炎、鏈球菌中毒樣休克綜合征等疾病，也可引發(fā)豬的急性敗血癥、肺炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎等疾病[3?5]。我國在2005 年爆發(fā)了較大規(guī)模豬鏈球菌感染人案例，上百人發(fā)病并有數(shù)十人死亡[6]。近年來，由于抗生素的大量使用甚至濫用，導致豬鏈球菌產(chǎn)生耐藥性并呈現(xiàn)逐漸嚴重的趨勢[7]，使得針對該菌的感染防治變得非常困難。豬鏈球菌感染每年給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，嚴重影響畜禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[8]?！跋蘅埂?、“減抗”政策的實施使畜禽養(yǎng)殖業(yè)面臨豬鏈球菌感染“復燃”，無藥可用等困境，因此臨床上迫切需要新的抗菌藥物應對豬鏈球菌尤其是耐藥性豬鏈球菌感染。

豬鏈球菌的感染和致病過程依賴于其產(chǎn)生和分泌的多種毒力因子，包括分選酶、莢膜多糖等[9]。細胞溶素是豬鏈球菌感染及致病過程中非常重要的毒力因子，被譽為豬鏈球菌的“毒力標志物”[10]。豬鏈球菌細胞溶素相對分子量54 kD，隸屬于膽固醇依賴型細胞溶素毒素家族，是典型的成孔毒素，具有裂解細胞、穿過血腦屏障和致死性等功能[11?12]。此外，豬鏈球菌細胞溶素可通過作用于TLR4 和p38-MAPK信號通路相關(guān)蛋白引發(fā)炎癥反應，促進炎癥因子TNF-α和IL-1β的釋放[13?14]。豬鏈球菌細胞溶素對豬和人腸上皮細胞、腦微血管細胞等多種細胞有細胞毒性作用[15]。研究者分別用野生株和敲除細胞溶素的豬鏈球菌感染小鼠，在相同感染時間內(nèi)敲除株不能引發(fā)小鼠死亡[16]。細胞溶素在感染過程中的重要作用使其成為篩選抗豬鏈球菌感染藥物的理想靶標。

肉豆蔻酸又名十四烷酸，屬于飽和脂肪酸的一種，在食品行業(yè)用于各種香料的制備，同時也被用做增香劑添加到食品中。研究表明13-甲基肉豆蔻酸有多種藥理作用，如降低血糖[17]，保護神經(jīng)系統(tǒng)[18]，抗腫瘤[19]等。但是肉豆蔻酸藥理作用研究相對較少，本研究基于成孔活性試驗和寡聚化試驗分析了肉豆蔻酸對豬鏈球菌細胞溶素生物活性及寡聚體形成的影響；通過分子對接和分子模擬試驗闡述了肉豆蔻酸與細胞溶素的作用機制，并在細胞水平上證實了肉豆蔻酸對豬鏈球菌及細胞溶素介導的細胞毒性的緩解作用，為豬鏈球菌感染防治提供了潛在先導化合物。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肉豆蔻酸 純度≥98%，購于成都瑞芬思生物科技有限公司；豬鏈球菌細胞溶素蛋白 純度≥80%，來自本實驗室；無菌脫纖維羊血 購自鄭州九龍生物制品公司；細胞培養(yǎng)基、胎牛血清 購買于Thermo Fisher Scientific；小鼠巨噬細胞J774（BFN60807356）

