李文紅，郭 濤，向立剛，余知和，李添群

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550081；2.長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；3.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025；4.修文縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 修文 550299）

小菜蛾（Plutella xylostella）隸屬于鱗翅目菜蛾科，是一種世界性遷飛害蟲，主要危害油菜、白菜和蘿卜等十字花科作物，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的威脅[1]?；瘜W(xué)防治因見效快、效果好，一直是小菜蛾防治的主要措施。然而，化學(xué)藥劑的大量使用使得小菜蛾已對(duì)阿維菌素、高效氯氰菊酯、氯蟲苯甲酰胺等95 種藥劑產(chǎn)生了抗藥性[2-3]。作為農(nóng)業(yè)上的重要害蟲，小菜蛾一直是國(guó)內(nèi)外的重點(diǎn)研究對(duì)象，其種群飼養(yǎng)是研究的基礎(chǔ)。當(dāng)前，主要利用蘿卜苗、甘藍(lán)葉、人工飼料及半合成人工飼料飼養(yǎng)小菜蛾[4]。飼養(yǎng)過(guò)程中，小菜蛾也會(huì)受諸多病原菌侵染，因而在人工飼料中添加抗生素是飼料保鮮和減少病害侵染的主要措施。昆蟲腸道作為外界環(huán)境與宿主進(jìn)行物質(zhì)交換的重要場(chǎng)所，棲息著數(shù)量龐大的微生物群落。這些腸道微生物與宿主互惠共生、相互依賴，在宿主生長(zhǎng)繁殖、營(yíng)養(yǎng)吸收、病害防御、代謝解毒以及抗藥性產(chǎn)生等方面發(fā)揮著重要作用[5-7]。腸道微生物的穩(wěn)定是昆蟲進(jìn)行正常生命活動(dòng)的重要前提之一，腸道菌群一旦被打亂便可能導(dǎo)致其宿主的適合度降低[8]。例如，小菜蛾幼蟲在四環(huán)素等5種抗生素的作用下其生長(zhǎng)發(fā)育均受到抑制，預(yù)蛹的致畸率、死亡率均增加[9]；在利福平的作用下，白蟻腸道微生物多樣性降低，進(jìn)而影響白蟻產(chǎn)卵量、體質(zhì)量和壽命[10]；抗生素治療對(duì)腸道細(xì)菌的破壞可能會(huì)增加蜜蜂感染微孢子蟲的可能性[11]；土霉素作用可減少大蠟螟腸道微生物組中四環(huán)素抗性基因的多樣性[12]。由此可見，抗生素的科學(xué)、正確使用對(duì)昆蟲的飼養(yǎng)與防治都十分重要。然而，人工飼料中添加抗生素是否會(huì)對(duì)小菜蛾腸道微生物菌群產(chǎn)生影響，目前尚缺乏了解。為此，將常見的3種抗生素（氨芐青霉素、硫酸鏈霉素和利福平）浸泡甘藍(lán)葉后飼喂小菜蛾，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其腸道真菌、細(xì)菌群落組成及結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，以期更好地闡明抗生素對(duì)小菜蛾腸道微生物的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

供試小菜蛾為貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所昆蟲研究室飼養(yǎng)的未接觸藥劑的單一敏感品系。甘藍(lán)采自貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院田間試驗(yàn)地，種植期間未使用任何藥劑。

氨芐青霉素（96%，# A6920）、硫酸鏈霉素（85%，#S8290）、利福平（95%，#R8011）均采購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。氨芐青霉素和硫酸鏈霉素先用無(wú)菌蒸餾水配制成2 000 mg∕L 的母液，然后再用無(wú)菌水分別稀釋至相應(yīng)濃度。氨芐青霉素質(zhì)量濃度為5 mg∕L、10 mg∕L，硫酸鏈霉素質(zhì)量濃度為100 mg∕L、200 mg∕L。利福平先用甲醇配制成6 000 mg∕L 母液，然后再用無(wú)菌水分別稀釋至3 mg∕L 和6 mg∕L。

