黃明偉 許朝祥 徐 源 張文兵 王耀國

（福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，泉州 362000）

心房顫動（atrial fibrillation，AF，簡稱房顫）是心缺乏規(guī)律的電活動，通常表現(xiàn)為快速無序狀態(tài)，可引起血流動力學改變，繼發(fā)房顫后形成血栓，致殘率及致死率升高[1]。射頻消融技術(shù)是一種具有微創(chuàng)、高效及安全的治療方法。射頻消融技術(shù)本質(zhì)是一種電磁波，通過使電極接觸生物組織，不斷變化電場產(chǎn)生熱量，進而改變組織細胞活性[2]。但射頻消融技術(shù)仍存在一定不足之處，治療過程中阻斷血流供應(yīng)，增加心肌組織損傷[3]。胺碘酮是一種Ⅲ類抗心律失常藥物，具有輕度Ⅰ類、Ⅱ類抗心顫藥物的作用[4]。研究顯示，在陣發(fā)性房顫患者采用射頻消融技術(shù)聯(lián)合胺碘酮導管灌注可以改善肺靜脈電隔離效率的同時大大降低復(fù)發(fā)率[5]。筆者推測射頻消融過程中持續(xù)灌注胺碘酮可使胺碘酮聚集于射頻消融損傷灶的心局部組織。為此，本研究通過家兔實驗，探討射頻消融過程中持續(xù)灌注胺碘酮，局部心臟消融組織病理損傷是否進一步加深加重，從而提高臨床療效，為陣發(fā)性房顫的防治提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級新西蘭兔，雌雄各半，3～4 月齡，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，購自福建醫(yī)科大學實驗動物中心，動物許可證號SCXX（閩）2021-0015。動物于清潔級動物實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，溫度23℃～25℃、濕度45%～55%，自由進食飲水。動物實驗經(jīng)福建醫(yī)科大學醫(yī)學動物實驗倫理委員會批準（批準號LL219102002）。

1.2 藥物、主要試劑與儀器

鹽酸胺碘酮注射液（海潤都制藥股份有限公司，國藥準字：H20045108）；戊巴比妥鈉（上海上藥新亞有限公司，注射用水稀釋為2%溶液）；Bax、Bcl-2、caspase-3 及caspase-9 單抗（艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物公司）；自動生化分析儀（Au5400，Beckman Coulter Inc，Massachusetts，CA，USA）；蛋白電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.3 動物模型建立

所有家兔均飼養(yǎng)在相同實驗室內(nèi)，建立房顫模型[6]。采用2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉家兔，在機械通氣下進行無菌胸廓切開術(shù)，暴露心房分離肺靜脈，將雙極電極植入家兔右側(cè)心房，后連接起搏器，在肺靜脈上進行間距為5 mm 的電刺激，恢復(fù)7 d 后，采用心電圖確保心房快速起搏為建模成功。假手術(shù)組僅進行開胸手術(shù)后縫合。實驗方案均經(jīng)動物實驗倫理委員會批準。

1.4 分組及干預(yù)方法

40 只家兔分為假手術(shù)組、房顫模型組（模型組）、射頻消融組及射頻+胺碘酮組，各組均10 只，家兔建模過程中由于術(shù)后感染死亡4 只；模型組、射頻消融組及射頻+胺碘酮組家兔分別為8 只、9只及9 只。射頻消融組采用射頻消融方法治療：家兔消毒后保持右側(cè)臥位，采用飛利浦IU Elite 型多普勒超聲進行引導，將探頭在心尖非標準采用導線進行定位，以心室間隔長軸與引導線之間的夾角，且與引導線進行重疊處進行穿刺。射頻針經(jīng)胸壁肋間穿刺達到心室隔基底部。整個進針過程采用超聲實施監(jiān)測，避免損傷柯氏三角區(qū)。采用剃毛刀將兔胸前毛剔除干凈，用手術(shù)刀作一長3～4 cm 的切口，深至深筋膜，然后采用止血鉗對筋膜下肌肉進行鈍性分離。在暴露3/4肋骨后，對2 根肋間動脈進行手術(shù)結(jié)扎，防止血液流出充滿胸腔無法進行后期實驗。肋間動脈結(jié)扎完畢后，沿著肋間動脈遠心端剪斷2 根肋骨使胸腔完全暴露于空氣中，隨后采用擴胸器撐開胸廓找到心，并對表面的心包進行小心剝離至完全暴露心。在左心房根部找到左心耳部位，并用醫(yī)用縫合線將其稍微提起。采用大頭直徑4mm Celsius 四極溫控消融導管，根據(jù)參數(shù)起始功率30 W，后按照10～15 W/min 逐漸加大功率，最大功率為80 W 進行消融，在家兔左心耳根部進行點線成環(huán)狀消融。

