沈 艦 紀(jì) 磊 何 亮

(1.湖北省十堰市教育科學(xué)研究院 2.湖北省十堰市一中 3.湖北省襄陽(yáng)市一中)

隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展,曾經(jīng)遙不可及的PCR技術(shù)逐步走進(jìn)了高中實(shí)驗(yàn)室,甚至進(jìn)入到尋常百姓家?？碱}中有關(guān)PCR的問題越來越多,設(shè)問考查深度也明顯提升。筆者在走訪調(diào)研中發(fā)現(xiàn),零碎的試題講解效果有限,既無法讓學(xué)生系統(tǒng)掌握不同PCR技術(shù)的用途,也無法切實(shí)提升學(xué)生的關(guān)鍵能力和探究素養(yǎng)。下面筆者將結(jié)合高中生物學(xué)?？嫉腜CR類試題,淺談六類PCR擴(kuò)增技術(shù),為教學(xué)提供參考。

1.常規(guī)PCR

人教版教材中介紹的就是常規(guī)PCR流程。在PCR儀中通常要加入7種成分:模板DNA片段、引物、脫氧核苷酸底物、Taq酶、酶所需緩沖液、Mg2+和純凈水。在此提示幾點(diǎn)注意事項(xiàng):一是引物的長(zhǎng)度一般在16 bp以上,以避免其與模板配對(duì)時(shí)的非特異性結(jié)合。但引物越長(zhǎng),需要測(cè)定的模板DNA序列越多,制作引物的成本越高,所以18～30 bp是較為理想的長(zhǎng)度。二是引物中G+C的含量要盡量控制在40%～60%,這樣可以保證較高的退火溫度,3′末端要盡量避免T(引物末尾堿基是T時(shí)錯(cuò)配的概率遠(yuǎn)大于其他3種)。三是緩沖液中需要添加Mg2+來激活Taq酶的活性中心。

常規(guī)PCR的相應(yīng)例題較為普遍,在此不再贅列。

2.反向PCR

反向PCR多用于擴(kuò)增的DNA分子中僅部分序列已知,其擴(kuò)增的思路:先利用多種限制酶對(duì)待測(cè)DNA片段進(jìn)行隨機(jī)切割,再利用DNA連接酶對(duì)片段進(jìn)行環(huán)化。隨后在已知序列的兩個(gè)末端設(shè)計(jì)引物,進(jìn)而來擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列。以2022年浙江省某模擬題為例:

例1.反向PCR可利用一段已知DNA序列設(shè)計(jì)合理的引物,擴(kuò)增已知序列兩端的未知序列,如圖1所示。圖中已知序列一條鏈的堿基排列順序?yàn)椤?′-AACTATGCGCTCATGA-……-GCAATGCGTAGCCTCT-3′”。下列敘述錯(cuò)誤的是

圖1 反向PCR流程圖

( )

A.Ⅰ酶切:用一種限制酶切割DNA,以使兩端未知序列形成相同的黏性末端

B.Ⅱ連接:使用DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間形成磷酸二酯鍵

C.設(shè)計(jì)的兩種引物分別是“5′-AACTAT GCGCTCATGA-3′”和“5′-AGAGGCTACGCAT TGC-3′”

D.對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序,經(jīng)分析得到了片段F的完整序列,該DNA單鏈序列可能為“5′-AATTC CAGT-……-CTGAATT-3′”

答案：C。兩種引物需與已知序列發(fā)生互補(bǔ)配對(duì),而后向兩側(cè)延伸合成未知序列。

反向PCR在基因序列鑒定過程中具有獨(dú)到優(yōu)勢(shì),但也存在一些限制條件:一是必須選擇一種合適的限制酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小的DNA片段。二是若使用的引物含有待測(cè)DNA的某些重復(fù)序列,反向PCR得到的探針就有可能與多個(gè)基因序列雜交。

3.多重PCR

多重PCR(MPCR)在高中生物學(xué)考題中出現(xiàn)的頻率非常高,顧名思義就是在同一反應(yīng)體系中使用一對(duì)以上的引物對(duì)同一DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增,不同引物結(jié)合的位置不同,擴(kuò)增的產(chǎn)物也有差異。通過比較擴(kuò)增產(chǎn)物的大小差異即可判斷樣品中有哪些基因。比較典型的是2022年湖南省生物聯(lián)賽初賽的一道題:

