張亮，唐麗亞，龍軼映，曹佳男，劉梨，趙凌云，瞿啟睿，祁芳，艾坤

〔摘要〕 目的 觀察電針對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis， AA）大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2， VEGFR2）/細(xì)胞分裂周期蛋白42（cell division cycle 42， Cdc42）信號(hào)通路的影響，探究電針治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）的可能機(jī)制。方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只SPF級(jí)SD雄性大鼠分成空白組、模型組、西藥組和電針組，每組10只。模型組、西藥組、電針組大鼠采用尾根部皮下注射不完全弗氏佐劑（0.1 mL/只）制成AA大鼠模型。造模后第2天即開(kāi)始干預(yù)，電針組進(jìn)行電針干預(yù)，每次20 min，每天干預(yù)1次，共21次，西藥組給予甲氨蝶呤灌胃給藥，每周1次，共3次。觀察各組體質(zhì)量、關(guān)節(jié)紅腫等一般情況；每3 d測(cè)量1次大鼠后雙側(cè)足跖容積，干預(yù)結(jié)束后，通過(guò)大鼠一般情況、體質(zhì)量、足跖容積分析各組大鼠足跖腫脹程度， HE觀察各組大鼠滑膜組織的病理形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織內(nèi)VEGFR2、CD34表達(dá)變化，Western blot檢測(cè)大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織VEGFR2、Cdc42蛋白表達(dá)量。結(jié)果 與空白組相比，模型組大鼠第21天足跖容積均明顯增大（P＜0.01），膝關(guān)節(jié)滑膜組織出現(xiàn)了顯著性病理改變，CD34表達(dá)量明顯升高（P＜0.01），VEGFR2、Cdc42蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，西藥組、電針組大鼠足趾容積明顯減?。≒＜0.01），膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理改變明顯改善，VEGFR2、Cdc42表達(dá)量顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 電針改善RA的作用機(jī)制可能與降低VEGFR2、Cdc42的表達(dá)從而抑制血管新生有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 佐劑性關(guān)節(jié)炎；電針；VEGFR2；Cdc42；血管新生；內(nèi)皮細(xì)胞；偽足

〔中圖分類號(hào)〕R245.9? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.07.024

Effects of electroacupuncture on VEGFR2/Cdc42 signaling pathway

of knee synovial tissue in rats with adjuvant arthritis

ZHANG Liang1， TANG Liya1， LONG Yiying1， CAO Jianan1， LIU Li2， ZHAO Lingyun1， QU Qirui1，

QI Fang1*， AI Kun1*

1. School of Acupuncture-moxibustion， Tuina and Rehabilitation， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of electroacupuncture on vascular endothelial growth factor receptor 2 （VEGFR2）/cell division cycle 42 （CDC42） signaling pathway of knee synovial tissue in rats with adjuvant arthritis （AA）， so as to explore possible mechanism of electroacupuncture in alleviating rheumatoid arthritis （RA）. Methods A total of 40 male SPF SD rats were randomly divided into blank group， model group， western medicine group， and electroacupuncture group， with 10 rats in each group. AA rat models were made by subcutaneous injection of incomplete Freund's adjuvant （0.1 mL/rat） at the tail root of rats in model， western medicine， and electroacupuncture groups. On the second day after modeling， the rats in electroacupuncture group were given electroacupuncture for 20 min， once a day， for a total of 21 times， while the rats in western medicine group were given methotrexate intragastrically once a week for 3 times. Then， the general conditions including redness and swelling of joints， body weight， and others in each group were observed. And the volume of bilateral hind paws was measured once every 3 days. After the intervention， the degree of paw swelling of rats in each group was analyzed through the observation of general conditions and the measurement of plantar volume. Meanwhile， the pathomorphological changes of knee synovial tissue was observed by HE staining， the expressions of VEGFR2 and CD34 in synovial tissue of knee joint were determined by immunohistochemistry （IHC）， and the protein expressions of VEGFR2 and Cdc42 were examined by Western blot. Results Compared with blank group， the plantar volume of rats in model group increased significantly on the 21st day （P<0.01）， the synovial tissue of knee joint showed significant pathological changes， the expression level of CD34， and the protein expression levels of VEGFR2 and Cdc42 were significantly higher （P<0.01）. Compared with model group， the plantar volume of rats in western medicine and electroacupuncture groups significantly reduced （P<0.01）， the pathological changes of synovial tissue of knee joint were significantly improved， and the expression levels of VEGFR2 and Cdc42 were significantly lower （P<0.05， P<0.01）. Conclusion The mechanism of electroacupuncture in improving RA may be related to the inhibition of angiogenesis by reducing the expressions of VEGFR2 and Cdc42.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 adjuvant arthritis; electroacupuncture; vascular endothelial growth factor receptor 2; cell division cycle 42; angiogenesis; endothelial cells; pseudopod