1.2 方法

1.2.1 抗生素劑量設(shè)置 前期研究發(fā)現(xiàn)，蒙氏腸球菌為小菜蛾腸道優(yōu)勢(shì)細(xì)菌[13]，室內(nèi)平板試驗(yàn)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，0.5 mg∕L 氨芐青霉素、20 mg∕L 硫酸鏈霉素、0.3 mg∕L 利福平即可完全抑制蒙氏腸球菌的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)采用浸葉法測(cè)定抗生素對(duì)小菜蛾腸道微生物的影響，設(shè)置3種抗生素的質(zhì)量濃度分別為：氨芐青霉素5 mg∕L（HP05）、10 mg∕L（HP100），硫酸鏈霉素100 mg∕L（HS100）、200 mg∕L（HS200），利福平3 mg∕L（HR03）、6 mg∕L（HR06）；以無(wú)菌水處理為對(duì)照。

1.2.2 小菜蛾幼蟲飼養(yǎng)及腸道樣品收集 將新鮮甘藍(lán)葉分別置于不同質(zhì)量濃度的抗生素中浸泡30 s，取出后晾干至表面無(wú)水痕，隨后分別放入飼養(yǎng)盒中，接入300頭發(fā)育狀況一致的二齡小菜蛾幼蟲，以飼喂無(wú)菌水浸泡的甘藍(lán)葉為對(duì)照（CK）。飼喂24 h 后，分別從對(duì)照組和6 個(gè)處理組中各挑取200頭生長(zhǎng)狀態(tài)一致的幼蟲進(jìn)行腸道組織的收集。先用75%乙醇浸泡蟲體30 s，隨后無(wú)菌蒸餾水漂洗3次，然后將幼蟲挑至無(wú)菌吸水紙上，待體表水分吸干后，解剖收集腸道樣品。

1.2.3 基因組DNA 提取、PCR 及擴(kuò)增子測(cè)序 采用基因組DNA 提取試劑盒（Omega Bio-Tek，D5625-01）提取小菜蛾幼蟲腸道微生物總DNA，使用超微量分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientifc，NanoDrop 2000）檢測(cè)其質(zhì)量與濃度。以抽提的DNA 為模板，分別采用通用引物515F∕806R 擴(kuò)增腸道細(xì)菌群落16S rRNA 基因V4 區(qū)，ITS1∕ITS2 擴(kuò)增真菌群落轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1 區(qū)。PCR 反應(yīng)體系及條件參考前人的方法[14-15]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)、純化后送至北京諾禾致源科技股份有限公司，基于PacBio sequel Ⅱ平臺(tái)進(jìn)行3代擴(kuò)增子測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用FLASH（Version 1.2.7）軟件對(duì)雙端序列合并剪接，通過(guò)QIIME（Version 1.9.1）軟件設(shè)定條件進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾控制以獲得高質(zhì)量序列，采用UCHIME算法檢測(cè)并去除嵌合體序列，最終得到有效數(shù)據(jù)。使用UPARSE（Version 7.0.1001）軟件，根據(jù)相似度≥97%對(duì)序列進(jìn)行OTU 聚類，篩選每個(gè)OTU 的代表性序列以進(jìn)行下一步注釋。對(duì)于每個(gè)具有代表性的序列，基于Mothur算法并采用UNITE和Silva數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)分類信息進(jìn)行注釋。利用R 語(yǔ)言工具繪制物種Venn分析圖、群落柱狀圖等。

樣品微生物群落Alpha 多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson、Chao1、Observed OTUs、Pielou 和Goods coverage）使用QIIME（Version 1.7.0）計(jì)算，使用Qiime feature-table rarefy 按最小樣本序列數(shù)進(jìn)行樣本序列抽平標(biāo)準(zhǔn)化處理，并用R 軟件（Version 2.15.3）顯示。主成分分析（PCA）使用R 軟件中的factoiner 軟件包和ggplot2軟件包來(lái)減小原始變量的尺寸，并由R 軟件中的WGCNA 包、stat 包和ggplot2包顯示。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序深度分析