購買于美國模式培養(yǎng)物集存庫；乳酸脫氫酶試劑盒

購買于Roche；2 型豬鏈球菌（ZY05719）來自本實驗室保存。

Multiskan Spectrum 全波長酶標儀 賽默飛世爾科技實驗室產(chǎn)品；CLX 雙色紅外激光成像系統(tǒng)基因有限公司；DK-8D 電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司；H2050R 離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；ZWY-211C 恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 血紅素釋放率及寡聚化試驗 根據(jù)作者前期研究經(jīng)驗及本次預實驗確定肉豆蔻酸濃度為4、8、16 μg/mL。0.25 μg 細胞溶素蛋白與不同濃度肉豆蔻酸于485 μL 磷酸鹽緩沖液（pH7.0）中在37 ℃共孵育20 min。隨后加入無菌脫纖維羊血（終濃度25%，500 μL 反應體系），繼續(xù)在37 ℃孵育10 min，離心處理（10000 r/min，1 min），取上清置于酶標儀中檢測543 nm 處吸光值。經(jīng)無菌水或無菌磷酸鹽緩沖液處理的羊血作為陽性或陰性對照。血紅素釋放率（%）=（A1?A0）/（A2?A0）×100，式中A0為陰性對照吸光值，A1為加肉豆蔻酸組吸光值，A2為不加肉豆蔻酸組吸光值。寡聚試驗：細胞溶素蛋白與不同濃度肉豆蔻酸（0、4、16 μg/mL）共孵育（37 ℃，20 min）后加入羊血紅細胞誘導寡聚體形成，隨后加入無β-巰基乙醇的蛋白質(zhì)上樣緩沖液在55 ℃恒溫水浴鍋中處理10 min。蛋白樣品用6%分離膠進行分離后經(jīng)轉(zhuǎn)膜實驗轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF,60 V，1.5 h）。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF 膜置于5%脫脂奶粉中封閉2 h，PBST 洗三次（80 r，5 min/次）后用鼠源細胞溶素一抗孵育2 h，PBST 洗三次后用熒光標記二抗室溫孵育1 h，洗膜后于成像系統(tǒng)采集圖像，分析肉豆蔻對細胞溶素寡聚體形成的影響。

1.2.2 分子對接 細胞溶素作為受體蛋白，其結(jié)構(gòu)文件從Protein Data Bank（PDB）網(wǎng)站獲得（編號：3hvn），分子對接前受體（蛋白質(zhì)）和能量最小化后的配體小分子（肉豆蔻酸）用Autodock Tools 軟件進行預處理。應用Autodock Vina[20]軟件進行對接試驗，對接試驗參數(shù)如下：size_x=120.0，size_y=74.0，size_z=72.0，center_x=33.558，center_y=20.947，center_z=34.705，間距1.0 ?。對接過程中蛋白質(zhì)保持剛性，小分子柔性鍵可旋轉(zhuǎn)，獲得穩(wěn)定的對接結(jié)構(gòu)，供后續(xù)分析。

1.2.3 分子模擬 經(jīng)對接分析確定最佳結(jié)合模式并獲得蛋白配體復合物后，從復合物中提取配體坐標文件，并應用Amber GAFF 立場獲得其拓撲文件，蛋白拓撲文件應用Amber99SB 立場獲得。應用Gromacs 2020.6[21]軟件進行分子動力學模擬試驗，水模型采用TIP3P，模擬時長130 ns。通過分析均方根偏差（RMSD）評價細胞溶素和肉豆蔻酸在模擬過程中的構(gòu)型，通過均方根波動（RMSF）分析殘基結(jié)合肉豆蔻酸前后的柔性變化，基于殘基與配體的距離、氫鍵、結(jié)合能等指標闡述肉豆蔻酸和細胞溶素作用的機制。

1.2.4 抗菌活性試驗 采用微量肉湯稀釋法測定肉豆蔻酸對豬鏈球菌的抗菌活性。96 孔微量培養(yǎng)板中通過倍比稀釋法獲得含有不同濃度肉豆蔻酸（1～128 μg/mL）的豬鏈球菌生長培養(yǎng)基，隨后向每孔加入培養(yǎng)至對數(shù)生長期的豬鏈球菌并使其終濃度為5×105CFUs/mL。將培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)靜置培養(yǎng)24 h，肉眼觀察沒有細菌生長的最小濃度定義為肉豆蔻酸的最低抑菌濃度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC）[22]。

1.2.5 乳酸脫氫酶活性實驗 小鼠巨噬細胞J774 于含10%胎牛血清，100 U 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素細胞培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)條件37 ℃、5% CO2。細胞接種到96 孔板中（5×104細胞/孔）過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)至OD600=0.8 的豬鏈球菌離心（4000 r/min，5 min），無菌磷酸鹽緩沖液洗三次后用細胞培養(yǎng)基重懸并調(diào)整濃度至5×107CFUs/mL 備用；細胞溶素（1.5 μg/mL）加入細胞培養(yǎng)基混勻備用。用上述制備的菌液或細胞溶素溶液置換細胞培養(yǎng)液（100 μL/孔）并加入不同濃度肉豆蔻酸（0、4、16 μg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)5 h 后離心（1000 r/min，10 min）處理，取100 μL 上清加入等體積乳酸脫氫酶活性檢測試劑體積細胞毒性試劑，室溫避光反應30 min，于酶標儀中檢測OD490。乳酸脫氫酶活性（%）=A1/A2×100[22]，式中A1為加肉豆蔻酸組吸光值，A2為不加肉豆蔻酸組吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗獨立重復3 次，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示；應用GraphPad Prism6.0 軟件進行統(tǒng)計分析，P≤0.05 為差異顯著，P≤0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉豆蔻酸抑制豬鏈球菌細胞溶素成孔活性

