吳穎，魏敏，冀瑞晴，王建，羅彩霞，單燕麗

1 徐州醫(yī)科大學研究生院，江蘇徐州 221004；2 徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院婦科；3 新疆維吾爾自治區(qū)伊犁哈薩克自治州友誼醫(yī)院婦產(chǎn)科

宮頸癌（CC）的發(fā)病率和病死率居女性生殖惡性腫瘤的首位。宮頸癌的發(fā)病率逐年上升，呈年輕化趨勢［1］。目前，宮頸癌的主要治療方法有腫瘤切除術、放療和化療，對于中晚期宮頸癌患者中放療不耐受、不敏感以及宮頸癌復發(fā)患者的療效不佳［2-3］。尋找新的、更有效的宮頸癌治療方法是目前的研究熱點。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一類長度超過200 個核苷酸的轉錄本［4］。研究［5］發(fā)現(xiàn)，LnCRNAlinc00858 在肺癌、結直腸癌、骨肉瘤等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉移中發(fā)揮重要作用。微小RNA-3182（miR-3182）是一種miRNA，可抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展［6］。但linc00858 與miR-3182 在宮頸癌組織中的表達變化及其在宮頸癌細胞的侵襲和轉移過程中的相關研究較少。為此，2022 年1 月—2023 年1 月，我們觀察了linc00858 和miR-3182 在宮頸癌組織表達變化、對宮頸癌細胞株侵襲遷移的調控作用，分析宮頸癌細胞中l(wèi)inc00858、miR-3182 的靶向關系。現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 宮頸癌及癌旁組織linc00858、miR-3182 檢測 選取徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院2022 年1—6 月間收治的宮頸癌患者40 例，均接受宮頸癌根治術治療，術中保留宮頸癌及其相應癌旁組織（癌組織2cm 外組織）標本。納入標準：①經(jīng)病理學診斷為宮頸癌；②年齡45～60 歲；③臨床分期ⅠB1～ⅡA1期；④入院前未經(jīng)過放療、化療等治療；⑤患者臨床資料完整。排除標準：①合并其他腫瘤；②并非原發(fā)灶，由其他腫瘤轉移所致；③存在嚴重的肝腎功能損傷、心肺疾病史，不能耐受手術。該研究方案已獲得徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會的批準（XYFY2022-KL193-01）。宮頸癌及癌旁組織標本均在患者知情同意情況下獲取。采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測宮頸癌及癌旁組織linc00858、miR-3182 的表達。TRIzol 法提取宮頸癌及癌旁組織總RNA，逆轉錄成cDNA。PCR 擴增：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，70 ℃退火延伸30 s，共40 個循環(huán)。以18S 及U6 為內參，以2-ΔΔCt代表linc00858、miR-3182 相對表達量。linc00858 上游引物：5’- CCCAGCTCCTTACACACGTT-3’，下游引物：5’-TTCAGAGGCCTGCATCACTG-3’；miR-3182 上游引物：5’-CACTCAGCTGGCTTCTGTAGTG-3’，下游引物：5’- CTGGTGTCGTGGAGTCG-3’。重復檢測3次，取平均值。

1.2 linc00858、miR-3182 對人宮頸癌細胞株遷移侵襲的調控作用觀察

1.2.1 受試細胞篩選 人宮頸癌細胞株CaSki、Si-Ha、ME180、MS751 及人正常宮頸上皮細胞株Ect1/E6E7（ATCC 細胞庫），接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)。取對數(shù)生長期CaSki、SiHa、ME180、MS751 及Ect1/E6E7細胞，采用RT-qPCR 法檢測linc00858、miR-3182 的表達，所有操作均同“1.1”。CaSki、SiHa、ME180、MS751 及Ect1/E6E7 細胞linc00858 相對表達量分別為3.11 ± 0.45、4.45 ± 0.44、6.22 ± 0.67、6.67 ± 0.78、1.00 ± 0.00，miR-3182 相對表達量分別為0.58 ± 0.08、0.60 ± 0.07、0.48 ± 0.04、0.69 ±0.07、1.00 ± 0.00。與Ect1/E6E7 細胞比較，4 種宮頸癌細胞linc00858相對表達量高，miR-3182相對表達量低（P均＜0.01）。選擇linc00858 表達量最高的MS751進行后續(xù)研究。

