欒珺 韓鋒產(chǎn)

濱州醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山東省醫(yī)藥衛(wèi)生耳科遺傳病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（煙臺 264003）

感音神經(jīng)性耳聾是世界范圍內(nèi)的多發(fā)病，有多種致病因素，主要包括遺傳因素、氧化應(yīng)激、衰老、耳蝸血管變化和環(huán)境因素（如噪音、耳毒素、氨基糖苷素等），大部分耳聾伴有耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元的死亡或退化[1]。耳蝸毛細(xì)胞(Hair Cells,HCs)的丟失或損傷引起內(nèi)耳感覺細(xì)胞的損傷會導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾[2]。迄今為止，已有150 多種基因突變或異常會導(dǎo)致聽力損失[3]，高發(fā)的遺傳性耳聾相關(guān)致病基因主要包括GJB2，SLC26A4和MT-RNR1[4]，但仍有很多耳聾相關(guān)新基因及新突變有待發(fā)掘。

非哺乳類脊椎動物（如鳥類）和斑馬魚側(cè)線具有毛細(xì)胞再生能力，毛細(xì)胞丟失后，可通過再生毛細(xì)胞來恢復(fù)受損的聽力[5]。兩周齡左右的哺乳動物的毛細(xì)胞雖自我再生能力有限，但通過調(diào)控相關(guān)信號通路或基因仍可再生；而成年哺乳動物的毛細(xì)胞和支持細(xì)胞(Supporting Cells,SCs)已達(dá)到最終分化狀態(tài)，其毛細(xì)胞損傷將導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)性聽力損失，進(jìn)而造成永久性感音神經(jīng)性聽力喪失[6]。

Atonal homolog 1(Atonal homolog 1,Atoh1)對耳蝸毛細(xì)胞和耳蝸核(Cochlear Nuclei)的發(fā)育至關(guān)重要[7]，其通過與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相關(guān)分子共同作用以驅(qū)動毛細(xì)胞的再生。本文綜合論述了Atoh1調(diào)控毛細(xì)胞再生與誘導(dǎo)干細(xì)胞分化毛細(xì)胞的研究進(jìn)展，探討通過調(diào)控Atoh1 基因的表達(dá)以修復(fù)毛細(xì)胞損傷所致聽力障礙的新途徑。

1 Atoh1的結(jié)構(gòu)、表達(dá)特征及功能

Atoh1基因是果蠅原核基因Atonal的同源物。在小鼠Atoh1基因又稱為Math1基因，在人稱為HATA1基因[8]。該基因含一個外顯子，無內(nèi)含子，編碼序列長度為1.053Kb[9]；編碼產(chǎn)物Atoh1 是一轉(zhuǎn)錄因子，由354個氨基酸組成[10]，分子量為37.9kDa，具有高度保守長度約為56 個氨基酸殘基的basic Helix-Loop-Helix(basic Helix-Loop-Helix,bHLH)模體[9]，被認(rèn)為是毛細(xì)胞分化的關(guān)鍵啟動因子。

毛細(xì)胞的形成可以通過HCs 的分化、SCs 的有絲分裂或SCs 的轉(zhuǎn)分化來實(shí)現(xiàn)，其形成與發(fā)育依賴于Atoh1 的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因小鼠中，Atoh1 先在小鼠胚胎發(fā)育初期的耳蝸底部附近表達(dá)，在E13.5 到E17.5 時(shí)到達(dá)峰值。在出生后的第1周，Atoh1 表達(dá)相比于E17.5 顯著減少；到出生后第6 天(Postnatal day 6,P6)，Atoh1 幾乎不表達(dá)；在P1-6期間，Atoh1可誘導(dǎo)SCs轉(zhuǎn)分化為未成熟的HCs。但隨著小鼠周齡的增加，SCs 轉(zhuǎn)分化為HCs 的能力逐漸消失，在2周左右完全喪失[11]。

Atoh1 能夠協(xié)調(diào)細(xì)胞命運(yùn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和增殖。研究發(fā)現(xiàn)，在Atoh1基因表達(dá)過的小鼠模型中，Atoh1基因能夠使內(nèi)耳祖細(xì)胞分化為毛細(xì)胞并調(diào)控毛細(xì)胞的分化及活性[12]；在Atoh1基因敲除的小鼠模型中，哺乳動物將失去形成耳蝸毛細(xì)胞和前庭毛細(xì)胞的能力[13]。

Shuting Li 等[14]研究發(fā)現(xiàn)Atoh13*HA-P2A-Cre小鼠是研究毛細(xì)胞分化的理想遺傳模型。陳志婷等[15]選用重組腺病毒-Math1-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)，優(yōu)化體外轉(zhuǎn)染條件，轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)重組腺病毒載體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率達(dá)到了94%。Li W 等[16]采用一種新型耳蝸外植體培養(yǎng)系統(tǒng)（包括感覺上皮和周圍的骨結(jié)構(gòu)），以攜帶CMV 啟動子驅(qū)動的人ATOH1(Ad-Atoh1)腺病毒感染培養(yǎng)的Atoh1-GFP 轉(zhuǎn)基因成年小鼠耳蝸，在轉(zhuǎn)基因小鼠耳蝸外植體中檢測到大量Myo7a+、Pvalb+的表達(dá)，證明Atoh1基因過表達(dá)可促進(jìn)SCs 轉(zhuǎn)分化為HCs。

