李杰飛 孫彥輝 劉福生 金貴善 柴 奇 張紅波

(北京市神經(jīng)外科研究所腦腫瘤研究中心，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100050)

異常的甲基化和各種基因的失活在惡性腫瘤中很常見。甲基化的檢測(cè)方法有很多種，近些年臨床上常用的檢測(cè)方法是甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)法。本研究采用傳統(tǒng)MSP和巢式MSP兩種方法來檢測(cè)MGMT啟動(dòng)區(qū)甲基化的狀態(tài)，并采用免疫組織化學(xué)的結(jié)果作為兩種MSP法檢測(cè)結(jié)果的參考，比較這兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為以后臨床廣泛開展此項(xiàng)檢測(cè)和腦膠質(zhì)瘤患者化療方案的制訂提供較為可靠的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 腫瘤標(biāo)本的收集

隨機(jī)收集2009年4月至2010年3月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科收治的54例腦膠質(zhì)瘤患者的腫瘤標(biāo)本，其中男性28例，女性26例，年齡19～74歲，平均(46.2±14.40)歲。根據(jù)膠質(zhì)瘤分類分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［1］，星形細(xì)胞瘤7例，少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤2例，少枝-星形細(xì)胞瘤16例，間變性星形細(xì)胞瘤1例，間變性少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤2例，間變性少枝-星形細(xì)胞瘤3例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤23例。其中在38例膠質(zhì)瘤中獲得了腫瘤中心和周邊兩個(gè)不同部位的標(biāo)本，共獲得92份標(biāo)本，其中有77份標(biāo)本可以分成兩部分，一部分保存在液氮中，用于DNA提取，另一部分保存在10%的甲醛中，用于石蠟切片。另外15份標(biāo)本由于標(biāo)本量少，只檢測(cè)了MGMT啟動(dòng)區(qū)甲基化的狀態(tài)。

1.2 DNA提取和亞硫酸氫鹽的修飾

采用基因組DNA快速提取試劑盒(由北京金馳同信科技發(fā)展有限公司提供)提取DNA。用DNA甲基化修飾試劑盒(由北京天漠科技開發(fā)有限公司提供)對(duì)上述抽提的基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。

1.3 MGMT啟動(dòng)區(qū)甲基化狀態(tài)的檢測(cè)

分別采用傳統(tǒng)MSP和巢式MSP兩種方法對(duì)每份標(biāo)本的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)參考文獻(xiàn)［2-5］進(jìn)行引物的合成，詳見表1。

表1 甲基化特異性PCR引物Tab.1 Primer of methylation specific PCR

傳統(tǒng)MSP:甲基化引物為M-f和M-r，非甲基化引物為 U-f和 U-r。反應(yīng)體系 50 μL:模板 DNA 0.20 μg、10 μmol/L 引物各1.5 μL、ZymoTapTMPreMix 25 μL。反應(yīng)條件:95℃ 10 min，95℃ 30 s、各自退火溫度30 s、72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min，4℃保存。

巢式MSP:第一步PCR的引物為Pan-f和Pan-r，反應(yīng)體系5 0μL:模板DNA 0.20μg、1 0μmol/L引物各 1.5 μL、ZymoTapTMPreMix 25 μL。反應(yīng)條件:95 ℃10 min，95 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min，4℃保存;第一步的反應(yīng)產(chǎn)物稀釋50倍，取5 μL PCR產(chǎn)物用于第二步PCR擴(kuò)增。第二步PCR的引物同傳統(tǒng) MSP，反應(yīng)體系50 μL:模板DNA 5 μL、10 μmol/L引物各1.5 μL、ZymoTapTMPreMix 25 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、各自退火溫度15 s、72℃ 15 s，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min，4 ℃保存。

為保證檢測(cè)的可靠性，以正常外周血淋巴細(xì)胞DNA以及經(jīng)SssI甲基轉(zhuǎn)移酶(由美國New England Biolabs公司提供)處理過的正常外周血淋巴細(xì)胞DNA分別作非甲基化和甲基化的對(duì)照。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在含有溴化乙啶的4%瓊脂糖凝膠上電泳50 min，電壓5 V/cm，DNA Marker 20 bp為相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，用凝膠成像分析儀(WD-9413B，北京市六一儀器廠)觀察分析電泳結(jié)果。