假手術(shù)組穿刺過程與其他組別相同，但是不進行消融。消融結(jié)束后所有家兔采用0.2 mL/kg的六氟化硫微泡（商品名：聲諾維）進行心肌聲學造影，評估射頻消融范圍。射頻+胺碘酮組在進行射頻消融過程中，胺碘酮用5%葡萄糖肝素化溶液稀釋500 mL，濃度為300 μg/mL，滴速為17 mL/min，通過導管持續(xù)灌注消融點；射頻消融組使用0.9%肝素化生理鹽水，通過導管持續(xù)灌注消融點。

1.5 心電圖

2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉各組家兔，固定后采用電子心電圖進行肢體導聯(lián)，記錄各組家兔心電圖。建模家兔會發(fā)生陣發(fā)性房顫；F 波出現(xiàn)、P 波消失為房顫，F(xiàn) 波消失、P 波出現(xiàn)為房顫終止，記錄各組家兔房顫的誘發(fā)時間及持續(xù)時間。

1.6 心功能

家兔胸部脫毛，采用彩色多普勒超聲診斷儀檢測各組家兔左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室縮短分數(shù)（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular endsystolic diameter，LVESD）、左心室舒張末期內(nèi)徑 （left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）。

1.7 H-E 染色檢測損傷灶病理損傷

各組家兔頸椎脫臼處死，剝離心，0.9% 生理鹽水清洗后切片，10%甲醛溶液固定，縱向切片，脫鈣，石蠟包埋切片4 μm，二甲苯脫蠟，蘇木精染色，鹽酸處理，伊紅復(fù)染，乙醇脫水，封片后觀察組織形態(tài)。

1.8 透射電鏡觀察心房超微結(jié)構(gòu)

左心房組織采用3%戊二醛固定后，采用醋酸雙氧鈾溶液和檸檬酸鉛溶液進行組織染色，采用日本電子JEM-1200EX 透射電鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)，電壓為70 kV，放大倍數(shù)為5 000～20 000。

1.9 TUNEL 法檢測心肌細胞凋亡率

心肌組織包埋切片，乙醇脫水，PBS 沖洗，加入20 μg/mL 的蛋白酶K 溶液，在23 ℃下孵育30 min，PBS 沖洗后，放入3% H2O2，15 min 后再次PBS 沖洗，加入50 μL 的TUNEL 反應(yīng)液，37℃下孵育60 min。PBS 沖洗，加入50 μL 轉(zhuǎn)化劑過氧化物酶，凋亡呈現(xiàn)熒光黃色，每張切片選擇5 個非重疊視野，計算細胞凋亡率，細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總細胞細胞數(shù)×100%。

1.10 免疫印跡檢測Bax、Bcl-2、caspase-3及caspase-9蛋白水平

心室肌組織PBS 沖洗后切碎，加入1 mL 的細胞裂解液，3 000 r/min 4℃離心5 min，取上清液，加入樣孔中，采用BCA 法檢測總蛋白濃度，每孔上樣蛋白量20 μg，SDS-PAGE 凝膠電泳。轉(zhuǎn)印緩沖液配制好后放入4℃冰箱內(nèi)預(yù)冷，然后全部轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，再加入脫脂奶粉，全程封閉時長為1 h。加入一抗Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶500）caspase-3（1∶500）及caspase-9（1∶500），TTBS漂洗，4℃過夜，加入羊抗兔IgG 二抗（1∶2 500），ECL 化學發(fā)光試劑系統(tǒng)JY-Clear 分析蛋白值。

1.11 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8 軟件進行分析及統(tǒng)計，各組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，計量資料數(shù)據(jù)采用±s描述，多組間比較采用方差分析，事后檢驗采用Bonferroni 法進行組間兩兩比較。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 心電圖比較

假手術(shù)組家兔心電圖可見明顯P 波，房顫模型組家兔P 波消失，出現(xiàn)典型F 波說明房顫模型建立成功。射頻消融組及射頻+胺碘酮組家兔心電圖明顯改變，F(xiàn) 波逐漸消失（圖1）。與假手術(shù)組相比，模型組心率（HR）升高，RR 間期降低，QRS 及QT間期升高（P＜0.05）；與模型組相比，射頻消融組房顫誘發(fā)時間延長，持續(xù)時間更短，HR 降低，RR間期升高，QRS 及QT 間期降低（P＜0.05）；與射頻消融組相比，射頻+胺碘酮組房顫誘發(fā)時間延長，持續(xù)時間更短，HR 降低，RR 間期升高，QRS 及QT 間期降低（P＜0.05）（表1）。