2 Atoh1在毛細(xì)胞發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制

2.1 Atoh1與其上下游調(diào)控基因共同作用來驅(qū)動毛細(xì)胞再生與分化

Atoh1 在內(nèi)耳毛細(xì)胞分化中起重要作用，Sox2、Eya1和Six1是Atoh1 上游調(diào)控基因，Gfi1、Pou4f3和Barhl1是Atoh1下游調(diào)節(jié)基因。

Sox2 是具有HMG 結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎和各種器官的祖細(xì)胞以及發(fā)育和成熟的神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá),可通過刺激Atoh1 的表達(dá)以促進(jìn)毛細(xì)胞的形成[17]。Kempfle JS 等[18]利用Sox2-Cre-ER;Sox2flox/flox條件性敲除小鼠Sox2 基因，發(fā)現(xiàn)在感覺祖細(xì)胞(Sensory Progenitors) 形成后，Sox2基因的缺失能夠阻斷毛細(xì)胞分化，表明Sox2 不僅是形成感覺祖細(xì)胞的必要條件，而且是感覺祖細(xì)胞分化為毛細(xì)胞所必需的。

Eya1/Six1主要參與耳的早期發(fā)育，是形成耳蝸和誘導(dǎo)Sox2 表達(dá)所必需的。Ahmed M 等[19]的研究結(jié)果表明，在小鼠耳蝸外植體中，Eya1/Six1 可以通過激活A(yù)toh1 依賴途徑及非依賴的途徑，誘導(dǎo)Sox2低表達(dá)的非感覺上皮中的毛細(xì)胞再生。Sox2 與Eya1/Six1 共表達(dá)，通過直接結(jié)合Atoh1基因3'端增強(qiáng)子，上調(diào)Atoh1表達(dá)，從而決定毛細(xì)胞命運(yùn)。

Gfi1基因在耳蝸毛細(xì)胞發(fā)育時(shí)開始表達(dá)，Gfi1基因缺失會導(dǎo)致胚胎耳蝸毛細(xì)胞無法發(fā)育成完全功能的成熟耳蝸毛細(xì)胞。Lee S等[20]研究發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)的Atoh1基因表達(dá)相比，Atoh1與Gfi1基因共表達(dá)導(dǎo)致4 周后新的毛細(xì)胞樣細(xì)胞(HC-Like Cells,HCLC)增加了6.2 倍，在整個耳蝸中檢測到了新的HCLC，其未成熟的靜纖毛存活至少8周。

Pou4f3 能控制毛細(xì)胞的分化、成熟及存活[21]。在Walters BJ 等[22]的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，在成年小鼠，與單獨(dú)的Atoh1基因表達(dá)相比，Pou4f3和Atoh1基因聯(lián)合表達(dá)可使更多的SCs 轉(zhuǎn)化為HCs。Costa等[23]同樣發(fā)現(xiàn)Atoh1基因單獨(dú)表達(dá)不能誘導(dǎo)毛細(xì)胞再生，而與Pou4f3和Gfi1基因聯(lián)合表達(dá)后，無論在體外還是在體內(nèi)都能夠有效地促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞(mouse Embryonic Stem Cells,mESCs)分化成毛細(xì)胞樣細(xì)胞。

Barhl1 在內(nèi)耳高度表達(dá)，對于介導(dǎo)聽力和平衡之聽覺毛細(xì)胞的持續(xù)生存至關(guān)重要[24]。Barhl1基因是毛細(xì)胞中Atoh1潛在的靶點(diǎn)，Atoh1與位于3'端增強(qiáng)子的E3 位點(diǎn)結(jié)合以激活Barhl1基因的表達(dá)，從而驅(qū)動前感覺細(xì)胞分化為新生毛細(xì)胞[25]。Menendez L 等[26]研究證實(shí)Barhl1基因的靶向敲除雖不影響mESCs 向早期原始外胚層樣細(xì)胞和耳祖細(xì)胞的分化，但強(qiáng)烈抑制毛細(xì)胞樣細(xì)胞的分化。

正常毛細(xì)胞發(fā)育是否成功在于聽覺毛細(xì)胞的成熟和維持。Atoh1通過與以上因子共同作用來驅(qū)動毛細(xì)胞的分化與成熟，這為我們提供了另一種基因治療的方法。

2.2 調(diào)控Atoh1相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與毛細(xì)胞再生