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要臨床表現(xiàn)的慢性自身免疫性疾病，血管翳是RA病變過(guò)程中的特征性產(chǎn)物，滑膜血管新生被認(rèn)為是構(gòu)成和維持血管翳的關(guān)鍵[1]。因此，抑制滑膜血管新生可作為治療RA的重要靶點(diǎn)之一。研究證實(shí)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）及其信號(hào)通路參與血管新生的全部過(guò)程，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2， VEGFR2）是影響血管生成重要的受體之一[2-3]。VEGFR2活化后可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)其胞漿內(nèi)位點(diǎn)Tyr1214磷酸化后激活細(xì)胞分裂周期蛋白42（cell division cycle 42， Cdc42），促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞偽足生成及其遷移，從而促進(jìn)血管新生[4-5]。因此，抑制VEGFR2/Cdc42信號(hào)通路可作為抑制RA血管新生的重要思路。本課題組前期研究證實(shí)，電針能有效治療RA，緩解炎性反應(yīng)，且組織形態(tài)學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針干預(yù)后滑膜血管新生受到抑制且未見(jiàn)明顯血管翳[6-7]；CHEN等[8]研究表明，電針調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞血管新生與VEGFR2表達(dá)密切相關(guān)。目前，圍繞電針抑制RA滑膜組織血管新生的機(jī)制研究尚不多見(jiàn)。因此，本研究選用佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis， AA）大鼠模型，采用電針干預(yù)，從調(diào)控VEGFR2/Cdc42信號(hào)通路抑制血管新生角度，探討電針治療RA血管新生的作用機(jī)制，為電針治療RA的臨床運(yùn)用提供科學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供的40只SPF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量（100±10） g，動(dòng)物合格證號(hào)：430727211101621817，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0009。40只大鼠以3只一籠飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)室溫度為（23±3） ℃，相對(duì)濕度60%±10%。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，按隨機(jī)數(shù)字表法將其分成空白組、模型組、西藥組、電針組，每組10只。實(shí)驗(yàn)全程遵從《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》（2006年版）中動(dòng)物倫理學(xué)有關(guān)條規(guī)，本實(shí)驗(yàn)倫理編號(hào)：LLBH-202203140004。

1.2? 主要試劑與儀器

滅活結(jié)核分枝桿菌（美國(guó)BD公司，批號(hào)：231141）；礦物油（美國(guó)Sigma Aldrich公司，批號(hào)：M8410）；VEGFR2抗體、Cdc42抗體、β-actin抗體、Rabbit二抗（美國(guó)Proteintech Group公司，批號(hào)分別為26415、10155、20536、SA00001-2）。

華佗牌電針治療儀（蘇州醫(yī)療用品有限公司，型號(hào)：SDZ-Ⅱ型）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠，型號(hào)：SW-CJ-1FD）；高速低溫離心機(jī)（美國(guó)SCILOGBX公司，型號(hào)：D3024R）；電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司，型號(hào)：041BR126545）；GloMax酶標(biāo)儀（美國(guó)Promega公司，型號(hào)：GM3030）；磁力恒溫?cái)嚢杵鳎ń饓谐俏鞣鍗槑V實(shí)驗(yàn)儀器廠，型號(hào)：HJ-4A）；足跖容積測(cè)量?jī)x（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：YLS-7C）。