圖1 各組家兔心電圖比較

表1 各組家兔房顫誘發(fā)時間及持續(xù)時間比較（±s）

表1 各組家兔房顫誘發(fā)時間及持續(xù)時間比較（±s）

*P＜0.05 vs 假手術(shù)組；#P＜0.05 vs 模型組；△P＜0.05 vs 射頻消融組

組別n房顫誘發(fā)時間（s）房顫持續(xù)時間（s） HR（次/min）RR 間期（ms） QRS 間期（ms） QT 間期（ms）假手術(shù)組10--224.50±23.10385.20±29.6028.40±3.3085.10±12.00模型組84.60±0.426.88±0.74463.60±45.50*276.30±20.20*48.70±6.00*124.60±20.10*射頻消融組96.20±0.57#4.82±0.60#359.20±33.40*#320.00±20.00*#41.00±5.50*#114.00±18.20*#射頻+胺碘酮組97.14±0.63#△3.34±0.38#△296.00±27.00*#△ 351.50±21.302*#△ 35.20±4.90*#△ 105.80±15.00*#△P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 各組家兔心功能比較

與假手術(shù)組相比，模型組家兔LVEF、LVFS降低，LVESD及LVEDD升高（P＜0.05）。與模型組相比，射頻消融組家兔LVEF、LVFS升高，LVESD及LVEDD 降低（P＜0.05）。與射頻消融組相比，射頻+胺碘酮組家兔LVEF、LVFS 升高，LVESD及LVEDD 降低（P＜0.05）（表2）。

表2 各組家兔心功能比較（±s）

表2 各組家兔心功能比較（±s）

*P＜0.05 vs 假手術(shù)組；#P＜0.05 vs 模型組；△P＜0.05 vs 射頻消融組

組別nLVEF（%）LVFS（%）LVESD（mm）LVEDD（mm）假手術(shù)組1068.55±8.2046.20±5.253.22±0.666.33±0.80模型組848.66±6.54*26.25±4.58*7.22±0.70*9.68±1.02*射頻消融組952.25±5.69*33.02±5.11*#5.12±0.45*#8.02±0.74*#射頻+胺碘酮組959.55±6.33*#△38.55±5.44*#△4.30±0.51*#△7.14±0.69*#△P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 各組家兔心射頻損傷灶病理形態(tài)比較

假手術(shù)組家兔心肌組織結(jié)構(gòu)完整，心肌細胞排列整齊及致密。模型組家兔心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，心肌細胞排列紊亂、肥大，細胞間隙增加。射頻消融組心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂增加。射頻消融+胺碘酮組家兔心肌結(jié)構(gòu)紊亂程度降低，心肌細胞間隙縮?。▓D2）。

圖2 各組家兔心射頻損傷灶病理形態(tài)比較，H-E 染色。A：假手術(shù)組；B：模型組；C：射頻消融組；D：射頻+胺碘酮組；A1～D1：×100；A2～D2：×400.

2.4 各組家兔心肌組織形態(tài)

透射電鏡結(jié)果顯示，假手術(shù)組家兔心肌細胞肌節(jié)排列整齊，線粒體完好。與假手術(shù)組相比，模型組及射頻消融組心肌細胞肌節(jié)排列紊亂且線粒體嚴重腫脹變形。與模型組相比，射頻消融組紊亂更加嚴重。與射頻消融組相比，射頻+胺碘酮組心肌細胞肌節(jié)紊亂改變，線粒體腫脹現(xiàn)象好轉(zhuǎn)（圖3）。

圖3 各組家兔心肌組織電鏡結(jié)果，×20 000。A：假手術(shù)組；B：模型組；C：射頻消融組；D：射頻+胺碘酮組.

2.5 各組家兔心肌細胞凋亡率比較

與假手術(shù)組心肌細胞凋亡率（4.30%±0.50%）相比，模型組家兔心肌細胞凋亡率（12.15%±1.35%）升高（P＜0.05）。與模型組相比，射頻消融組心肌細胞凋亡率（32.25%±3.66%）升高（P＜0.05）。與射頻消融組相比，射頻+胺碘酮組心肌細胞凋亡率（25.66%±2.51%）降低（P＜0.05），（圖4）。

圖4 TUNEL 法檢測各組家兔心肌細胞凋亡，×200。A：假手術(shù)組；B：模型組；C：射頻消融組；D：射頻+胺碘酮組.