Notch、Wnt/β-catenin、Sonic Hedgehog(Sonic Hedgehog,SHH)及Fibroblast Growth Factor(Fibroblast Growth Factor,FGF)等相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是耳蝸發(fā)育過程中決定前感覺細(xì)胞增殖和細(xì)胞命運(yùn)的重要途徑。抑制Notch 信號通路或促進(jìn)Wnt/βcatenin、SHH 或FGF 信號通路，都是毛細(xì)胞再生的有效的方法。Notch 信號通路可通過抑制Atoh1基因表達(dá)來抑制毛細(xì)胞增殖及分化。當(dāng)Notch信號分子與Jag2 和Deltal（Notch 信號配體）結(jié)合后，NICD(Notch1 Intracellular Domain)從膜中釋放，通過上調(diào)Atoh1 基因的抑制因子Hes1 及Hes5，阻斷Atoh1 的表達(dá)，進(jìn)而抑制毛細(xì)胞及支持細(xì)胞的增殖與分化[27]。有研究發(fā)現(xiàn)，可以采用γ-分泌酶抑制劑以抑制Notch 信號通路，從而促進(jìn)毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的增殖與分化[28]。Wnt/β-catenin 信號通路的激活能夠抑制細(xì)胞的凋亡,減少毛細(xì)胞的損傷,甚至促進(jìn)毛細(xì)胞增殖與再生[29]。β-catenin 是一種多功能連環(huán)蛋白，在Wnt信號的激活下，可從胞漿進(jìn)入胞核，形成β-catenin/Tcf 復(fù)合物，驅(qū)動Wnt 靶基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)毛細(xì)胞的再生。有研究表明，β-catenin 與Atoh1基因3'端增強(qiáng)子相互作用可介導(dǎo)新生耳蝸Lgr5+細(xì)胞亞群的增殖和分化，從而克服成年哺乳動物毛細(xì)胞無法再生的缺陷[30]。SHH 信號通過上調(diào)Atoh1-Brn3.1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)耳蝸神經(jīng)祖細(xì)胞的分化。在SHH 信號刺激下，Atoh1 可以調(diào)節(jié)顆粒神經(jīng)祖細(xì)胞(Granular Neural Progenitor cells,GNPs)中SHH 依賴性增殖并誘導(dǎo)其分化；Gli1是SHH 信號通路的下游基因，在沒有SHH 信號的情況下，Atoh1 基因的過度表達(dá)不能支持GNPs 的增殖[31]。FGF 負(fù)調(diào)控Atoh1 的表達(dá)，從而防止毛細(xì)胞的過早分化。其主要是通過激活SHH 信號通路，維持Notch 效應(yīng)物Hey1、Hey2 的表達(dá)水平[27]。FGF 信號能控制前感覺細(xì)胞在耳蝸發(fā)育過程中向毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的分化[32]。FGF 信號的共同選擇可能會使支持細(xì)胞無需與周圍的毛細(xì)胞直接接觸，實(shí)現(xiàn)內(nèi)耳復(fù)雜細(xì)胞鑲嵌的進(jìn)化與重塑[33]。

3 Atoh1依賴性干細(xì)胞向毛細(xì)胞的分化

干細(xì)胞能分化為各種不同類型的組織細(xì)胞，具有分化毛細(xì)胞的潛能。近期研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)具有高擴(kuò)增、遺傳穩(wěn)定、易于分離培養(yǎng)、低免疫源性和免疫調(diào)節(jié)等功能，可促進(jìn)神經(jīng)組織修復(fù)[34]。Kazuo等[35]研究發(fā)現(xiàn)BMSCs 在適宜條件下可誘導(dǎo)生成HCLCs，并檢測到毛細(xì)胞標(biāo)志物MyosinⅦA的表達(dá)；Lopez-Juarez,A 等[36]通過耳蝸造孔術(shù)法把Atoh1-GFP 表達(dá)小鼠的外毛細(xì)胞祖細(xì)胞(Outhair Progenitor Cells,OPCs)移植入成年耳毒性模型豚鼠前庭室，發(fā)現(xiàn)移植的耳祖細(xì)胞可以存活并遷移到耳蝸感覺上皮，其中一些細(xì)胞開始分化為表達(dá)標(biāo)記蛋白的耳感覺細(xì)胞。Zhang YL 等[37]發(fā)現(xiàn)，人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有分化為人毛細(xì)胞祖細(xì)胞的潛力，小的活化RNA(small activating RNA,saRNA)能夠靶向作用于ATOH1基因并上調(diào)其表達(dá)；將能夠有效、持續(xù)激活A(yù)TOH1基因表達(dá)的saRNA 轉(zhuǎn)染到毛細(xì)胞祖細(xì)胞中，10 天后成功檢測到內(nèi)耳毛細(xì)胞特征性標(biāo)志物Pou4f3和Myo7a的表達(dá)。

4 總結(jié)與展望

Atoh1 是bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，表達(dá)于耳蝸毛細(xì)胞，調(diào)控毛細(xì)胞的再生與分化。Atoh1可與其上下游調(diào)控分子相互作用，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞的再生。目前，針對Atoh1基因的毛細(xì)胞再生實(shí)驗(yàn)雖已取得一定的效果，但仍然處于初級階段。在未來，靶向調(diào)控耳祖細(xì)胞或干細(xì)胞的Atoh1及其相關(guān)基因，將為毛細(xì)胞損害的臨床治療提供新途徑。