稀釋性曲線是用于驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)量是否足以反映樣品中物種多樣性及豐富程度的重要指標(biāo)之一[16]。由圖1可見，7組樣品中真菌群落可觀察到的OTU 數(shù)在測(cè)序數(shù)據(jù)量為10 000 條時(shí)達(dá)到平臺(tái)期，細(xì)菌群落在測(cè)序數(shù)據(jù)量為25 000 條時(shí)達(dá)到平臺(tái)期，說(shuō)明此次測(cè)序數(shù)據(jù)深度已經(jīng)足夠，能夠反映樣品中大多數(shù)的真菌、細(xì)菌多樣性信息，進(jìn)一步測(cè)序?qū)π翺TU的產(chǎn)生貢獻(xiàn)不大。

圖1 物種稀釋性曲線Fig.1 Species dilution curves

2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)控

測(cè)序原始數(shù)據(jù)拼接、質(zhì)控后的信息如表1所示，每組樣品中真菌群落高質(zhì)量序列數(shù)在37 700～80 531 條，堿基數(shù)在9 693 967～19 194 865 nt，序列平均長(zhǎng)度211～257 bp，平均GC 含量為46.22%～52.25%，測(cè)序錯(cuò)誤率小于0.01（Q20）和0.001（Q30）的堿基數(shù)分別占總堿基數(shù)的92.72%～99.20%和86.90%～97.02%，有效序列百分比在46.56%～94.82%。其中對(duì)照組中有效序列百分比和測(cè)序錯(cuò)誤率明顯低于處理組，但序列平均長(zhǎng)度明顯高于處理組。每組樣品中細(xì)菌群落高質(zhì)量序列數(shù)在70 049～76 254 條，堿基數(shù)在26 811 923～32 570 182 nt，序列平均長(zhǎng)度為383～428 bp，平均GC 含量為46.87%～55.15%，測(cè)序錯(cuò)誤率小于0.01 和0.001 的堿基數(shù)分別占總堿基數(shù)的96.99%～97.78% 和90.98%～92.76%，有效序列百分比在80.84%～91.68%。所有樣本測(cè)序原始序列均已上傳至NCBI SRA 數(shù)據(jù)庫(kù)（登錄號(hào)：PRJNA898667）。

表1 各樣本序列數(shù)據(jù)質(zhì)控信息Tab.1 Quality control information of each sample sequences data

2.3 小菜蛾腸道真菌與細(xì)菌群落組成

子 囊 菌 門（Ascomycota）、擔(dān) 子 菌 門（Basidiomycota）和毛霉門（Mucoromycota）為小菜蛾腸道的優(yōu)勢(shì)真菌門（圖2A）。對(duì)照組小菜蛾腸道中子囊菌門相對(duì)豐度為45.3%，經(jīng)3 種抗生素處理后相對(duì)豐度均不同程度地增加，其中10 mg∕L 氨芐青霉素處理的小菜蛾腸道中子囊菌門相對(duì)豐度增加至88.7%，增幅最大；6 mg∕L 利福平處理的小菜蛾腸道子囊菌門相對(duì)豐度為49.1%，增幅最小。小菜蛾腸道中擔(dān)子菌門相對(duì)豐度為14.6%（CK），在10 mg∕L氨芐青霉素、100 mg∕L 硫酸鏈霉素作用下分別降低至6.8%、8.0%，而在5 mg∕L 氨芐青霉素、200 mg∕L 硫酸鏈霉素、3 mg∕L 和6 mg∕L 利福平作用下相對(duì)豐度增加。毛霉門在對(duì)照組中的相對(duì)豐度為2.6%，經(jīng)5 mg∕L 氨芐青霉素和100 mg∕L 硫酸鏈霉素作用后相對(duì)豐度分別增加至5.8%和26.1%，而在其他處理中的相對(duì)豐度降低。

