宋雪飛，周 慶*，張迎穎，張志勇，王 巖，惲臺(tái)紅

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，國(guó)家農(nóng)業(yè)科學(xué)農(nóng)業(yè)環(huán)境六合觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長(zhǎng)江下游平原農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014；2. 常州市武進(jìn)區(qū)前黃鎮(zhèn)農(nóng)技農(nóng)機(jī)站，江蘇 常州 213172)

澳洲淡水龍蝦(Cheraxquadricarinatus)又名紅螯螯蝦，為甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、擬鰲蝦科(Parastacidae)、滑鰲蝦屬(Cherax)動(dòng)物，因具有許多水生生物學(xué)和水產(chǎn)商業(yè)特性，而成為既熱門又重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種之一[1]。但近年來隨著養(yǎng)殖環(huán)境惡化，飼料中抗生素類添加劑的濫用所帶來的細(xì)菌耐藥性、藥物殘留、抗病力減弱等負(fù)面影響[2-6]，以及水體污染及病害暴發(fā)等一系列問題，不僅嚴(yán)重困擾著澳洲淡水龍蝦養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模化發(fā)展，也對(duì)人類健康存在潛在的威脅[7-9]。因此，研究出無污染、無殘留、無耐藥性的綠色環(huán)保型的非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑，是當(dāng)前推動(dòng)澳洲淡水龍蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵所在。

非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑不僅可以降低養(yǎng)殖成本，還可以提高水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益，其在國(guó)內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展態(tài)勢(shì)愈來愈受重視。已有研究報(bào)道，非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑中草藥提取物、膽汁酸、微生態(tài)制劑可在一定程度上提高水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[10-11]。檸檬酸作為一種酸化劑、抗應(yīng)激劑，在豬、雞等畜禽動(dòng)物方面已有很多報(bào)道[12-13]。在水產(chǎn)動(dòng)物方面，有研究發(fā)現(xiàn)在不改變對(duì)蝦餌料基礎(chǔ)配方的前提下，添加檸檬酸可提高其生長(zhǎng)速度，降低飼料系數(shù)和成本[14-15]，但在水產(chǎn)飼料中檸檬酸添加量一般不超過0.5%[16-17]。復(fù)合酶應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖方面，可提高水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)飼料消化吸收率和免疫力，改善動(dòng)物消化機(jī)能和水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境[18]。黃峰等[19]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物飼料添加外源復(fù)合酶，不僅可提高草魚對(duì)飼料的消化率，還提高了其特定生長(zhǎng)率和增重率。益生菌可定植于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物腸道內(nèi)，平衡宿主腸道微生物區(qū)系或調(diào)節(jié)機(jī)體黏膜，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，增強(qiáng)養(yǎng)殖對(duì)象的免疫力[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌和芽孢桿菌作為飼料添加劑，可明顯促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生長(zhǎng)、提高腸道消化酶活性和增強(qiáng)機(jī)體的免疫力[22-24]；投喂芽孢桿菌可以改善養(yǎng)殖鱖(Sinipercachuatsi)的池塘水質(zhì)[25]；枯草芽孢桿菌和光合細(xì)菌的復(fù)合菌對(duì)淡水養(yǎng)殖水質(zhì)也具有凈化作用[26]。目前，對(duì)根瘤菌在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用已有許多研究，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用較少。李海兵等[27]研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加根瘤菌對(duì)中國(guó)對(duì)蝦(Penaeuschinensis)仔蝦的腸道具有保護(hù)作用。管振國(guó)等[28]研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加根瘤菌的最適劑量為 2 g/kg，可以提高凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)存活率、肥滿度、特定生長(zhǎng)率、抗氧化酶活性及增強(qiáng)抗病能力，促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)。

澳洲淡水龍蝦是1992年引進(jìn)的品種，近年才逐步受到市場(chǎng)青睞[29]。目前，針對(duì)澳洲淡水龍蝦非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑的研究報(bào)道較少，因此篩選獲得適合澳洲淡水龍蝦生長(zhǎng)的飼料添加劑很有必要。本研究探討了4種非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑對(duì)澳洲淡水龍蝦肝胰腺消化酶、免疫酶活力及離體消化率的影響，篩選出適宜的非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑，旨在為澳洲淡水龍蝦飼料配制提供參考，促進(jìn)澳洲淡水龍蝦養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