血細胞被裂解后，其中的血紅素會釋放到體系中，血紅素在543 nm 處有最大吸光值，通過檢測其相對含量可定量評價細胞被裂解程度[23?25]。肉豆蔻酸對豬鏈球菌細胞溶素成孔活性抑制作用見圖1，當反應體系中肉豆蔻酸濃度為0 μg/mL 時，血紅素釋放率為100%，表明血細胞被細胞溶素裂解了，但是隨著肉豆蔻酸濃度的升高，體系中血紅素的比例呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，當肉豆蔻酸濃度為4、8 和16 μg/mL時，血紅素釋放量分別是對照組的77.21%、22.2%和8.88%，即對細胞溶素生物活性抑制率分別為22.79%、77.8%和91.12%，表明肉豆蔻酸可劑量依賴性抑制豬鏈球菌細胞溶素的成孔活性。

圖1 不同濃度肉豆蔻酸對豬鏈球菌細胞溶素溶血活性的影響Fig.1 Effect of myristic acid with different concentrations on the pore-forming activity of suilysin

2.2 肉豆蔻酸抑制細胞溶素寡聚體形成

作為膽固醇依賴型細胞溶素，形成寡聚體刺入細胞膜是其發(fā)揮成孔活性的重要前提[26?27]。本研究通過體外誘導寡聚體形成試驗分析了肉豆蔻酸對豬鏈球菌細胞溶素寡聚體形成的影響，結(jié)果見圖2，當反應體系中沒有肉豆蔻酸時，形成了不同分子量大小的寡聚體，而當體系中加入肉豆蔻酸且隨著其濃度的增加，寡聚體的形成表現(xiàn)出逐漸減少的趨勢，表明肉豆蔻酸通過影響細胞溶素寡聚體的形成抑制其生物活性。

圖2 肉豆蔻酸對豬鏈球菌細胞溶素寡聚體形成的影響Fig.2 Effect of myristic acid on the oligomer formation of suilysin

2.3 肉豆蔻酸與細胞溶素在模擬過程中的穩(wěn)定性

以蛋白質(zhì)初始結(jié)構(gòu)為參照，模擬過程中蛋白主鏈相對初始結(jié)構(gòu)的RMSD 均值為0.60 nm（紅色線），表明蛋白在模擬過程中保持了相對穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，肉豆蔻酸相對蛋白初始結(jié)構(gòu)的RMSD 均值為0.64 nm（黑色線），表明在整個模擬過程中蛋白與配體保持了相對穩(wěn)定的結(jié)合模式。以肉豆蔻酸初始結(jié)構(gòu)為參照，其重原子（非氫原子）相對于初始結(jié)構(gòu)的RMSD 均值為0.24 nm（藍色線），表明肉豆蔻酸在模擬過程中保持了穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)（圖3）。綜上所述模擬過程中蛋白和配體均保持了相對穩(wěn)定的構(gòu)型和結(jié)合模式，可用于后續(xù)分析。

圖3 模擬過程中蛋白和配體的動力學Fig.3 The kinetics of protein and ligand during the molecular simulation

2.4 肉豆蔻酸與細胞溶素的結(jié)合模式

細胞溶素和肉豆蔻酸對接結(jié)果如圖4 所示，肉豆蔻酸結(jié)合到細胞溶素第1、2 和3 結(jié)構(gòu)域的交界處，分布在肉豆蔻酸周圍的氨基酸殘基與其有潛在的相互作用。

圖4 細胞溶素與肉豆蔻酸的結(jié)合模式及結(jié)合位點Fig.4 The binding mode and sites between suilysin and myristic acid