圖2 小菜蛾腸道真菌和細(xì)菌門水平群落物種組成Fig.2 Gut fungal and bacterial communities composition of P.xylostella at phylum level

厚 壁 菌 門（Firmicutes）、變 形 菌 門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidota）為小菜蛾腸道的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門（圖2B）。對(duì)照組中厚壁菌門相對(duì)豐度為80.6%，經(jīng)3 種抗生素處理后均不同程度地降低，其中100 mg∕L、200 mg∕L 硫酸鏈霉素以及3 mg∕L 利福平作用效果較為顯著，其在3 組中相對(duì)豐度分別為34.35%、33.7%和26.4%。小菜蛾腸道中變形菌門（CK 17.5%）除經(jīng)100 mg∕L 硫酸鏈霉素處理后（6.5%）降低外，在經(jīng)其他質(zhì)量濃度抗生素處理后相對(duì)豐度均增加，在10 mg∕L 氨芐青霉素、200 mg∕L 硫酸鏈霉素和3 mg∕L 利福平處理下增幅較顯著，相對(duì)豐度分別為46.1%、56.7%和72.3%。對(duì)照組中擬桿菌門相對(duì)豐度為1.1%，經(jīng)10 mg∕L 氨芐青霉素、100 mg∕L 和200 mg∕L 硫酸鏈霉素處理后其相對(duì)豐度分別增加至4.1%、12.0%和8.0%。

青霉屬（Penicillium）為小菜蛾腸道中的優(yōu)勢(shì)真菌屬，其在對(duì)照組中的相對(duì)豐度為37.5%，經(jīng)不同抗生素處理后相對(duì)豐度均有提升，在10 mg∕L 氨芐青霉素作用下相對(duì)豐度最高，為86.9%（圖3A）。線黑粉酵母屬（Filobasidium）在對(duì)照組中相對(duì)豐度為5.6%，經(jīng)10 mg∕L 氨芐青霉素和100 mg∕L 硫酸鏈霉素處理后相對(duì)豐度分別降低至4.9%和1.0%，而在其他濃度抗生素作用下相對(duì)豐度均升高，在200 mg∕L硫酸鏈霉素和6 mg∕L 利福平處理中相對(duì)豐度均大于35%。毛霉屬（Mucor）在對(duì)照組中相對(duì)豐度為2.6%，經(jīng)5 mg∕L 氨芐青霉素和100 mg∕L 硫酸鏈霉素處理后其相對(duì)豐度分別增加至5.5%和26.1%，在其余處理組中的相對(duì)豐度均降低，10 mg∕L 氨芐青霉素處理組降幅最多，僅為0.2%。枝孢屬（Cladosporium）在對(duì)照組中的相對(duì)豐度為1.3%，除在3 mg∕L 利福平處理下相對(duì)豐度（0.6%）降低外，在其余處理組中相對(duì)豐度均升高，100 mg∕L 硫酸鏈霉素、6 mg∕L 利福平處理下相對(duì)豐度增幅最明顯，分別為6.6%、7.1%。漢納酵母屬（Hannaella）在100 mg∕L 硫酸鏈霉素（5.9%）、200 mg∕L 硫酸鏈霉素（2.8%）和6 mg∕L 利福平（2.5%）處理組中的相對(duì)豐度均高于對(duì)照組（2.2%）。

圖3 小菜蛾腸道真菌和細(xì)菌屬水平群落物種組成Fig.3 Gut fungal and bacterial communities composition of P.xylostella at genus level