澳洲淡水龍蝦由蘇州恒洋澳龍農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。澳洲淡水龍蝦的飼料為中山統(tǒng)一企業(yè)有限公司生產(chǎn)的南美白對(duì)蝦配合飼料。該飼料粗蛋白質(zhì)含量≥41%、粗脂肪含量≥4%；其主要原料組成依次為魚粉、面粉、豆粕、烏賊內(nèi)臟粉、魚油、大豆磷脂油、維生素、礦物質(zhì)等。檸檬酸購(gòu)于南京杰百柯生物科技有限公司；復(fù)合酶制劑購(gòu)于青島根源生物科技有限公司；益生菌選用的是植物乳桿菌(LactobacillusplantarumBNCC192567)，購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisB2 )和根瘤菌(Rhizobiumrosettiformans3-20)均來自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所污染水體生態(tài)修復(fù)團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室篩選的保藏菌株。

1.2 飼料制備

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以及相關(guān)文獻(xiàn)[30-33]，本試驗(yàn)分別將檸檬酸、復(fù)合酶制劑用純水稀釋至0.2%，再均勻地噴灑到飼料上，編號(hào)依次為Ⅰ號(hào)和Ⅱ號(hào)飼料。Ⅲ號(hào)飼料添加1∶1的植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌、Ⅳ號(hào)飼料添加1∶1的根瘤菌和枯草芽孢桿菌。Ⅲ號(hào)和Ⅳ號(hào)飼料添加方式均是將益生菌稀釋至1×107CFU/g，然后均勻地噴灑到飼料上。將制備好的飼料放置于4 ℃冰箱，7 d內(nèi)暫存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 澳洲淡水龍蝦養(yǎng)殖管理

澳洲淡水龍蝦養(yǎng)殖試驗(yàn)于室內(nèi)養(yǎng)殖箱中進(jìn)行，水溫為26～30 ℃、pH值為7.0～7.3、持續(xù)曝氣增氧的環(huán)境下溶解氧(DO)>6 mg·L-1，其他水質(zhì)指標(biāo)維持在澳洲淡水龍蝦適宜的養(yǎng)殖范圍內(nèi)，暫養(yǎng)馴化3 d。挑選規(guī)格均勻[平均體重(25.0±2.5)g]、肢體完整、無外表病癥、活力好的個(gè)體進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)置5組，分別是添加檸檬酸(S-Ⅰ)、復(fù)合酶制劑(S-Ⅱ)、植物乳桿菌加枯草芽孢桿菌(S-Ⅲ)、根瘤菌加枯草芽孢桿菌(S-Ⅳ)處理組和不添加任何物質(zhì)的基礎(chǔ)飼料對(duì)照組(S-CK)，每組設(shè)置3個(gè)平行。養(yǎng)殖箱規(guī)格為 530 cm×380 cm×290 cm，水深15～20 cm。每個(gè)養(yǎng)殖箱養(yǎng)殖20尾蝦，并放置6個(gè)瓦片作為遮蔽物。每日投喂飼料2次，早上8點(diǎn)和下午5點(diǎn)，每日的投喂量約為蝦體質(zhì)量的6%，次日清除殘餌和糞便，每日換水1次，每次換水1/3，飼養(yǎng)試驗(yàn)周期為14 d。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 酶活力

將活蝦置于冰盤內(nèi)無菌的玻璃平皿上解剖，用滅菌的鑷子取出澳洲淡水龍蝦肝胰腺，用濾紙吸干表面水分后稱重，迅速放入預(yù)冷的1.5 mL離心管中，加入9倍體積預(yù)冷的生理鹽水(0.86% NaCl)，利用手持均質(zhì)器S-18KS 電動(dòng)組織勻漿器(北京晨曦勇創(chuàng)科技有限公司)對(duì)在冰浴中的樣品進(jìn)行勻漿(工作時(shí)間為10 s/次，間歇30 s，連續(xù)3～5次)，然后用臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó) Hettich UNIVERSAL 320R)10 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液作為待測(cè)肝胰腺懸液。每尾蝦的肝胰腺懸液作為一個(gè)單獨(dú)樣本進(jìn)行酶活力測(cè)定。消化酶指標(biāo)包括胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，免疫相關(guān)指標(biāo)包括超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)、總抗氧化能力(T-AOC)，上述指標(biāo)均采用南京建成檢測(cè)試劑盒測(cè)定。