1.2.2 MS751 細 胞 分 組 及 si-linc00858 、OE-linc00858 轉染方法 培養(yǎng)48 h 時取對數(shù)生長期MS751 細胞，分為4 個組（1、2、3、4 組），每組6 個復孔。 1～4 組分別轉染si-linc00858（小干擾linc00858，沉默linc00858 表達）、OE-linc00858（過表達linc00858）、si-NC（小干擾陰性對照）、OE-NC（過表達陰性對照），所有操作均嚴格按照Lipofectamine 2000 轉染試劑說明書進行，培養(yǎng)8h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 各組細胞侵襲、遷移情況觀察 轉染48 h時取各組細胞，采用Transwell 實驗觀察各組細胞侵襲、遷移情況。所有操作嚴格按照使用說明書進行，于倒置顯微鏡下隨機取3 個視野拍照（×200），計算各組侵襲細胞數(shù)、遷移細胞數(shù)。實驗重復檢測3次，取平均值。

1.2.4 各組細胞linc00858、miR-3182 檢測 培養(yǎng)48 h 時取轉染后各組細胞，采用RT-qPCR 法檢測各組細胞linc00858、miR-3182 的表達。所有操作同“1.1”。重復測算3次，取平均值。

1.3 MS751細胞中l(wèi)inc00858與miR-3182的靶向關系分析 分別采用RNA 免疫沉淀測定（RIP）實驗、雙熒光素酶報告實驗分析MS751 細胞中l(wèi)inc00858與miR-3182 的靶向關系。①RIP 實驗：取對數(shù)生長期MS751 細胞分為兩組，根據(jù)Magna RIPTM RNA 結合蛋白免疫沉淀試劑盒的說明，分別加入抗AGO2抗體和IgG 抗體（陰性對照），在RIP 緩沖液中加入linc00858與miR-3182抗體結合磁珠，處理細胞裂解物，提取沉淀RNA，采用RT-qPCR 方法檢測linc00858 與miR-3182。重復檢測3 次，取平均值。沉淀RNA 相對表達量具有統(tǒng)計學差異說明linc00858 與miR-3182 間存在靶向關系。②雙熒光素酶報告實驗：構建含有結合位點的野生型載體WT-linc00858 與含有突變位點的突變型載體MUTlinc00858。將MS751 細胞分為一、二、三、四組，分別轉染W(wǎng)T-linc00858 + NC-miR、WT-linc00858+miR-3182 mimics （miR-3182 模 擬 物 ） 、MUT-linc00858+NC-miR 、MUT-linc00858 + miR-3182 mimics，轉染24 h時檢測各組相對熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計量資料以±s描述，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，采用Spearman 相關性分析分析宮頸癌組織中l(wèi)inc00858 和miR-3182 的相關性。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌及癌旁組織linc00858、miR-3182 相對表達量比較 宮頸癌、癌旁組織linc00858 相對表達量分別為2.73 ± 0.22、1.00 ± 0.00，二者比較，P＜0.05。宮頸癌、癌旁組織miR-3182 相對表達量分別為1.00 ± 0.00、0.71 ± 0.04，二者比較，P＜0.05。相關性分析結果顯示，宮頸癌組織中l(wèi)inc00858和miR-3182的表達呈負相關（r=0.343 2，P＜0.05）。