腸球菌屬（Enterococcus）和腸桿菌屬（Enterobacter）為小菜蛾腸道中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，在對(duì)照組中的相對(duì)豐度分別為79.3%和11.8%（圖3B）。經(jīng)抗生素處理后，腸球菌屬相對(duì)豐度均降低，其在氨芐青霉素5 mg∕L、10 mg∕L，硫酸鏈霉素100 mg∕L、200 mg∕L，利福平3 mg∕L、6 mg∕L 處理組中的相對(duì)豐度分別為68.8%、40.4%，26.4%、30.6%，24.7%、59.6%。腸桿菌屬除在100 mg∕L 硫酸鏈霉素作用下相對(duì)豐度（0.5%）降低外，在5 mg∕L 氨芐青霉素（16.8%）、10 mg∕L 氨芐青霉素（36.9%）、200 mg∕L 硫酸鏈霉素（36.9%）、3 mg∕L 利福平（53.0%）和6 mg∕L利福平（22.4%）處理組中的相對(duì)豐度均增加，其中以3 mg∕L 利福平處理組增幅最顯著。假單胞菌屬（Pseudomonas）在10 mg∕L 氨芐青霉素和100 mg∕L 硫酸鏈霉素作用后相對(duì)豐度由對(duì)照組的0.06%分別增加至5.0%和4.9%。沙雷氏菌屬（Serratia）在對(duì)照組中的相對(duì)豐度僅為0.3%，經(jīng)200 mg∕L 硫酸鏈霉素處理后相對(duì)豐度增加至4.1%。除上述菌屬外，其余菌屬在處理組與對(duì)照組中的相對(duì)豐度變化不顯著。

花瓣圖結(jié)果（圖4）表明，對(duì)照組與抗生素處理組中共有的真菌和細(xì)菌OTU 數(shù)目均為14。其中共有的14 個(gè)真菌OTU 分別屬于星盤青霉（Penicilliumastrolabium）、Filobasidium、毛霉屬、未分類真菌、極細(xì)枝孢霉（Cladosporium tenuissimum）、Hannaella oryzae、擲孢酵母屬（Sporobolomyces）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、Naganishia、巴氏紅酵母（Rhodotorula babjevae）、Papiliotrema flavescens、P.polonicum、布勒擔(dān)孢酵母屬（Bulleromyces）和Holtermanniella takashimae。共有的14 個(gè)細(xì)菌擴(kuò)增子分別屬于沙雷氏菌屬（2個(gè)）、未分類細(xì)菌（2 個(gè)）、腸桿菌屬（2 個(gè)）、腸球菌屬、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、假單胞菌屬、亨蓋特梭菌科（Hungateiclostridiaceae）（2個(gè)）、Anaerovoracaceae、透明顫菌屬（Vitreoscilla）和Lutispora。

圖4 樣本獨(dú)有、共有物種組成Fig.4 Sample unique，shared species composition

2.4 小菜蛾腸道微生物群落Alpha多樣性

Alpha 多樣性指數(shù)中，Chao1 指數(shù)用于表示樣品微生物群落豐富度；Goods coverage 指數(shù)用于表示樣品測(cè)序的深度；Observed OTUs 表示樣本中實(shí)際觀察到的物種數(shù)；Pielou 指數(shù)用于表示微生物群落均勻度；Shannon、Simpson指數(shù)用于表示樣品微生物群落多樣性。Alpha 多樣性指數(shù)分析結(jié)果表明，各組的樣品覆蓋度（Goods coverage）指數(shù)均達(dá)到1，表明測(cè)序深度足夠、結(jié)果合理。

小菜蛾腸道真菌群落中，各處理組的群落豐富度、均勻度和多樣性較對(duì)照組均有不同程度降低，其下降程度由大到小依次為10 mg∕L 氨芐青霉素處理組、100 mg∕L硫酸鏈霉素處理組、200 mg∕L硫酸鏈霉素處理組、6 mg∕L利福平處理組、3 mg∕L利福平處理組和5 mg∕L 氨芐青霉素處理組（表2）。未經(jīng)抗生素處理組中小菜蛾腸道真菌群落Shannon、Simpson指數(shù)分別為3.52、0.81，Chao1 指數(shù)、Observed OTUs均為135，Pielou 指數(shù)為0.50；10 mg∕L 氨芐青霉素處理組中各多樣性指數(shù)下降最顯著，Shannon、Simpson指數(shù)分別為1.11、0.28，Chao1 指數(shù)、Observed OTUs均為38，Pielou指數(shù)為0.21。