結(jié)果判定:電泳結(jié)果中出現(xiàn)非甲基化條帶(U)擴(kuò)增，而不出現(xiàn)甲基化條帶(M)擴(kuò)增，判斷為非甲基化;僅M條帶或U和M條帶均出現(xiàn)擴(kuò)增，則判定為甲基化。詳見圖1。

1.4 免疫組化染色

MGMT的免疫組化染色采用DAB顯色法。一抗為MGMT兔抗人多克隆抗體(由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供)，抗體滴度為1∶200。結(jié)果判定:無著色細(xì)胞為陰性(－)，著色程度很弱不易判斷，或陽性細(xì)胞＜10%為可疑陽性(±)，陽性細(xì)胞數(shù)在10%～30%為陽性(+)，陽性細(xì)胞數(shù) ＞30%為強(qiáng)陽性(++)。詳見圖2。

圖1 MGMT啟動(dòng)區(qū)甲基化狀態(tài)的檢測(cè)Fig.1 Methylation specific PCR analysis of the MGMT promoter methylation status

圖2 MGMT在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)Fig.2 MGMT expression in glioma tissue(DAB，400×)

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，敏感率和陽性率的比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，MGMT啟動(dòng)區(qū)甲基化狀態(tài)與MGMT表達(dá)的相關(guān)分析采用Spearman秩和相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2種檢測(cè)方法敏感率的比較

在傳統(tǒng)MSP法檢測(cè)中，92份腫瘤標(biāo)本中獲得檢測(cè)結(jié)果的有56份，敏感率為60.9%，在巢式MSP檢測(cè)中獲得了所有標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果，敏感率為100%。配對(duì)樣本的卡方檢驗(yàn) χ2=34.03，P ＜0.05，兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表2。

表2 傳統(tǒng)MSP和巢式MSP敏感率的比較Tab.2 The comparison of sensitive rate analyzed by conventional MSP and nested MSP

2.2 2種檢測(cè)方法甲基化陽性率的比較

傳統(tǒng)MSP和巢式MSP都獲得檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)本有56份。在巢式 MSP法檢測(cè)的56份標(biāo)本中，46份MGMT啟動(dòng)區(qū)甲基化，10份MGMT啟動(dòng)區(qū)非甲基化，甲基化陽性率為82.1%;巢式MSP法檢測(cè)的同樣56份標(biāo)本中，39份MGMT啟動(dòng)區(qū)甲基化，17份MGMT啟動(dòng)區(qū)非甲基化，甲基化陽性率為69.6%。傳統(tǒng)MSP和巢式MSP檢測(cè)都為甲基化的標(biāo)本有39份，傳統(tǒng)MSP和巢式MSP檢測(cè)都為非甲基化的標(biāo)本有17份，傳統(tǒng)MSP檢測(cè)甲基化而巢式MSP檢測(cè)非甲基化的標(biāo)本有7份，傳統(tǒng)MSP檢測(cè)非甲基化而巢式MSP檢測(cè)甲基化的標(biāo)本不存在，配對(duì)樣本的卡方檢驗(yàn) χ2=5.14，P ＜0.05，兩種檢測(cè)方法陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表3。

表3 傳統(tǒng)MSP和巢式MSP甲基化陽性率的比較Tab.3 The comparison of methylated positive rate analyzed by conventional MSP and nested MSP

2.3 傳統(tǒng)MSP法檢測(cè)的甲基化狀態(tài)與蛋白表達(dá)的關(guān)系

傳統(tǒng)MSP和免疫組化都獲得檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)本有46份，其中在39份甲基化標(biāo)本中，23份MGMT蛋白表達(dá)陰性，在7份非甲基化標(biāo)本中，5份MGMT蛋白表達(dá)陽性。Spearman秩相關(guān)系數(shù) r= －0.255，P=0.087，根據(jù)這組數(shù)據(jù)尚不能認(rèn)為MGMT啟動(dòng)區(qū)甲基化狀態(tài)與其蛋白表達(dá)有相關(guān)性。詳見表4。

2.4 巢式MSP法檢測(cè)的甲基化狀態(tài)與蛋白表達(dá)的關(guān)系

巢式MSP和免疫組化都獲得檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)本有77份，其中在61份甲基化標(biāo)本中，39份MGMT蛋白表達(dá)陰性，在16份非甲基化標(biāo)本中，12份MGMT蛋白表達(dá)陽性。Spearman秩相關(guān)系數(shù)r=－0.318，P=0.005，MGMT啟動(dòng)區(qū)甲基化狀態(tài)與其蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。詳見表5。