1.4.2 離體消化率

肝胰臟取出后稱重(方法同1.4.1酶活力)，迅速加入肝胰臟質(zhì)量10倍體積(W/V)、預(yù)冷好的0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液(溫度4 ℃，pH值7.4)，用手持均質(zhì)器S-18KS 電動(dòng)組織勻漿器在冰浴中進(jìn)行勻漿，并以5 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液作為粗酶液。準(zhǔn)確稱取過80目篩的飼料樣品各0.200 0 g，放入50 mL高溫滅菌好的離心管中，加入0.2 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液15 mL，分別加入不同處理組的消化酶液5 mL。在28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在50 r/min搖床中振搖酶解，酶解時(shí)間為12 h。在4 000 r/min離心20 min，取上清液，用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒測(cè)定氨基酸含量。在離心管剩余殘?jiān)屑尤?5 mL蒸餾水，4 000 r/min離心去除上清液，重復(fù)洗滌2～3次。105 ℃烘干殘?jiān)梁阒兀Q重。參照劉襄河等[34]的實(shí)驗(yàn)方法，用凱氏定氮法測(cè)定飼料原料及其消化后相應(yīng)殘?jiān)牡鞍踪|(zhì)含量，并測(cè)定各組殘?jiān)晌镔|(zhì)含量。飼料的干物質(zhì)、蛋白消化率和總氨基酸轉(zhuǎn)化效率按式(1)～式(3)計(jì)算。

干物質(zhì)消化率(%)=(飼料樣品重量-殘?jiān)鼧悠分亓?/飼料樣品重量×100

(1)

蛋白質(zhì)消化率(%)=(飼料樣品重量×樣品粗蛋白含量-殘?jiān)鼧悠分亓俊翚堅(jiān)值鞍缀?/(飼料樣品重量×樣品粗蛋白含量)×100

(2)

總氨基酸轉(zhuǎn)化效率(%)=生成的氨基酸總量/飼料樣品重量×100

(3)

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 18.0軟件進(jìn)行計(jì)算處理。各處理組間顯著性分析采用單因素方差分析(One-way ANOVA) ，再進(jìn)行 Duncan 多重比較分析，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑對(duì)澳洲淡水龍蝦肝胰腺消化酶活力的影響

由表1可知，4種非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑對(duì)澳洲淡水龍蝦肝胰腺胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力的影響均不相同。與S-CK組相比，S-Ⅰ組胰蛋白酶活力降低但差異不顯著(P>0.05)，而S-Ⅱ組、S-Ⅲ組和S-Ⅳ組胰蛋白酶活力顯著提高(P<0.05)；S-Ⅳ組胰蛋白酶活力均值最高，為(7 514.87±663.40)U/mgprot，顯著高于S-CK組227.7%(P<0.05)。在對(duì)澳洲淡水龍蝦的脂肪酶影響中，與S-CK組相比，S-Ⅰ組和S-Ⅱ組的活力均無差異顯著(P>0.05)，但S-Ⅲ組和S-Ⅳ組脂肪酶活力差異顯著(P<0.05)，且S-Ⅲ組活力均值最高，為(17.60± 0.59)U/g，顯著高于S-CK組9.8%(P<0.05)。在對(duì)澳洲淡水龍蝦的淀粉酶活力影響中，S-Ⅰ組和S-Ⅱ組的活力顯著高于S-CK組(P<0.05)；S-Ⅱ組活力均值最高，為(0.159±0.007 2)U/mgprot，顯著高于S-CK組368.7%(P<0.05)。S-Ⅲ組和S-Ⅳ組的淀粉酶活力也分別顯著高于S-CK組270.7%、241.3%(P<0.05)。說明這4種非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑均可提高澳洲淡水龍蝦肝胰腺消化酶的活力。

表1 四種非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑對(duì)澳洲淡水龍蝦肝胰腺消化酶活力的影響Tab.1 Effects of four non-nutritive supplemental diets on activities of digestive enzyme in hepatopancreas of C.quadricarinatus