1.3? 模型制備

本實(shí)驗(yàn)采用不完全弗氏佐劑注射尾根部皮下組織造成的佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型[9-10]。將定量的滅活結(jié)核分枝桿菌與礦物油在通風(fēng)柜中混合研磨至溶液清透無(wú)雜質(zhì)，制成2.5 mg/mL的不完全弗氏佐劑。然后依次將模型組、西藥組、電針組大鼠用異氟烷呼吸麻醉，用0.1 mL的微量注射器于尾根部皮下緩慢注射佐劑（0.1 mL/只）。觀察關(guān)節(jié)外表現(xiàn)進(jìn)行模型評(píng)價(jià)，若大鼠出現(xiàn)足爪紅腫，全身及關(guān)節(jié)繼發(fā)癥狀，提示造模成功。大鼠造模3 d后尾根部開(kāi)始紅腫，第9～12天尾根部脫皮甚至潰爛，后足關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫，第15～18天到達(dá)峰值，后足紅腫加劇，甚至前肢、耳部也出現(xiàn)紅腫、體質(zhì)量下降等。

1.4? 干預(yù)方法

于造模第2天開(kāi)始干預(yù)，空白組、模型組大鼠以仰臥位固定于自制鼠板上20 min，不做其他處理，每天1次，共21次。電針組大鼠同法仰臥位固定于鼠板上，牙齒用牙線固定，使用華佗牌針灸針（0.25 mm×25 mm），遵循大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位定位圖譜定位，左側(cè)足三里與關(guān)元配穴，右側(cè)足三里與同側(cè)阿是穴配穴，接電針，選擇疏密波（20/50 Hz的頻率），電流強(qiáng)度通過(guò)觀察針柄處抖動(dòng)情況來(lái)判斷，輕微抖動(dòng)即可，留針20 min，每天1次，1個(gè)療程7次，共3個(gè)療程（21次）。西藥組使用陽(yáng)性對(duì)照藥物甲氨蝶呤，按0.35 mg/kg每只計(jì)算灌胃給藥[11]，每周1次，共3個(gè)療程（3次）。

1.5? 取材

于干預(yù)第21天后禁食禁水，隔天在無(wú)菌操作臺(tái)上用刀片撥開(kāi)大鼠膝關(guān)節(jié)囊，取出清透淡黃色的滑膜組織，放入做好標(biāo)記的凍存管中，于液氮中保存。

1.6? 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1? 一般情況觀察? 于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察大鼠飲食、毛發(fā)、體質(zhì)量、關(guān)節(jié)腫脹等一般情況，進(jìn)行前后比較。

1.6.2? 足跖容積測(cè)量? 測(cè)量前，用防水不掉色黑色記號(hào)筆在大鼠后足踝關(guān)節(jié)處標(biāo)好測(cè)量標(biāo)線，為減少人為誤差，注意每次測(cè)量標(biāo)線以及測(cè)足腫均由專人完成，并且每次標(biāo)線的位置不宜有較大偏差，應(yīng)在第1次測(cè)量時(shí)使用墨水針頭標(biāo)記作為標(biāo)線固點(diǎn)。將足跖容量測(cè)量?jī)x放置水平固定的臺(tái)面上，進(jìn)行校零，量杯中裝適中蒸餾水，測(cè)量時(shí)測(cè)量者先將大鼠一側(cè)后足抻直，放進(jìn)裝有適量水的量杯中，直到后足的標(biāo)線與量杯中液面平行，重復(fù)3次，再換下一側(cè)后足，記錄讀數(shù)，后取其平均數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。在造模后第1、9天及以后每隔3 d進(jìn)行1次足跖容積的測(cè)量。

1.6.3? HE染色? 備取已經(jīng)固定好的膝關(guān)節(jié)滑膜組織，標(biāo)定組號(hào)，流水清洗2 h，然后取出滑膜組織進(jìn)行脫水，于56 ℃的石蠟浸泡進(jìn)行包埋，包埋成塊后，將石蠟置于切片機(jī)中，切分成5 μm的石蠟片，石蠟片放入水浴鍋后展開(kāi)貼在載玻片上進(jìn)行烘干，60 ℃烘箱2 h。脫蠟后放入蘇木精溶液中染色5 min，接著使用蒸餾水沖洗，浸透于1%氨水中返藍(lán)，清水沖洗30～60 s后，于顯微鏡下觀察細(xì)胞核的分色程度，之后置于1%伊紅中染色，蒸餾水沖洗后脫水，最后每個(gè)組織滴加一點(diǎn)中性樹(shù)膠，蓋上蓋玻片。每個(gè)片子分別拍100×視野。