表4 MGMT啟動(dòng)區(qū)甲基化狀態(tài)與蛋白表達(dá)的關(guān)系Tab.4 The correlation between MGMT promotor methylation status and its expression(conventional MSP)

表5 MGMT啟動(dòng)區(qū)甲基化狀態(tài)與蛋白表達(dá)的關(guān)系Tab.5 The correlation between MGMT promotor methylation status and its expression____________(nested MSP)

3 討論

MGMT啟動(dòng)區(qū)甲基化狀態(tài)的檢測(cè)對(duì)膠質(zhì)瘤患者術(shù)后化療方案的制訂和預(yù)后的判斷具有重要意義。甲基化的檢測(cè)方法主要有MSP法、甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶法和基因測(cè)序等方法?；驕y(cè)序法是一種可靠性及精確度均很高的方法，但需要大量的克隆測(cè)序，操作過程繁瑣且費(fèi)用昂貴，不適合廣泛應(yīng)用于臨床。目前臨床上最常用的是MSP法，MSP法有傳統(tǒng)MSP和巢式MSP兩種方法。本研究對(duì)比分析傳統(tǒng)MSP和巢式MSP兩種檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并采用免疫組化的結(jié)果作為兩種MSP檢測(cè)結(jié)果的參考，探討這兩種方法中更適合于臨床開展此項(xiàng)檢測(cè)的方法。

巢式MSP僅比傳統(tǒng)MSP多一次PCR循環(huán)，操作過程簡(jiǎn)便。在本實(shí)驗(yàn)中巢式MSP法檢測(cè)的敏感率為100%，傳統(tǒng) MSP法檢測(cè)的敏感率為 60.9%(χ2=34.03，P ＜0.05)。巢式 MSP 的敏感性高于傳統(tǒng)MSP。這是因?yàn)橛糜诩谆瘷z測(cè)的DNA是經(jīng)過亞硫酸氫鹽修飾的，絕大部分DNA模板被破壞，所以增加了傳統(tǒng)MSP擴(kuò)增的難度。而巢式MSP第一次擴(kuò)增是利用外引物從多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行特異性和非特異性擴(kuò)增，用于第二次擴(kuò)增的兩對(duì)引物(巢式引物)位于第一對(duì)引物的內(nèi)側(cè)，只能與第一次PCR產(chǎn)生的特異性產(chǎn)物互補(bǔ)，因此增加了檢測(cè)的敏感性，解決了模板破壞過多帶來擴(kuò)增困難的問題。因此從敏感性上說，巢式MSP更適于開展此項(xiàng)檢測(cè)。

根據(jù)傳統(tǒng)MSP檢測(cè)46份標(biāo)本的甲基化狀態(tài)與其表達(dá)的數(shù)據(jù)尚不能認(rèn)為MGMT啟動(dòng)區(qū)甲基化的狀態(tài)與其蛋白表達(dá)有相關(guān)性(r= －0.255，P=0.087)，而巢式MSP檢測(cè)77份標(biāo)本的甲基化狀態(tài)與其蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(r= －0.318，P=0.005)。又因?yàn)?MGMT的表達(dá)主要受其啟動(dòng)區(qū)甲基化狀態(tài)的調(diào)控，MGMT啟動(dòng)區(qū)甲基化，MGMT表達(dá)較少，MGMT啟動(dòng)區(qū)非甲基化，MGMT表達(dá)較多［6-7］。所以巢式MSP的檢測(cè)結(jié)果可能更接近真實(shí)情況。本實(shí)驗(yàn)巢式MSP檢測(cè)的甲基化陽性率為69.6%，傳統(tǒng)MSP檢測(cè)的甲基化陽性率為82.1%(χ2=5.14，P ＜0.05)。巢式 MSP 檢測(cè)的陽性率低于傳統(tǒng)MSP，因此可以認(rèn)為可能是巢式MSP減少了假陽性的發(fā)生，增加了檢測(cè)的特異性。另一方面從方法學(xué)上說，在外引物的設(shè)計(jì)上，巢式MSP使沒有轉(zhuǎn)化或部分轉(zhuǎn)化的DNA不能進(jìn)行擴(kuò)增，這樣就避免了在第二次擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)非特異性的結(jié)合［8］，從而增加了檢測(cè)的特異性。