為了進一步確認與肉豆蔻酸相互作用的殘基，通過分子力學/泊松-波爾茲曼表面積（Molecular Mechanics Poisson Boltzmann Surface Area，MMPBSA）方法分析了結(jié)合過程中的總結(jié)合能，結(jié)果如表1 所示，肉豆蔻酸和細胞溶素的總結(jié)合能平均值為?112.39 kJ/mol，表明二者之間有較強的相互作用力，其中范德華作用力?167.68 kJ/mol，靜電相互作用?27.32 kJ/mol，非極性溶劑化能量?20.93 kJ/mol，表明范德華在肉豆蔻酸和細胞溶素的結(jié)合過程中發(fā)揮了非常關(guān)鍵的作用，此外靜電相互作用和非極性溶劑能也促進了二者的結(jié)合。極性溶劑化能為103.53 kJ/mol。

表1 肉豆蔻酸和細胞溶素結(jié)合過程能量值（kJ/mol）Table 1 The energy between myristic acid and suilysin (kJ/mol)

氫鍵是蛋白配體結(jié)合過程中常見的相互作用力，本研究基于GROMACS 軟件分析，發(fā)現(xiàn)4 個氫鍵存在于細胞溶素和肉豆蔻酸的相互作用中，形成氫鍵的殘基分別是84 位和374 位的絲氨酸、372 位的異亮氨酸和82 位的天冬酰胺（表2）。84 位和372位氨基酸殘基和肉豆蔻酸形成氫鍵在模擬過程中存在率均為90%，表明這兩個氫鍵是穩(wěn)定存在的，而另外兩個氫鍵的存在率分別為10%和30%，表明這兩個氫鍵并非穩(wěn)定存在于整個模擬過程中。因此84 位和372 位殘基與配體形成氫鍵對穩(wěn)定復合物體系有較大貢獻。

表2 肉豆蔻酸與細胞溶素結(jié)合過程氫鍵詳情Table 2 The details of H-bond between myristic acid and suilysin

2.5 細胞溶素與肉豆蔻酸的結(jié)合能分析

分子力學/泊松-波爾茲曼表面積方法（MMPBSA）廣泛應用于蛋白配體相互作用能分析[28?30]，本研究為了進一步明確細胞溶素和肉豆蔻酸的結(jié)合位點，基于MMPBSA 結(jié)合能分析程序包，分析了結(jié)合過程中每個氨基酸殘基的能量貢獻，各個氨基酸殘基分解能量見圖5A，其中82Asn、83Asn、84Ser、87Ile、88Ala、90Ile、193Phe、194Gly、275Phe、372Ile、373Leu、374Ser 有相對較大的總能量貢獻值，表明這些殘基是結(jié)合過程中的關(guān)鍵殘基。進一步分析了殘基各個能量分項的貢獻值，結(jié)果如圖5B 所示，上述12 個殘基與肉豆蔻酸都有較強的范德華作用力，再次證實范德華是二者結(jié)合的重要作用方式，此外84Ser、372Ile和374Ser 與肉豆蔻酸有較大的靜電相互作用，說明靜電作用是細胞溶素和肉豆蔻酸另一種重要的相互作用力。

圖5 細胞溶素與肉豆蔻酸的結(jié)合能Fig.5 The binding energy between myristic acid and suilysin

2.6 結(jié)合位點的確證

為了進一步確認，分析了結(jié)合過程中各殘基與肉豆蔻酸的距離，從結(jié)合過程中細胞溶素各個殘基與肉豆蔻酸的距離（圖6A）中發(fā)現(xiàn)上述能量貢獻較大的殘基與肉豆蔻酸有更近的距離（圖6B）。均方根波動數(shù)值（RMSF）可反映原子或殘基的柔性，本研究分別分析了蛋白質(zhì)在結(jié)合配體前后的RMSF 值，發(fā)現(xiàn)蛋白結(jié)合小分子后各殘基的RMSF 值（尤其是上述能量貢獻較大的殘基）較結(jié)合小分子前小（圖6C），表明結(jié)合小分子后，這些殘基受到了束縛，變得剛性。

圖6 細胞溶素與肉豆蔻酸距離及結(jié)合前后殘基柔性變化Fig.6 The distance between suilysin and myristic acid and the flexibility of residues before and after binding with myristic acid

2.7 肉豆蔻酸的抗豬鏈球菌活性

細菌在長期生存壓力下會進化出耐藥性，本研究根據(jù)MIC 試驗結(jié)果判定標準（肉眼觀察沒有細菌生長的最小濃度定義為肉豆蔻酸的最低抑菌濃度）確定肉豆蔻酸對豬鏈球菌的最低抑菌濃度為128 μg/mL，表明肉豆蔻酸無抗豬鏈球菌活性，不會對該菌造成生長壓力。