2.2 培養(yǎng)48 h 時各組細胞linc00858、miR-3182 相對表達量比較 培養(yǎng)48 h 時1、2、3、4 組細胞linc00858 相對表達量分別為0.45 ± 0.05、4.31 ±0.56、1.00 ± 0.00、1.00 ± 0.00，與3 組比較，1 組細胞linc00858 相對表達量低，與4 組比較，2 組細胞linc00858 相對表達量高（P均＜0.05）。培養(yǎng)48 h 時1、2、3、4 組細胞miR-3182相對表達量分別為4.36 ±0.60、0.54 ± 0.03、1.00 ± 0.00、1.00 ± 0.00，與3組比較，1 組細胞miR-3182 相對表達量高，與4 組比較，2組細胞miR-3182相對表達量低（P均＜0.05）。

2.3 MS751 細胞linc00858 與miR-3182 的靶向關系 ①RIP法分析結果為，加入抗AGO2抗體、IgG抗體的MS751細胞 linc00858和miR-3182沉淀RNA 相對表達量分別為0.68 ± 0.08、0.05 ± 0.02，二者比較，P＜0.05。 說明MS751 細胞中l(wèi)inc00858與miR-3182 存在靶向關系。②雙熒光素酶報告實驗結果為，一、二、三、四組細胞熒光素酶活性分別為1.00 ± 0.00、0.48 ± 0.04、1.00 ± 0.00、0.96 ±0.11。與一組比較，二組細胞熒光素酶活性低（P＜0.05），說明MS751 細胞中l(wèi)inc00858 與miR-3182 存在靶向關系。

2.4 培養(yǎng)48 h時各組細胞侵襲細胞數(shù)、遷移細胞數(shù)比較 培養(yǎng)48 h時1、2、3、4 組MS751 細胞遷移數(shù)分別為0.49 ± 0.05、3.71 ± 0.13、1.00 ± 0.00、1.00 ±0.00，與3 組比較，1 組細胞遷移數(shù)少，與4 組比較，2組細胞遷移數(shù)多（P均＜0.05）。培養(yǎng)48 h時1、2、3、4組MS751 侵襲細胞數(shù)分別為0.46 ± 0.06、2.84 ±0.21、1.00 ± 0.00、1.00 ± 0.00，與3 組比較，1 組細胞侵襲數(shù)少，與4 組比較，2 組細胞侵襲數(shù)多（P均＜0.05）?；貜蛯嶒烇@示，培養(yǎng)48 h 時si-NC 組、si-linc00858 組、si-linc00858 + miR-3182 inhibitor 組MS751 細胞的遷移數(shù)分別為1.00 ± 0.00、0.55 ±0.08、0.91 ± 0.15，與si-NC 組比較，si-linc00858 組細胞遷移數(shù)少，與si-linc00858 組比較，si-linc00858+ miR-3182 inhibitor 組細胞遷移數(shù)多（P均＜0.05）。培養(yǎng)48 h 時si-NC 組、si-linc00858 組、si-linc00858+ miR-3182 inhibitor 組MS751 細胞的侵襲數(shù)分別1.00 ± 0.00、0.55 ± 0.09、0.87 ± 0.01，與si-NC 組比較，si-linc00858 組細胞侵襲數(shù)少，與si-linc00858組比較，si-linc00858 + miR-3182 inhibitor 組細胞侵襲數(shù)多（P均＜0.05）。

3 討論

宮頸癌是發(fā)病率僅次于乳腺癌的女性第二常見惡性腫瘤。據(jù)報道，宮頸癌患者因腫瘤生長快、淋巴結轉移率高等特點，預后較差［7］。進一步探究宮頸癌的發(fā)病機制以及尋求新的分子標記物對宮頸癌的診斷、治療和改善預后有著重要的意義。近年來，lncRNA 作為多種疾病分子基礎的一部分被廣泛研究，是腫瘤領域的研究熱點。據(jù)報道，lncRNA 與癌癥的發(fā)生密切相關，它可以調節(jié)DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑，并作為miRNA 的前體，最終誘導癌癥的發(fā)生［8］。與此同時，lncRNA 也可以與ceRNA 等與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關的驅動基因競爭miRNA 反應元件，從而削弱miRNA 對靶基因的抑制，間接調節(jié)靶基因的表達水平，最終參與癌癥的調控過程［9］。LncRNA 在宮頸癌中異常表達，并通過不同的分子機制來參與調控宮頸癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程［10］，有望成為治療宮頸癌的有效靶點和預測預后的重要分子生物標志物。