2.6 各組家兔心肌Bcl-2、Bax、caspase-3 及caspase-9蛋白表達比較

與假手術(shù)組相比，模型組Bcl-2降低，Bax、caspase-3及caspase-9升高（P＜0.05）。與模型組相比，射頻消融組Bcl-2降低，Bax、caspase-3及caspase-9升高（P＜0.05）。與射頻消融組相比，射頻+胺碘酮組Bcl-2升高，Bax、caspase-3及caspase-9降低（P＜0.05）（圖5，表3）。

圖5 各組家兔Bcl-2、Bax、caspase-3 及caspase-9 蛋白免疫印跡檢測電泳條帶

表3 各組家兔Bcl-2、Bax、caspase-3 及caspase-9 蛋白表達比較（±s）

表3 各組家兔Bcl-2、Bax、caspase-3 及caspase-9 蛋白表達比較（±s）

*P＜0.05 vs 假手術(shù)組；#P＜0.05 vs 模型組；△P＜0.05 vs 射頻消融組

組別nBcl-2BaxCaspase-3Caspase-9假手術(shù)組101.81±0.250.68±0.040.90±0.081.20±0.12模型組81.02±0.09*1.25±0.16*2.02±0.26*1.96±0.18*射頻消融組90.85±0.06*#1.36±0.15*#2.35±0.30*#2.11±0.21*#射頻+胺碘酮組91.44±0.12*#△0.96±0.10*#△1.56±0.11*#△1.53±0.14*#△P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

3 討論

房顫已經(jīng)成為嚴重威脅公眾生命健康的疾病之一，對其治療機制的研究一直是眾多學者關(guān)注的重點[6]。射頻消融可顯著改善房顫患者心功能，電極通過穩(wěn)定電流的物理性穿透力對局部組織產(chǎn)生高熱效應(yīng)，局部心肌組織易產(chǎn)生凝固性壞死而阻斷房顫的異位傳導從而發(fā)揮改善房顫的目的，但同時加快心肌損傷，提高心肌細胞凋亡[7]。

當前臨床治療房顫的主要目的是恢復(fù)正常的竇性心律，保證心房心室收縮及舒張的規(guī)律性。房顫采用射頻消融可以通過保證消融的透壁性和徑線的連續(xù)性，射頻通過穩(wěn)定電流的物理性具有較好的穿透力對局部組織產(chǎn)生高熱效應(yīng)，形成凝固性壞死而阻斷房顫的異位傳導，從而發(fā)揮改善房顫的目的，延長房顫誘發(fā)時間，縮短持續(xù)時間。Ⅲ類抗心律失常藥物胺碘酮可以通過延長心肌組織的動作電位Q-T 間期的時間及有效不應(yīng)期，而抑制竇房結(jié)和房室結(jié)，從而延長房室結(jié)傳導，故可有效轉(zhuǎn)復(fù)房顫。本研究心電圖結(jié)果顯示，射頻消融組及射頻+胺碘酮組家兔F 波出現(xiàn)延長，房顫持續(xù)時間縮短。

心功能檢測證實，與模型組比較，射頻消融組及射頻+胺碘酮組LVEF、LVFS升高，LVESD及LVEDD降低，說明射頻消融及胺碘酮均可以改善房顫家兔心功能，且聯(lián)合效果更佳。房顫可顯著增加心室負擔，心肌能量供需不平衡、氧化應(yīng)激增加可導致心功能降低。射頻消融作用與消融過程中必須要產(chǎn)生足夠大的損傷區(qū)域從而徹底阻斷異常點興奮的傳導路徑而改善心臟功能相關(guān)[8]。射頻消融術(shù)可以降低左心房的直徑及容積，并且不降低左心房功能。接受射頻消融的房顫患者，快速的心房率轉(zhuǎn)變?yōu)橐?guī)律的竇性心律，心房內(nèi)壓力及容積減少，失去對心肌細胞的過度牽拉作用，使左心房發(fā)生逆重構(gòu)。胡金[15]研究了58 例行導管消融術(shù)的心衰合并房顫患者，入選患者的LVEF 值均＜45%，對隨訪患者術(shù)后 1、3、6 個月及 12 個月時的 LVEF、左心室內(nèi)徑、癥狀改善情況、活動耐受力進行評價，平均隨訪（12±7）月后，78%的患者維持竇性心律，心功能、運動耐量、生活質(zhì)量及癥狀都有顯著改善。胺碘酮為臨床常用的Ⅲ類廣譜抗心律失常藥物，對心肌中鉀離子、鈉離子、鈣離子及β 受體具有不同程度的阻斷作用，并可以顯著延長心肌細胞中動作電位時程，緩解心動過速癥狀。另有研究顯示，胺碘酮為苯呋喃衍生物，是多通道阻滯劑，可以改善心房肌及心室肌動作電位時程及有效不應(yīng)期延長的作用[10]。謝虹等[11]研究顯示，對房顫患者采用胺碘酮治療后心功能顯著改善，提示胺碘酮可以通過阻斷鈉通道而阻斷快速心率，增加血流量、降低外周阻力、減少心肌耗氧量等作用。