表2 小菜蛾腸道微生物群落Alpha多樣性分析Tab.2 Alpha diversity analysis of the gut microbial community of P.xylostella

小菜蛾腸道細(xì)菌群落多樣性分析中，與對(duì)照組相比，氨芐青霉素和硫酸鏈霉素處理組的群落豐富度增加，而利福平處理組降低，3種抗生素處理組的群落均勻度與多樣性均增加，其中100 mg∕L 硫酸鏈霉素處理組增幅最大，其次是200 mg∕L 硫酸鏈霉素組、10 mg∕L 氨芐青霉素組、3 mg∕L 利福平組、6 mg∕L利福平組、5 mg∕L 氨芐青霉素組（表2）。對(duì)照組中小菜蛾腸道細(xì)菌群落Shannon、Simpson 指數(shù)分別為1.65、0.43，Chao1 指數(shù)、Observed OTUs 均為129，Pielou 指數(shù)為0.24；100 mg∕L 硫酸鏈霉素處理組的小菜蛾腸道細(xì)菌群落豐富度、均勻度與多樣性增幅最大，Chao1、Shannon、Simpson 和Pielou 指數(shù)分別為351、4.30、0.83和0.51。

2.5 小菜蛾腸道微生物群落主成分分析

PCA 分析是一種簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)集的分析技術(shù)，通過(guò)分解方差將樣品差異反映在二維坐標(biāo)圖上[17]。PCA分析表明，小菜蛾腸道真菌群落（圖5A）的第一主成分及第二主成分貢獻(xiàn)率為34.27%、18.98%，累積貢獻(xiàn)率為53.25%。10 mg∕L 氨芐青霉素、100 mg∕L 和200 mg∕L 硫酸鏈霉素、6 mg∕L 利福平4 個(gè)處理組樣品（HP10、HS100、HS200、HR06）距離較近，表明其真菌群落組成相似；而對(duì)照組（CK）和5 mg∕L氨芐青霉素（HP05）處理組、3 mg∕L 利福平（HR03）處理組3組樣品之間以及與其余4組樣品間距離較遠(yuǎn)，表明其真菌群落組成存在較大差異。

圖5 小菜蛾腸道微生物群落主成分分析Fig.5 Principal component analysis of the gut microbial community of P.xylostella

小菜蛾腸道細(xì)菌群落（圖5B）的第一主成分、第二主成分貢獻(xiàn)率分別為32.92%、21.18%，累積貢獻(xiàn)率為54.10%。對(duì)照組（CK）與5 mg∕L 氨芐青霉素、200 mg∕L 硫酸鏈霉素、3 mg∕L 利福平、6 mg∕L 利福平4 個(gè)處理組樣品（HP05、HS200、HR03、HR06）距離較近，表明其細(xì)菌群落組成相似；而10 mg∕L 氨芐青霉素處理組（HP10）樣品和100 mg∕L 硫酸鏈霉素處理組（HS100）樣品之間以及與其余5 個(gè)樣品間距離較遠(yuǎn)，表明其細(xì)菌群落組成差異較大。