2.2 非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑對(duì)澳洲淡水龍蝦免疫功能的影響

表2為各試驗(yàn)組對(duì)澳洲淡水龍蝦免疫功能的影響結(jié)果。從表2可知，與S-CK組相比，S-Ⅱ組澳洲淡水龍蝦的ACP活力顯著降低(P<0.05)，但與其他處理組均差異不顯著(P>0.05)。在4種非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑對(duì)澳洲淡水龍蝦AKP的影響中，所有實(shí)驗(yàn)組AKP的活力均差異不顯著(P>0.05)，這可能與處理組養(yǎng)殖時(shí)間較短有關(guān)。在對(duì)澳洲淡水龍蝦SOD影響中，4種非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑處理組的SOD活力依次顯著高于S-CK組1.53%、1.22%、22.79%和38.45%(P>0.05)。在對(duì)澳洲淡水龍蝦T-AOC影響中，與S-CK組相比，S-Ⅰ組的T-AOC雖有提高但差異不顯著(P>0.05)，但S-Ⅱ組、S-Ⅲ組和S-Ⅳ組分別顯著提高了94.21%、95.99%和127.09%(P<0.05)。其中S-Ⅳ組的SOD活力和T-AOC均值最高，分別為(3.593±0.076)、(7.116±0.588)U/mgprot。從表2分析可知，以各試驗(yàn)組澳洲淡水龍蝦的T-AOC排序?yàn)椋篠-Ⅳ組>S-Ⅲ組>S-Ⅰ組>S-Ⅱ組>S-CK組。

表2 四種非營(yíng)養(yǎng)性添加飼料對(duì)澳洲淡水龍蝦免疫相關(guān)酶活力的影響

2.3 澳洲淡水龍蝦對(duì)非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑的離體消化率的影響

澳洲淡水龍蝦肝胰腺提取的粗酶液對(duì)非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑的離體消化率見表3。與S-CK組相比，各處理組的干物質(zhì)消化率、蛋白質(zhì)離體消化率和總氨基酸轉(zhuǎn)化效率都有明顯的提高。其中S-Ⅰ組和S-Ⅱ組的干物質(zhì)消化率分別比S-CK組提高5.5%和3.6%，但差異不顯著(P>0.05)；S-Ⅲ組和S-Ⅳ組分別比S-CK組顯著提高11.6%和14.3%(P<0.05)。S-Ⅰ組和S-Ⅲ組的蛋白質(zhì)離體消化率分別較S-CK組提高7.8%和21.6%，但差異不顯著(P>0.05)；而S-Ⅱ組和S-Ⅳ組與S-CK組相比，分別顯著提高26.9%和32.9%(P<0.05)。與S-CK組比，S-Ⅰ組總氨基酸轉(zhuǎn)化效率提高了6.5%，但差異不顯著(P>0.05)；而S-Ⅱ組、S-Ⅲ組和S-Ⅳ組的總氨基酸轉(zhuǎn)化效率分別顯著提高了8.2%、46.8%和64.2%(P<0.05)。S-Ⅳ組的干物質(zhì)消化率、蛋白質(zhì)離體消化率和總氨基酸轉(zhuǎn)化效率均最高。