1.6.4? 免疫組織化學(xué)檢測(cè)? 備取已經(jīng)固定好的膝關(guān)節(jié)滑膜組織，標(biāo)定組號(hào)，流水清洗2 h，然后取出滑膜組織，依次浸透于不同濃度的乙醇、二甲苯中進(jìn)行脫水，然后于56 ℃的石蠟浸泡進(jìn)行包埋，包埋成塊后將石蠟置于切片機(jī)中，切分成5 μm的石蠟片，石蠟片放入水浴鍋后展開(kāi)貼在載玻片上進(jìn)行烘干，60 ℃烘箱2 h。脫蠟后放置于高壓噴氣中抗原修復(fù)，噴水致冷后將石蠟片放入10%羊血清中，室溫進(jìn)行封閉1 h，去除封閉液后，滴加抗體，37 ℃孵育1 h后，PBS清洗5 min，4次。接著加相對(duì)應(yīng)的二抗孵育，孵育后PBS搖洗5 min，10次。之后配備DAB顯色液，即配即用，顯微鏡觀察顯色，然后復(fù)染、脫水。每個(gè)切片上滴注些許中性樹(shù)膠后蓋上蓋玻片，每個(gè)片子分別拍400×視野。

1.6.5? Western blot檢測(cè)? 備取100 mg膝關(guān)節(jié)滑膜組織樣本，隨后加定量混有蛋白酶、磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，攪勻混合溶液，使用勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿4 min，再將得到的樣品裂解30 min，裂解全程均在冰上操作，裂解完全后4 ℃、12 000 r/min離心20 min，利用BCA蛋白質(zhì)定量法測(cè)定離心后得到的上清液蛋白質(zhì)濃度，得到蛋白質(zhì)樣品液。取蛋白質(zhì)樣品液30 μg，加上一定蛋白質(zhì)上樣緩沖液，放入恒溫槽中沸水浴10 min，再10 000 r/min離心10 min；隨之計(jì)算蛋白質(zhì)分子量，來(lái)選擇制備10％或是12%的分離膠、濃縮膠，將之電泳，接著進(jìn)行電轉(zhuǎn)，將膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜；下一步進(jìn)行封閉，將PVDF膜全部浸泡于封閉液里，室溫25 ℃，孵育1 h后搖洗3次，每次10 min；而后分別加入VEGFR2、Cdc42蛋白的一抗，放入4 ℃冰箱過(guò)夜，隔天用PBST洗膜，每次20 min，搖洗3次后，使用移液槍吹打入相對(duì)應(yīng)的二抗溶液，室溫25 ℃孵育1 h；隨之再用PBST搖洗3次，每次10 min，最后滴加顯影液，反應(yīng)2 min后進(jìn)行曝光顯影，得到條帶采用Image J軟件施行灰度分析，數(shù)據(jù)根據(jù)相對(duì)應(yīng)的內(nèi)參對(duì)比，以對(duì)照組進(jìn)行歸一化處理，用于分析最終結(jié)果。

1.7? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以“ｘ±s”表示，所有資料均進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)：符合正態(tài)分布者采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布者采用非參數(shù)檢驗(yàn)。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 一般情況

模型組大鼠活動(dòng)及飲食減少，于造模后第3～5天尾根部出現(xiàn)脫皮紅腫，甚至出現(xiàn)潰爛，第9～12天后足、關(guān)節(jié)、耳朵、眼角陸續(xù)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紅腫，第15～18天癥狀達(dá)到高峰期。與空白組相比，其余3組體質(zhì)量于造模后第1天差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組體質(zhì)量于造模后第9天增長(zhǎng)緩慢（P＜0.05），第15、21天增長(zhǎng)明顯緩慢（P＜0.01）；西藥組、電針組體質(zhì)量于造模后第9、15天差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第21天增長(zhǎng)明顯緩慢（P＜0.01）。與模型組相比，西藥組、電針組造模后第1、9天差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），造模后第15天增長(zhǎng)明顯緩慢（P＜0.01）；西藥組造模后第21天差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；電針組造模后第21天增長(zhǎng)明顯緩慢（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖1A。