MSP檢測(cè)的特異性還會(huì)受到引物二聚體的影響。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕驐l帶大小為81 bp和93 bp，二聚體的大小在40 bp左右，兩者相距比較近，引物二聚體的產(chǎn)生會(huì)增加假陽性的發(fā)生。在傳統(tǒng)MSP檢測(cè)中，二聚體的條帶比較明顯，而在巢式MSP中，通過減少巢式引物和增加模板等方法，可以明顯減少二聚體的產(chǎn)生。引物二聚體的出現(xiàn)從根本上說是引物自身的問題，因此解決這一問題最根本的辦法是重新設(shè)計(jì)引物。然而就MGMT引物的設(shè)計(jì)而言，它既要滿足PCR本身的要求，還要滿足甲基化檢測(cè)所需的條件。這樣在MGMT引物設(shè)計(jì)中，就存在可以形成二聚體的因素。另一方面，即使引物設(shè)計(jì)不存在引物之間的互補(bǔ)，仍然可能形成引物二聚體［9］。此時(shí)可以通過熱啟動(dòng)、適當(dāng)降低酶或引物濃度、加入適量的添加劑等方法來減少引物二聚體的形成［10］。巢式MSP在這方面明顯優(yōu)于傳統(tǒng)MSP，雖然不能完全消除引物二聚體，但較傳統(tǒng)MSP能明顯減少二聚體的產(chǎn)生，使結(jié)果的判讀更加準(zhǔn)確，增加了檢測(cè)的特異性。

電泳marker的選擇同樣也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判讀。本實(shí)驗(yàn)研究初期采用的是100 bp的marker，到后期采用的是20 bp的marker。在研究中發(fā)現(xiàn)，用100 bp的marker電泳結(jié)果為僅含目的條帶的PCR產(chǎn)物，再用20 bp的marker電泳時(shí)，出現(xiàn)了非特異性條帶(大小在40 bp左右)。所以在marker的選擇上，無論是傳統(tǒng)MSP還是巢式MSP最好選用20 bp或50 bp的marker，不建議使用100 bp的marker。因?yàn)槟康臈l帶大小為81 bp和93 bp，二聚體的大小在40 bp左右，兩者相距比較近，如果使用100 bp的marker，二聚體和目的條帶間沒有marker條帶，并且二聚體和目的條帶常?；煸谝黄鹦纬梢粋€(gè)較寬的條帶，在這種情況下，判定PCR的結(jié)果會(huì)容易出現(xiàn)偏差，會(huì)增加假陽性的發(fā)生。因此選擇合適的marker對(duì)增加檢測(cè)的特異性、準(zhǔn)確性有著重要的意義。

在PCR條件的優(yōu)化中，巢式MSP要好于傳統(tǒng)MSP。傳統(tǒng)MSP和巢式MSP在PCR擴(kuò)增中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)物電泳為陰性、產(chǎn)物電泳出現(xiàn)多條非特異性條帶(含目的基因條帶)和產(chǎn)物電泳出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象等情況。在巢式MSP中出現(xiàn)這3種情況時(shí)，筆者通過調(diào)整PCR的反應(yīng)溫度、引物或模板的用量等方法順利地得到了目的基因條帶。而在傳統(tǒng)MSP中出現(xiàn)這些情況時(shí)，很難通過上述方法得到目的基因條帶。這種實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:巢式MSP在PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化中有明顯的優(yōu)勢(shì)。

此外PCR酶的來源也很重要，不同來源的酶會(huì)影響結(jié)果的重復(fù)性。本實(shí)驗(yàn)初期采用的是普通PCR酶，PCR擴(kuò)增的重復(fù)性較差，改用專門用于甲基化的酶后問題得以解決，其PCR擴(kuò)增的效果優(yōu)于普通PCR酶。

總之，相對(duì)于傳統(tǒng)MSP，巢式MSP不僅能提高甲基化檢測(cè)的敏感性，而且能減少假陽性的發(fā)生，提高檢測(cè)的特異性。同時(shí)巢式MSP還可以通過減少引物二聚體的形成增加檢測(cè)的特異性。通過選擇合適的marker，兩種方法都可以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。巢式MSP是檢測(cè)MGMT啟動(dòng)區(qū)甲基化狀態(tài)的可靠方法，其檢測(cè)結(jié)果可以為腦膠質(zhì)瘤患者化療方案的制訂提供較為可靠的依據(jù)，并有助于判斷腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。

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