表3 澳洲淡水龍蝦肝胰腺對(duì)四種非營(yíng)養(yǎng)性添加飼料的離體消化率

3 討論

3.1 非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑對(duì)澳洲淡水龍蝦消化酶活力的影響

肝胰臟在蝦類器官中發(fā)揮重要的消化酶分泌作用，其中消化酶活力的大小是衡量蝦類消化能力的重要指標(biāo)[35]。目前在水產(chǎn)動(dòng)物的研究方面，潘慶等[36]研究的結(jié)果顯示，在飼料中添加0.2%檸檬酸可以提高奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus×O.aureus)蛋白酶、胰蛋白酶和腸蛋白酶活力。檸檬酸的金屬離子配位性良好，可改善消化道的某些部位產(chǎn)生的酸性環(huán)境，從而提高對(duì)礦物質(zhì)鹽的溶解性和吸收率[37]。檸檬酸可提高虹鱒(Oncorhynchusmykiss)體內(nèi)灰分、磷和鐵的含量[38]。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.2%檸檬酸對(duì)澳洲淡水龍蝦的淀粉酶活性有顯著影響(P<0.05)。水產(chǎn)飼料添加復(fù)合酶，一方面可以補(bǔ)充水產(chǎn)動(dòng)物內(nèi)源性消化酶的不足，另一方面可以促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)飼料的消化利用。蔡永祥等[39]研究發(fā)現(xiàn)，外源性復(fù)合酶的添加可顯著提高日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)蛋白酶的活性(P<0.05)，而對(duì)淀粉酶活性影響較小。王國(guó)霞等[40]發(fā)現(xiàn)在南美白對(duì)蝦中添加不同的單酶，對(duì)其蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶均無顯著性影響(P>0.05)。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，添加0.2%復(fù)合酶可以顯著提高澳洲淡水龍蝦的胰蛋白酶和淀粉酶活性(P<0.05)，但對(duì)其脂肪酶活性影響不顯著(P>0.05)。上述研究結(jié)果存在一定的差異，這可能與選取蝦的品種、試驗(yàn)條件以及養(yǎng)殖方式有關(guān)。芽孢桿菌能促進(jìn)水生動(dòng)物生長(zhǎng)，與其可促進(jìn)消化、提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率有關(guān)。丁賢等[41]在飼料中添加芽抱桿菌制劑養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的蛋白酶活性明顯高于對(duì)照組，且消化酶活性和成活率均明顯提高。芽孢桿菌還可以顯著提高印度明對(duì)蝦(Fenneropenaeusindicus)幼蝦的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性(P<0.05)[42]。利用添加枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的飼料飼養(yǎng)尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)7 d可改善其腸道微生物群分布，并提高淀粉酶活性[43]。廖竹等[44]研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加植物乳桿菌加枯草芽孢桿菌混合菌的仔豬生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)和抗氧化能力比添加單一菌的效果好。本試驗(yàn)研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相同，飼料中添加植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌、養(yǎng)殖14 d可以顯著提高澳洲淡水龍蝦肝胰腺的胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性(P<0.05)。管振國(guó)[45]研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加根瘤菌，可改善凡納濱對(duì)蝦腸道的健康狀況，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，而且其肝胰腺中脂肪酶的活性也顯著提高(P<0.05)，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)證實(shí)，飼料中添加根瘤菌和枯草芽孢桿菌有利于顯著提高澳洲淡水龍蝦肝胰腺的蛋白酶和淀粉酶活性(P<0.05)。

3.2 非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑對(duì)澳洲淡水龍蝦免疫功能的影響

本試驗(yàn)研究了飼料中添加4種非營(yíng)養(yǎng)性物質(zhì)對(duì)澳洲淡水龍蝦肝胰腺中ACP、AKP、SOD活性和T-AOC的影響。這幾種酶在甲殼動(dòng)物非特異性免疫中發(fā)揮著重要作用，其中ACP和AKP負(fù)責(zé)水解水生動(dòng)物中的有機(jī)磷。ACP參與調(diào)控磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝，提高物質(zhì)的攝入和轉(zhuǎn)運(yùn)；與其他酶類形成吞噬細(xì)胞，破壞并清除侵入體內(nèi)的異物[46]。AKP與甲殼動(dòng)物對(duì)鈣、磷的吸收及甲殼素的生成和分泌直接關(guān)聯(lián)，并與其他水解酶類形成重要的解毒體系，在非特異免疫中發(fā)揮著重要作用[47]。SOD是機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶，可以清除超氧自由基、防止生物分子損傷，對(duì)組織的氧化脅迫起到重要防御和保護(hù)作用[48]。T-AOC反映機(jī)體總體抗氧化活力的重要指標(biāo)，可以更全面地體現(xiàn)機(jī)體的抗氧化防御水平[21]。程卓等[16]研究顯示，在飼料里添加檸檬酸對(duì)草魚(Ctenopharyngodonidella)血清AKP活性無顯著影響(P>0.05)。蔡永祥等[39]研究發(fā)現(xiàn)，日本沼蝦血清中ACP和AKP活性以飼料中添加復(fù)合酶的最高，顯著高于其他組(P<0.05)。這與本試驗(yàn)研究結(jié)果不一致，本研究試驗(yàn)結(jié)果顯示，4種非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑養(yǎng)殖澳洲淡水龍蝦14 d后，其肝胰腺的ACP和AKP活性影響差異不顯著(P>0.05)。原因一方面是這4種非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑進(jìn)入蝦腸道后，會(huì)調(diào)節(jié)機(jī)體腸道酸堿度和微生物菌群結(jié)構(gòu)，爭(zhēng)奪黏附位點(diǎn)，可能會(huì)干擾到澳洲淡水龍蝦體內(nèi)原有的益生菌的作用模式[41]。另一方面，14 d的養(yǎng)殖可能不足以引起澳洲淡水龍蝦ACP和AKP活性的積極生理變化。王守全[49]研究顯示，在試驗(yàn)第 45 d，枯草芽孢桿菌組的凡納濱對(duì)蝦的SOD活性顯著高于基礎(chǔ)飼料組(P<0.05)。管振國(guó)等[28]研究發(fā)現(xiàn)，飼料添加根瘤菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清和肝胰腺中 SOD和AKP 的活力較對(duì)照組均有所提高。李軍亮等[50]在低魚粉飼料中添加枯草芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦血清的SOD和AKP均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。鄭玉等[24]試驗(yàn)表明融合乳桿菌和植物乳桿菌也可提高凡納濱對(duì)蝦血清T-AOC及ACP、AKP活性。本試驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，不同處理組的SOD活性與T-AOC均比對(duì)照組高；其中飼料添加根瘤菌加枯草芽孢桿菌處理組的SOD活力與T-AOC均值最高，且SOD活性顯著高于添加植物乳桿菌加枯草芽孢桿菌處理組，T-AOC在兩個(gè)處理組之間差異不顯著(P>0.05)。說明飼料添加益生菌可提高澳洲淡水龍蝦的抗氧化酶活性，其中添加根瘤菌加枯草芽孢桿菌效果最佳。