3 結(jié)論與討論

腸道微生物群落組成復(fù)雜、功能多樣，穩(wěn)定健康的腸道菌群結(jié)構(gòu)可以提高宿主對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，保證正常的生命活動(dòng)，提高宿主的存活率[18-19]。本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)解析了小菜蛾腸道微生物響應(yīng)3 種抗生素脅迫的變化規(guī)律，從微觀層面揭示了抗生素對(duì)小菜蛾腸道微生物的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，3 種抗生素對(duì)小菜蛾腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)組成及豐度均存在影響，不同濃度、不同抗生素處理對(duì)腸道微生物的影響有所差別。小菜蛾腸道細(xì)菌主要分布于厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門，優(yōu)勢(shì)菌屬有腸球菌屬和腸桿菌屬，這與前人報(bào)道一致[13，20-21]；真菌主要分布于子囊菌門、擔(dān)子菌門和毛霉門，優(yōu)勢(shì)菌屬有青霉屬。3 種抗生素處理后小菜蛾腸道厚壁菌門、腸球菌屬相對(duì)豐度均降低，子囊菌門、青霉屬相對(duì)豐度均增加，變形菌門和腸桿菌屬在100 mg∕L 硫酸鏈霉素作用下相對(duì)豐度均降低，其余處理組相對(duì)豐度增加。腸道微生物直接或間接對(duì)宿主發(fā)揮著重要的作用，如參與消化、吸收利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、解毒、提高宿主免疫活性等[21]。青霉菌是一種重要的木質(zhì)纖維素降解菌，其存在于昆蟲腸道中可幫助宿主消化植物組織，為宿主的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[22-23]。腸桿菌可參與碳的代謝，能幫助宿主降解碳水化合物，有利于宿主對(duì)食物的消化，此外腸桿菌還具有固氮能力[24-26]。相關(guān)文獻(xiàn)表明，腸球菌可增加小菜蛾對(duì)毒死蜱的抗性[27]。毛霉屬、枝孢屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬雖不是小菜蛾腸道中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，但在對(duì)照和處理組中也占有一定比例。毛霉菌能產(chǎn)生高活力蛋白酶，廣泛存在于空氣、土壤等環(huán)境中[28]；枝孢菌屬?gòu)V泛存在于土壤、海洋及植物體內(nèi)，能合成與宿主相同或相似的化合物以及其他類型化合物[29]；假單胞桿菌參與為寄主提供能量的過(guò)程，與宿主免疫相關(guān)；沙雷氏菌可在小菜蛾的營(yíng)養(yǎng)獲取中起作用。

本研究中對(duì)照組小菜蛾腸道微生物中最優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為厚壁菌門（80.6%），其次為變形菌門（17.5%），這與前人報(bào)道的最優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門有所差異[21，30]，但與LI 等[13]研究結(jié)果一致。腸道微生物很大程度上來(lái)自食物及外界環(huán)境，因此，環(huán)境以及食物上攜帶的微生物顯著影響腸道菌群。LIANG等[31]發(fā)現(xiàn)，在飼喂萵苣葉的家蠶幼蟲中，萵苣葉飼喂的家蠶幼蟲腸道中含有大量的不動(dòng)桿菌和硫酸鹽還原菌，而在正常家蠶幼蟲腸道內(nèi)幾乎不存在這些細(xì)菌。吳曉露等[32]研究也發(fā)現(xiàn)，以人工飼料為食的小菜蛾品系腸道細(xì)菌主要由厚壁菌門組成，而轉(zhuǎn)寄主植物后，腸道的優(yōu)勢(shì)菌門是變形菌門或擬桿菌門。MIKAELYAN 等[33]研究表明，食物是高等白蟻（Nasutitermes takasagoensis）腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要決定因素。STRANO 等[34]對(duì)松異舟蛾（Thaumetopoea pityocampa）的研究也說(shuō)明，食物是影響其腸道微生物的重要因素，且變形菌門的豐度可能與食物相關(guān)聯(lián)。BRODERICK 等[35]對(duì)鱗翅目昆蟲舞毒蛾（Lymantria dispar）的研究結(jié)果顯示，取食同一種食物的舞毒蛾的腸道微生物組成高度相似，而取食不同食物（白楊、落葉松、白櫟或柳樹）的舞毒蛾，其腸道微生物組成存在很大差異。