例2.隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,MPCR技術(shù)在擴(kuò)增方面取得新的突破,不再局限于在同一反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增,而是將不同的引物對(duì)和模板分散于相應(yīng)獨(dú)立的空間中進(jìn)行擴(kuò)增。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是

( )

A.對(duì)于同一DNA片段的不同區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增時(shí),不同引物的堿基排列順序不能互補(bǔ)

B.同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增不同模板時(shí)需加入更多TaqDNA聚合酶才能使擴(kuò)增正常進(jìn)行

C.在目的DNA片段擴(kuò)增時(shí),若復(fù)性階段溫度控制過高,可能導(dǎo)致無產(chǎn)物

D.PCR擴(kuò)增DNA時(shí)打開雙螺旋的方式與細(xì)胞內(nèi)不同,實(shí)質(zhì)都是磷酸二酯鍵斷裂

答案：D。PCR擴(kuò)增時(shí)打開的是DNA的氫鍵,與細(xì)胞內(nèi)打開方式不同,但作用的化學(xué)鍵相同,D錯(cuò)誤。

多重PCR最大的缺陷是由于擴(kuò)增產(chǎn)物不同,擴(kuò)增多次后形成二聚體和多聚體的概率逐步增大,導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增大幅上升。

4.巢式PCR

巢式PCR先用待擴(kuò)增DNA外側(cè)的一對(duì)引物完成一次PCR,再將其作為模板,根據(jù)原來引物內(nèi)側(cè)的序列設(shè)置新的引物,再次完成第二次PCR。由于第二次PCR的模板DNA片段更短,引物更小,因此可以減少第一次擴(kuò)增中出現(xiàn)的非特異性擴(kuò)增片段,提升擴(kuò)增的精確性。但由于操作過程中的開蓋處理,會(huì)增加產(chǎn)物污染的概率。以2022年揚(yáng)州三模22題的一部分為例:

例3.圖2是巢式PCR工作原理示意圖,請(qǐng)回答:

圖2 巢式PCR示意圖

(1)若用外引物擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片段,再用內(nèi)引物在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率________,因此,相較常規(guī)PCR獲得的產(chǎn)物而言,巢式PCR獲得產(chǎn)物特異性________。

(2)巢式PCR通常在一個(gè)試管中進(jìn)行第一階段反應(yīng),然后將中間產(chǎn)物等轉(zhuǎn)移到第二試管中進(jìn)行第二階段反應(yīng),不在同一試管中進(jìn)行的主要原因是________。

答案：(1)降低 更強(qiáng) (2)防止內(nèi)引物在第一階段PCR中發(fā)揮作用,無法實(shí)現(xiàn)巢式PCR高精確擴(kuò)增的目的

對(duì)比巢式PCR和多重PCR,巢式PCR中外側(cè)引物和內(nèi)側(cè)引物有一定關(guān)聯(lián)但不完全相同,兩次PCR模板不同,有先后順序。多重PCR是一次性在緩沖液中加入多對(duì)引物對(duì)同一DNA分子的不同片段進(jìn)行擴(kuò)增。當(dāng)需要對(duì)多個(gè)目的基因進(jìn)行高精度擴(kuò)增時(shí),可同時(shí)采用多重PCR和巢式PCR。

5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR建立在早期逆轉(zhuǎn)錄PCR的基礎(chǔ)上。早期的逆轉(zhuǎn)錄PCR通過對(duì)mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成的產(chǎn)物進(jìn)行電泳,觀察電泳帶的亮度來衡量mRNA的量,但由于亮度極差很難區(qū)分,且擴(kuò)增效率達(dá)不到100%,因此檢測(cè)結(jié)果誤差大。

在此基礎(chǔ)上,科學(xué)家開始探索檢測(cè)每一輪PCR產(chǎn)物的累計(jì)數(shù)量,熒光定量檢測(cè)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。這種技術(shù)通過熒光標(biāo)記的方式,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,結(jié)合電腦軟件對(duì)每輪產(chǎn)物進(jìn)行分析,從而精確計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量。目前熒光標(biāo)記的方式比較多,但高中生物學(xué)試題?？嫉氖撬馓结?TaqMan探針)標(biāo)記,以下題為例作重點(diǎn)介紹:

例4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QPCR)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍。TaqMan探針是QPCR技術(shù)中一種常用探針,圖3為TaqMan熒光探針及其作用原理示意圖:

正向引物:GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

若每分子探針?biāo)忉尫诺腞基團(tuán)熒光強(qiáng)度為A,加入B個(gè)模板DNA分子(目的基因),通過QPCR進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系中熒光信號(hào)強(qiáng)度(Rn)與擴(kuò)增次數(shù)(n)之間的關(guān)系:Rn=________。

答案：AB×(2n-1)

此類題目多對(duì)知識(shí)背景進(jìn)行了簡(jiǎn)化。這里補(bǔ)充一個(gè)知識(shí):Taq酶不僅具有DNA聚合酶的性質(zhì),還兼有5′-3′外切酶的活性,在延伸到探針附近時(shí),能將其5′端切離。

6.不對(duì)稱PCR

前五種PCR,加入的均為相向配制的成對(duì)引物,如果在反應(yīng)體系中只加入一種引物,就只能擴(kuò)增目的基因的一條鏈,這種擴(kuò)增方式稱為不對(duì)稱PCR。這種PCR的主要目的就是讓需要研究的模板鏈含量迅速增加,常用于DNA單鏈的測(cè)序以及定點(diǎn)突變的檢測(cè)。在實(shí)際操作過程中,為了讓模板鏈的基數(shù)增加,也可以加一對(duì)引物,但兩種引物的濃度差異較大,使得一條鏈的擴(kuò)增速度遠(yuǎn)大于另一條,體現(xiàn)了不對(duì)稱的本質(zhì)。以一道模擬題為例:

例5.不對(duì)稱PCR是利用不等量的一對(duì)引物來產(chǎn)生大量單鏈DNA的方法。這兩種引物分別稱為限制性引物與非限制性引物,在PCR反應(yīng)的最初10～15個(gè)循環(huán)中,其擴(kuò)增產(chǎn)物最初主要是雙鏈DNA,但當(dāng)限制性引物消耗完后,非限制性引物引導(dǎo)的PCR就會(huì)產(chǎn)生大量單鏈DNA。假設(shè)反應(yīng)體系中原來有a個(gè)模板DNA,最初10個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)生雙鏈DNA,后20個(gè)循環(huán)均只擴(kuò)增一條鏈,則需要限制性引物________個(gè)。因?yàn)殡p鏈DNA和單鏈DNA的________不同,可通過________將其分離。

答案：(210-1)a相對(duì)分子質(zhì)量(堿基數(shù)量) 電泳法

需要注意的是在不對(duì)稱PCR中,限制性引物與非限制性引物的最佳比例與模板鏈本身、引物的類型和長(zhǎng)度等因素都有密切的關(guān)系,需要多次摸索和優(yōu)化。

7.結(jié)語(yǔ)

本文所列六類擴(kuò)增技術(shù)在高中生物學(xué)考題中出現(xiàn)的頻率相對(duì)較高,隨著新高考試題對(duì)情境挖掘的深度和力度加大,以其他PCR技術(shù)為背景的考題肯定會(huì)陸續(xù)出現(xiàn)。

此外,各種PCR技術(shù)不是孤立的,它們均以常規(guī)PCR為基礎(chǔ),為實(shí)現(xiàn)特定目的而進(jìn)行了一定改進(jìn),但也有各自的局限性,因此在必要時(shí)可同時(shí)使用幾種擴(kuò)增技術(shù),如多重巢式PCR、反向?qū)崟r(shí)熒光定量PCR等。

在高考備考中,要關(guān)注不同擴(kuò)增技術(shù)的本質(zhì)差異,同時(shí)總結(jié)此類試題的解答步驟:一是尋找題圖有效信息,確定所考PCR類型;二是迅速再憶所考PCR的獨(dú)特性,猜測(cè)出題人可能的意圖;三是根據(jù)設(shè)問對(duì)前述猜測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證,并領(lǐng)悟出題人挖掘的新考點(diǎn),進(jìn)而對(duì)知識(shí)框架進(jìn)行完善。