3.3 澳洲淡水龍蝦對(duì)非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑的離體消化率的影響

離體消化法是通過在體外利用酶制劑或研究對(duì)象消化器官的酶提取液在試管內(nèi)模擬試驗(yàn)動(dòng)物的消化過程，對(duì)原料進(jìn)行水解消化，其測(cè)定值近似反映對(duì)原料的消化率。程卓等[16]發(fā)現(xiàn)飼料中添加0.3%檸檬酸能提高草魚的生長(zhǎng)性能和飼料利用率。竇勇等[51]研究發(fā)現(xiàn)，膨化飼料添加復(fù)合酶制劑可有效提高黃顙魚(Tachysurusfulvidraco)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率，并提高黃顙魚生長(zhǎng)性能。於葉兵等[52]在斑節(jié)對(duì)蝦飼料中添加芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)添加量3.0 g/kg可以顯著地提高干物質(zhì)、氨基酸和粗蛋白表觀消化率。在賴凱昭[53]研究中，飼料里添加適量的含有芽孢桿菌和乳酸菌等復(fù)合益生菌能顯著提高羅非魚對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)的消化吸收率。本研究試驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，4種非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑均可改善澳洲淡水龍蝦的離體消化率。另外本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，飼料中添加0.2%檸檬酸或0.2%復(fù)合酶均可以提高澳洲淡水龍蝦的干物質(zhì)消化率和總氨基酸轉(zhuǎn)化效率，但差異不顯著(P>0.05)。飼料中添加植物乳桿菌加枯草芽孢桿菌或根瘤菌加枯草芽孢桿菌可以顯著提澳洲淡水龍蝦的干物質(zhì)消化率、蛋白質(zhì)離體消化率和總氨基酸轉(zhuǎn)化效率，其中根瘤菌加枯草芽孢桿菌處理組均值最高，植物乳桿菌加枯草芽孢桿菌處理組次之。說明飼料中添加益生菌處理組的消化能力比添加檸檬酸或復(fù)合酶處理組的強(qiáng)。這4種非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑中最適合澳洲淡水龍蝦的是根瘤菌加枯草芽孢桿菌，其次是植物乳桿菌加枯草芽孢桿菌。

4 結(jié)論

利用4種非營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑養(yǎng)殖澳洲淡水龍蝦14 d后，其肝胰腺消化酶活力、免疫功能及離體消化率呈現(xiàn)不同程度的差異性。添加植物乳桿菌加枯草芽孢桿菌、根瘤菌加枯草芽孢桿菌處理組的消化酶活力、免疫功能及離體消化率的影響比添加檸檬酸或復(fù)合酶的高，并且添加根瘤菌加枯草芽孢桿菌的離體消化率比添加植物乳桿菌加枯草芽孢桿菌的高，因此在選擇非營(yíng)養(yǎng)性添加劑時(shí)，優(yōu)先選擇根瘤菌加枯草芽孢桿菌。