經(jīng)3 種抗生素處理后，小菜蛾腸道真菌群落的群落豐富度、均勻度和多樣性較對(duì)照組均有不同程度降低。小菜蛾腸道細(xì)菌群落中，氨芐青霉素和硫酸鏈霉素處理組的群落豐富度較對(duì)照組升高，利福平處理組較對(duì)照組降低，而群落均勻度與多樣性表現(xiàn)為抗生素處理組均較對(duì)照組升高。結(jié)合PCA 分析的結(jié)果來(lái)看，各組間細(xì)菌群落對(duì)比各有差異，復(fù)雜程度高；而對(duì)照組與處理組的真菌群落樣本距離較遠(yuǎn)，物種組成差異較大。結(jié)合Alpha 多樣性指數(shù)的分析，推測(cè)腸道真菌群落受抗生素等因素影響的程度更大，相比腸道細(xì)菌，真菌的豐度和多樣性較低且組成不穩(wěn)定，這與SUHR 等[36]、周本翔等[37]的結(jié)論有共同之處。一般而言，抗生素主要靶標(biāo)為細(xì)菌而非真菌，本研究中經(jīng)抗生素處理后小菜蛾腸道真菌群落的受影響程度大于細(xì)菌群落的可能原因，一是腸道細(xì)菌群落基數(shù)高于真菌群落，因此細(xì)菌群落的抗脅迫能力強(qiáng)于真菌群落；二是不同的微生物菌群由于結(jié)構(gòu)和功能差異導(dǎo)致其對(duì)同一環(huán)境的適應(yīng)能力各異，真菌群落可能對(duì)抗生素處理后宿主生理狀態(tài)的改變更為敏感。

小菜蛾腸道微生物結(jié)構(gòu)和多樣性經(jīng)3種抗生素處理后均有顯著變化，這可能是由于抗生素處理導(dǎo)致小菜蛾腸道生理環(huán)境改變，優(yōu)勢(shì)、非優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量發(fā)生增減。腸道微生物的主要作用是協(xié)助宿主代謝、增強(qiáng)宿主的免疫能力和適應(yīng)性，促進(jìn)其機(jī)體健康。而作為共生關(guān)系的二者，宿主的生理狀態(tài)也會(huì)影響腸道微生物的改變。如CHEN 等[38]研究了同屬鱗翅目昆蟲的斜紋夜蛾（Spodoptera littoralis），發(fā)現(xiàn)其卵期微生物主要由泛菌屬、不動(dòng)桿菌屬和羅爾斯通菌屬組成，幼蟲期和蛹期優(yōu)勢(shì)菌屬為腸球菌屬，而羽化后成蟲期腸道微生物主要由腸球菌屬、泛菌屬和克雷伯氏桿菌屬組成；并且，早期幼蟲微生物組更富含與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和碳水化合物代謝有關(guān)的基因，而在晚期幼蟲中，與氨基酸、輔因子和維生素代謝相關(guān)的基因增加；微生物群落的種種差異反映了其在各生命階段不同的功能作用，突出了宿主發(fā)育過(guò)程中對(duì)其腸道微生物群的控制。唐旸[30]的研究也表明，小菜蛾腸道微生物在物種組成上總體相對(duì)穩(wěn)定，但物種豐度上卻存在動(dòng)態(tài)變化，其中卵、幼蟲期、蛹期和成蟲期均表現(xiàn)出明顯的與發(fā)育相關(guān)聯(lián)的種群特異性，并隨著小菜蛾的生長(zhǎng)發(fā)育，其腸道微生物多樣性會(huì)伴隨著變化以適應(yīng)相應(yīng)的生理改變和功能需要。

小菜蛾腸道內(nèi)有豐富的微生物群落，其組成復(fù)雜、功能多樣，對(duì)小菜蛾的適應(yīng)性有重要作用。本研究檢測(cè)了3種抗生素處理后小菜蛾腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，為小菜蛾腸道微生物功能研究提供了借鑒，同時(shí)也為氨芐青霉素、硫酸鏈霉素和利福平3 種抗生素與小菜蛾的互作研究提供了參考，對(duì)后續(xù)使用抗生素防控小菜蛾的實(shí)踐推廣提供了理論依據(jù)。