2.2? 各組大鼠足跖容積比較

與空白組相比，其余3組足跖容積于造模后第1、9天差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組在第15、21天足跖容積均明顯增大（P＜0.01），提示模型制備成功；電針組與西藥組第15、21天均明顯增大（P＜0.05）。與模型組相比，其余3組于造模后第1、9天差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；西藥組足跖容積在第15、21天均顯著減?。≒＜0.01）；電針組在第21天明顯減?。≒＜0.01）。詳見(jiàn)圖1B。

2.3? 各組大鼠滑膜組織病理結(jié)果的比較

空白組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織內(nèi)襯層細(xì)胞排列規(guī)則（圖2箭頭①），未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與空白組相比，模型組大鼠滑膜組織結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)異常，滑膜組織出現(xiàn)一定增生，膠原纖維組織可見(jiàn)大面積增生（圖2箭頭②）、諸多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2箭頭③）、大量血管增生（圖2箭頭④）。與模型組相比，電針組和西藥組大鼠滑膜結(jié)構(gòu)較好，細(xì)胞密度明顯降低，一定程度緩解滑膜增生，出現(xiàn)較小面積的膠原纖維組織增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組少，偶見(jiàn)血管生成。

2.4? 各組大鼠滑膜組織中VEGFR2、CD34表達(dá)水平比較

空白組大鼠滑膜組織顯見(jiàn)極少量VEGFR2表達(dá)，與空白組相比，模型組大鼠VEGFR2表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；與模型組相比，西藥組和電針組VEGFR2蛋白表達(dá)量減少（P＜0.01）?？瞻捉M大鼠滑膜組織見(jiàn)少量CD34蛋白表達(dá)，與空白組滑膜組織相比，模型組CD34表達(dá)明顯增加（P＜0.01），表明血管生成增加；與模型組相比，西藥組和電針組CD34蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.01）。詳見(jiàn)圖3。

2.5? 各組大鼠滑膜組織中VEGFR2、Cdc42蛋白表達(dá)水平比較

與空白組相比，模型組大鼠滑膜組織中VEGFR2、Cdc42蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，西藥組、電針組VEGFR2、Cdc42蛋白表達(dá)量均明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。詳見(jiàn)圖4。

3 討論

RA在中醫(yī)學(xué)中屬于“痹病”范疇，多由“正氣不足，復(fù)感外邪”，內(nèi)外相合發(fā)病。虛實(shí)夾雜、本虛標(biāo)實(shí)為其病機(jī)特點(diǎn)，臨床多采用扶正祛邪、標(biāo)本兼治的治療原則。針灸治療RA歷史悠久，具有扶正祛邪、通經(jīng)活絡(luò)等功效[12-13]。針灸治療痹病一般情況下配方選穴以炎癥累及部位的局部選穴為主，同時(shí)配以遠(yuǎn)部取穴[14]。局部選穴多選疼痛劇烈處，即“阿是穴”，能通經(jīng)活絡(luò)、消腫止痛；遠(yuǎn)部取穴多選用“足三里”“關(guān)元”等培正固元、補(bǔ)益氣血的穴位。故本研究選用電針“足三里”“關(guān)元”和“阿是穴”干預(yù)AA模型大鼠。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，相比于空白組，模型組大鼠足跖容積在第15、21天顯著增加（P＜0.01），電針干預(yù)后第21天明顯減小（P＜0.01），這與既往研究[6-7]一致。組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，模型組大鼠滑膜組織結(jié)構(gòu)排列異常，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，血管生成增多，電針干預(yù)后滑膜組織結(jié)構(gòu)較好，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管生成明顯減少。CD34為血管特異性標(biāo)志物[15]，免疫組化結(jié)果顯示與空白組比較，模型組表達(dá)明顯增加（P＜0.01），電針干預(yù)后CD34表達(dá)明顯下降（P＜0.01），提示電針干預(yù)后RA滑膜血管數(shù)量減少。因此，初步證實(shí)電針可有效抑制RA滑膜組織血管新生。另外，Western blot結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGFR2、Cdc42表達(dá)均明顯增多（P＜0.01），電針干預(yù)后，電針組VEGFR2、Cdc42表達(dá)量明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），VEGFR2的免疫組化結(jié)果也佐證了這種趨勢(shì)，這提示VEGFR2/Cdc42信號(hào)通路可能在這一過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。