本研究結(jié)果表明，H-E 染色及電鏡觀察顯示房顫大鼠經(jīng)射頻消融治療后心肌損傷加重，TUNEL法檢測心肌細胞凋亡率升高，說明射頻消融后心肌組織受損，導致心肌細胞凋亡；射頻+胺碘酮治療后心肌損傷及心肌細胞凋亡率均改善，說明胺碘酮對心具有保護作用。研究表明，射頻消融過程中主要病理變化為孤立的、界限清楚的凝固性壞死，這與消融過程中導致的心肌組織多種酶活性改變，降低心肌細胞代謝能量需求導致細胞結(jié)構(gòu)破壞和壞死凋亡相關(guān)[12]。射頻消融術(shù)后患者心臟交感神經(jīng)及迷走神經(jīng)損傷，可加快心室重塑導致心肌組織缺血而促進心肌細胞凋亡。房顫患者行射頻消融術(shù)后會損傷心肌細胞，心房的傳導功能出現(xiàn)障礙，心房肌出現(xiàn)收縮不均一現(xiàn)象。雖然有竇性心律的維持，但是房顫消融術(shù)后發(fā)生心房頓抑，心房及心耳的機械功能下降，導致血流緩慢，因此左房易形成血栓，當血栓脫落時引起臨床上一系列血栓栓塞事件。胺碘酮是一種輕度非競爭性的α 及β 腎上腺素受體阻滯劑，親脂性較高，抗氧自由基能量較強。在犬分離出的心肌細胞中采用電子順磁共振方法檢測自由基，證實胺碘酮可以減少自由基導致的心肌細胞損傷，降低凋亡。Oswald 等[14]研究顯示，射頻消融過程中可增加局部組織炎癥反應(yīng)，主要表現(xiàn)為腫瘤壞死因子水平升高，并進一步加快氧化應(yīng)激反應(yīng)而誘導細胞損傷，但是在3 d 后心肌損傷可逐步改善。胺碘酮可減少氧自由基對細胞損傷，抑制細胞膜脂質(zhì)過氧化，改善細胞內(nèi)鈣離子負荷，進而發(fā)揮抗心肌細胞凋亡的作用[15]。本研究結(jié)果表明，射頻消融組家兔心肌組織中Bcl-2 降低，Bax、caspase-3及caspase-9 升高，與射頻消融組對比，射頻+胺碘酮組Bcl-2 升高，Bax、caspase-3 及caspase-9 降低，說明胺碘酮可以通過調(diào)節(jié)細胞凋亡相關(guān)信號通路而抑制心肌細胞凋亡。Bcl-2 家族在調(diào)節(jié)細胞活性中發(fā)揮重要作用[16]。Bax 是Bcl-2 成員之一，主要發(fā)揮加快細胞凋亡作用，作用機制在于與Bcl-2 形成同源二聚體，降低了Bcl-2 抗凋亡的同時還可以啟動caspase 酶級聯(lián)反應(yīng)而上調(diào)caspase-3 及caspase-9活性共同發(fā)揮促凋亡作用[17-18]。胺碘酮在抗心肌缺血損傷中證實對Bcl-2/Bax 信號具有調(diào)節(jié)作用，機制可能在于胺碘酮可以調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax 活性而降低心肌細胞凋亡，對心肌組織發(fā)揮保護作用[19]。胺碘酮有拮抗兔心肌凋亡的作用，已有研究表明與其可以上調(diào)Bcl-2 蛋白，下調(diào)Bax 及caspase-3 活性相關(guān)[20]，本研究與之前研究結(jié)果相似。

綜上所述，房顫家兔采用射頻消融術(shù)后心電圖及心功能改善，但是心肌組織損傷及心肌細胞凋亡加劇，胺碘酮導管灌注可以減少心肌組織射頻損傷，降低心肌細胞凋亡率，具有保護心的作用。