Linc00858 （位于10q23.1 上，長度為2 685 nt）是一種新型的lncRNA，已被認為是致癌基因，它通過調節(jié)復雜的ceRNA 網(wǎng)絡促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。最先在肺癌中被研究，其在肺癌組織及細胞中異常高表達，且linc00858 的上調促進了肺癌細胞的增殖、侵襲和EMT［11］。我們前期研究中，linc00858 在宮頸癌細胞中表達水平顯著上調，并通過miR-3064-5p/VMA21 軸促進宮頸癌細胞增殖，抑制細胞凋亡［12］，提示linc00858 與宮頸癌等腫瘤的惡性行為相關。因此為了深入研究linc00858 在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究首先檢測了linc00858 在宮頸癌組織及細胞中的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織中l(wèi)inc00858 的表達明顯高于癌旁組織，MS751 細胞中l(wèi)inc00858 的表達高于Ect1/E6E7 細胞，與之前的研究結果相一致。干擾linc00858 顯著抑制宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力，提示linc00858 可能成為治療宮頸癌的潛在靶點，這與linc00858 在肺癌［11］、胃癌［13］以及結直腸癌［14］等惡性腫瘤中的作用相吻合。多項研究表明linc00858 的異常高表達與腫瘤不良預后相關，Ai 等［15］發(fā)現(xiàn)，linc00858 的高表達與胃癌的TNM 分期和淋巴轉移有關，linc00858高表達患者的總生存期和無病生存期明顯低于低表達患者。然而linc00858 的表達與患者的年齡、腫瘤直徑、FIGO分期、TNM、淋巴結轉移以及能否成為預測宮頸癌預后的生物標志物有待我們通過臨床試驗的進一步分析。

MiRNA 是一種具有17～25 個核苷酸的小型非編碼RNA，已被確定為細胞過程的主要調節(jié)劑，它們在腫瘤的發(fā)生、進展和轉移中起著至關重要的作用［16］。MiR-3182 是miRNA 家族之一，有人提出miR-3182 可作為部分腫瘤的抑制因子。在黑色素瘤的研究中，miR-3182 作為抑癌因子阻礙了黑色素瘤惡性行為的發(fā)展［17］。本研究首先通過RT-qPCR 檢測發(fā)現(xiàn)miR-3182 在宮頸癌組織和細胞中的表達水平較低。通過雙熒光素酶報告實驗及RIP 實驗驗證linc00858 與miR-3182 之間存在靶向結合位點。上調miR-3182 的表達逆轉了linc00858 對宮頸癌細胞惡性行為的促進作用，證實linc00858 可作為宮頸癌的促癌基因靶向負調控miR-3182 的表達。且回復實驗表明，抑制miR-3182 的表達，可以抵消沉默linc00858 的表達對宮頸癌細胞侵襲和遷移的抑制作用。

綜上所述，在宮頸癌組織及人宮頸癌細胞株中l(wèi)inc00858 高表達，miR-3182 低表達。Linc00858 可能通過競爭性結合miR-3182，抑制miR-3182 表達，促進宮頸癌細胞的侵襲和遷移。LncRNA 作用網(wǎng)絡是一個多層次、多方向、多交互和多維的結構，linc00858 是否與其他miRNA/lncRNA/mRNA/RBPs通信形成RNA調控網(wǎng)絡尚有待后續(xù)研究。