血管新生是RA病程中侵蝕骨與軟骨的重要病理基礎(chǔ)，是促進(jìn)滑膜增生和炎癥發(fā)展的早期核心病理事件[16-17]。內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell， EC）遷移是滑膜血管新生的重要環(huán)節(jié)，偽足生成在細(xì)胞遷移中占有重要位置[18-19]，因此，可以通過(guò)抑制偽足生成來(lái)抑制血管新生。偽足生成由多條復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)通路共同調(diào)控的，研究表明，VEGF可特異性作用在EC上，通過(guò)與EC 表面的VEGFR2結(jié)合，激活小鳥(niǎo)苷酸三磷酸（Rho GTP）酶，引發(fā)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，刺激EC偽足生成[20]。Rho GTP酶是調(diào)節(jié)EC遷移、形態(tài)發(fā)生的關(guān)鍵因子，是細(xì)胞骨架的中心調(diào)節(jié)者，可以調(diào)節(jié)偽足的形成，Cdc42是其關(guān)鍵成員之一[21-22]。VEGF與VEGFR2 結(jié)合后將胞外信號(hào)傳遞至胞內(nèi)，引起VEGFR2細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中的Tyr1214位點(diǎn)磷酸化并激活下游Rho GTP酶的成員Cdc42，Cdc42從不活躍的GDP結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)換到活躍的GTP結(jié)合態(tài)，活化的GTP結(jié)合態(tài)的Cdc42通過(guò)調(diào)控下游信號(hào)分子介導(dǎo)EC上絲狀偽足的動(dòng)態(tài)變化，直接影響EC遷移方向，最終導(dǎo)致血管新生[23-25]。

CD34是公認(rèn)的血管特異性標(biāo)志物，標(biāo)記的細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)以VEGFR2及其下游Cdc42為切入點(diǎn)展開(kāi)研究，結(jié)合組織形態(tài)學(xué)結(jié)果及血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD34免疫組化結(jié)果，觀察到模型組大鼠滑膜組織中CD34較空白組表達(dá)明顯升高（P＜0.01），說(shuō)明模型大鼠血管新生增多，電針干預(yù)后CD34表達(dá)降低（P＜0.01），提示血管新生較少。VEGFR2免疫組化結(jié)果也同樣符合這種趨勢(shì)，這表明VEGFR2可能是電針發(fā)揮抑制血管新生的關(guān)鍵信號(hào)途徑。同時(shí)，本研究Western blot結(jié)果顯示，模型組大鼠滑膜組織中VEGFR2、Cdc42較空白組大鼠表達(dá)均明顯增多（P＜0.01），電針干預(yù)后VEGFR2、Cdc42蛋白表達(dá)量明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），提示電針可能通過(guò)抑制VEGFR2的表達(dá)，從而下調(diào)Cdc42的活性，抑制血管新生，減少血管翳浸潤(rùn)，減輕關(guān)節(jié)腫脹。因此，這提示電針抑制AA模型大鼠滑膜血管新生可能是由VEGFR2/Cdc42信號(hào)通路所介導(dǎo)。

綜上所述，電針治療RA的效應(yīng)機(jī)制可能是通過(guò)抑制VEGFR2/Cdc42信號(hào)通路，抑制內(nèi)皮細(xì)胞偽足生成及其遷移，從而抑制RA血管新生，改善關(guān)節(jié)癥狀，為電針抑制RA血管新生提供了一定的證據(jù)支持。為了更進(jìn)一步確定VEGFR2/Cdc42信號(hào)通路在電針抑制RA血管新生的作用機(jī)制，后續(xù)將通過(guò)設(shè)置其信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的阻斷劑或激動(dòng)劑展開(kāi)研究，同時(shí)補(bǔ)充內(nèi)皮細(xì)胞偽足生成直接證據(jù)的檢測(cè)。

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（本文編輯? 匡靜之）