2.8 肉豆蔻酸緩解豬鏈球菌及細胞溶素介導的細胞毒性

細胞溶素與細胞膜上的膽固醇結(jié)合后形成寡聚體刺入細胞膜會引發(fā)細胞毒性作用，研究表明豬鏈球菌細胞溶素的細胞毒性作用在其致病性中發(fā)揮重要作用[31?32]，因此藥物緩解細胞溶素介導的細胞毒性有望延遲豬鏈球菌感染病程的發(fā)展。細胞受外界刺激死亡后，其中的乳酸脫氫酶（LDH）會釋放到外環(huán)境，該酶在490 nm 處有最大吸光值；本研究通過檢測乳酸脫氫酶活性分別評價了肉豆蔻酸對細胞溶素和豬鏈球菌介導的細胞毒性的緩解效果。以細胞溶素或豬鏈球菌處理組釋放的乳酸脫氫酶作為參比，當加入肉豆蔻酸處理后，LDH 釋放量顯著減少（P<0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系（圖7A、7B），表明肉豆蔻酸可在細胞水平顯著緩解細胞溶素或豬鏈球菌引發(fā)的細胞毒性作用。

圖7 肉豆蔻酸緩解細胞溶素及豬鏈球菌介導的細胞毒性Fig.7 The alleviatory effects of myristic acid on the cytotoxicity mediated by suilysin and Streptococcus sui

3 討論

細胞溶素可從多個方面促進豬鏈球菌的致病性，是抗豬鏈球菌感染抑制劑開發(fā)重要靶標[27,33]。成孔活性是細胞溶素發(fā)揮生物學功能的基礎，本研究基于成孔活性試驗發(fā)現(xiàn)食源性成分肉豆蔻酸濃度在16 μg/mL 時對細胞溶素成抗活性抑制率達到90%以上。作為膽固醇依賴型細胞溶素家族成員，形成寡聚體對其發(fā)揮成孔活性至關(guān)重要，于是推測肉豆蔻酸可能直接與細胞溶素結(jié)合并影響了其寡聚體的形成，體外誘導寡聚試驗證實在16 μg/mL 時肉豆蔻酸顯著抑制了細胞溶素寡聚體的形成。

細胞溶素蛋白由四個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，每一個結(jié)構(gòu)域在寡聚體的形成過程中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，任何一個結(jié)構(gòu)域構(gòu)象變化都會影響寡聚體的形成[34]。本研究為了深入分析肉豆蔻酸與細胞溶素的作用機制，開展了分子對接和對子動力學模擬試驗，發(fā)現(xiàn)肉豆蔻酸可直接結(jié)合到豬鏈球菌細胞溶素的第一、第二和第三結(jié)構(gòu)域的交界處，并通過能量分解，殘基柔性變化及距離分析等確定87Ile、193Phe、194Gly、275Phe、372Ile 和373Leu 等氨基酸殘基是二者結(jié)合過程中的關(guān)鍵殘基。

作為豬鏈球菌的關(guān)鍵毒力因子，細胞溶素的成孔活性能導致細胞裂解，內(nèi)容物釋放，引發(fā)細胞毒性[11,15]，因此緩解其細胞毒性作用可在一定程度上延遲豬鏈球菌感染疾病的進程。本研究發(fā)現(xiàn)肉豆蔻酸濃度在16 μg/mL 時對細胞溶素和豬鏈球菌引發(fā)的細胞毒性分別降低了32.16%和54.28%。

4 結(jié)論

本文首次發(fā)現(xiàn)食源性生物活性成分肉豆蔻酸可直接結(jié)合到豬鏈球菌細胞溶素的第一、第二和第三結(jié)構(gòu)域的交界處，并在濃度為16 μg/mL 通過抑制細胞溶素寡聚體形成，對其成孔活性抑制率達91.12%。無抗菌活性的肉豆蔻酸（MIC=128 μg/mL）在濃度為16 μg/mL 時對細胞溶素和豬鏈球菌引發(fā)的細胞毒性分別降低了32.16%和54.28%。以上結(jié)果表明肉豆蔻酸有望作為先導化合物被開發(fā)為抗豬鏈球菌感染的臨床藥物，作用機制的闡明為該化合物更好更快地應用于實際提供了重要理論基礎。