李 瑞，郭 楊，張樹武，蔣 瓊

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，蘭州 730000；2甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治重點實驗室，蘭州 730000）

0 引言

中草藥是一類具有藥用價值的重要植物資源。其中，冬蟲夏草、人參和靈芝等野生中藥材因稀有、獨特的藥理作用，在現(xiàn)代醫(yī)學中具有非常重要的地位，被廣泛應用于制藥、保健等領域。冬蟲夏草[1]是冬蟲夏草菌侵染蝙蝠蛾科幼蟲而形成的蟲菌復合體，也是青藏高原特有的珍貴生物資源，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、護肝腎等藥理作用[2]。人參[3]是五加科人參屬，多年生草本植物，具有較高藥用價值[4]，有調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、增強人體免疫力、抗腫瘤、抗疲勞和抗菌等作用[5]。靈芝[6]是多孔菌科靈芝屬，一般指赤芝或紫芝的干燥子實體[7]。靈芝子實體成熟時產(chǎn)生釋放出靈芝孢子[8]具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗糖尿等作用[7-8]。但這類中藥材目前人工種植難度較大，且人工種植難以成活或品質(zhì)較差，藥物來源仍舊以野生采摘入藥為主，因此此類野生藥材的采集處理和前處理方法較為重要。

隨著農(nóng)藥[9]產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，農(nóng)藥殘留問題日益嚴重，農(nóng)藥殘留漂移[10]、遷移[11]等現(xiàn)象的發(fā)生，野生植物資源[12]中存在農(nóng)藥殘留[13]的報道也逐漸增多。農(nóng)藥使用后的殘留問題造成野生資源品質(zhì)下降，并對野生中藥材資源的數(shù)量、區(qū)域分布、種間平衡等產(chǎn)生不同程度影響。農(nóng)藥殘留的漂移、遷移問題也正是中藥材體內(nèi)農(nóng)藥殘留成分超標的主要誘因，嚴重影響品質(zhì)質(zhì)量與使用安全[14]，因此對野生藥材中的農(nóng)藥殘留進行檢測分析是十分必要的。

樣品采集與預處理是農(nóng)藥殘留分析過程中的樣品前處理環(huán)節(jié)，采集方法和制備結果的標準化對后續(xù)試驗數(shù)據(jù)具有影響，研究規(guī)范化樣品采集與制備很有必要。筆者綜述冬蟲夏草、人參和靈芝3 種名貴中藥材樣品農(nóng)藥殘留分析的采集與制備方法，旨在進一步明確名貴中藥材的采集方法與樣品前處理過程的標準操作，為野生中藥材的農(nóng)藥殘留分析研究提供前期試驗基礎和依據(jù)。

1 名貴中藥材樣品采集

1.1 冬蟲夏草

冬蟲夏草是傳統(tǒng)的名貴滋補中藥材，具有廣泛的藥用價值，在中藥領域占有重要地位，且市場發(fā)展前景廣闊，需求量較大[15]。目前冬蟲夏草人工繁育技術不斷完善，該技術主要通過收集冬蟲夏草菌的分生孢子，人工接種到蝙蝠蛾幼蟲的蟲體上，將感菌的幼蟲在室內(nèi)模擬的高原環(huán)境條件下培育或適合冬蟲夏草生長的高海拔環(huán)境下培育，直至長出子座形成冬蟲夏草[16]。但在蟲體形狀、子座形狀等方面仍與野生品存在差異，人工繁育的冬蟲夏草蟲體大多呈現(xiàn)飽滿的圓柱形，子座形狀一般較為順直，容易斷裂[17]。此外產(chǎn)量低、成本高、繁育周期長、寄主蝠蛾生長易遭受病害侵襲等問題也尚未解決[16]。

野生冬蟲夏草的蟲體大多呈現(xiàn)圓柱形，子座一般是彎曲狀或扭曲狀，質(zhì)地較為柔韌。在營養(yǎng)價值方面，野生冬蟲夏草的蛋白質(zhì)含量和種類都優(yōu)于人工繁育品[18]，甘露醇和多糖的平均水平也是野生品優(yōu)于人工繁育品[19]。因此本研究涉及的冬蟲夏草來源還是以野外采集為主。

1.1.1 采樣地點 冬蟲夏草主要分布于西藏[20]、青海[21]、四川[22]、云南[23]和甘肅[24]等高海拔地區(qū)。其中西藏地區(qū)包括拉薩、那曲、昌都、山南、林芝、日喀則等，云南地區(qū)包括德欽、麗江、中甸、巧家、維西、寧蒗、東川、云龍、大理、貢山等，青海地區(qū)包括玉樹、果洛、海南、黃南、海東等，四川地區(qū)包括德陽、綿陽、北川、樂山、雅安、涼山、阿壩、甘孜等，甘肅地區(qū)包括甘南、臨夏、隴南等[25]。分布中心是青藏高原的那曲、玉樹、昌都等地[26]。

1.1.2 采樣時間 冬蟲夏草在每年農(nóng)歷4—5月高原（海拔3000～5200 m）積雪開始融化時進行采挖。此時冬蟲夏草菌的子座多暴露在雪地表面，出苗（種子發(fā)芽后成長的幼苗露出地表面）未超過3 cm，是采收的最適時期。采收時間過早，蟲草發(fā)育不成熟；采收時間過晚則積雪融化，周圍雜草遍布，難以尋找[27]。

1.1.3 采樣方法 冬蟲夏草入土很淺，通常使用寬3～5 cm、長不超過30 cm 的小尖鋤作為采集工具。采挖時，用鋤頭撬起冬蟲夏草近邊的草皮，輕提子座取出蟲草[27]。根據(jù)《冬蟲夏草采挖技術規(guī)程》(DB63/T 701—2008)規(guī)定采挖工具距離草頭約7 cm 左右，連同草皮挖9 cm 左右，再取出蟲草。采挖后，坑要填平、踩實，采挖產(chǎn)生的裸露面積不應該超過30～50 cm2。裸露的原植被放回原處，做到隨挖隨填。取出的蟲草應放入布袋內(nèi)暫存。然后將采集樣品用保鮮袋真空包裝，做好標記，并在24 h內(nèi)運送回實驗室。

建議根據(jù)冬蟲夏草生長海拔高度選擇樣方區(qū)域采樣，目前暫無相關文獻報道。該方法針對野外采樣效果更加合理，即在海拔高度3000～5200 m之間，平均分為4 個海拔高度區(qū)域，分別為3000～3550、3550～4100、4100～4650、4650～5200 m，在這4個區(qū)域內(nèi)采用隨機取樣的方式進行采樣。因野生冬蟲夏草生長分布不均勻，無法在某一標準區(qū)域內(nèi)規(guī)范化采收，為了取樣的均一性，需要劃定幾個大的分布區(qū)域，在該區(qū)域里進行隨機抽取，以達到取樣的科學標準。受自然條件的限制，冬蟲夏草采集過程中需嚴格控制采集的數(shù)量。冬蟲夏草屬于稀有保護物種，為防止對種群整體分布產(chǎn)生影響，不能過度采集，滿足研究條件即可，防止破壞種群生長。

1.2 人參

可以根據(jù)環(huán)境種植條件對人參進行分類。藥用人參分為野生人參[28]、林下山參[29]、移山參[30]和園參[31]等。其中野生人參主要指種子自然落地或被鳥獸傳播，在深山密林中沒有任何人為干擾的情況下自然發(fā)芽，長期自然生長的原生態(tài)人參，屬于國家一級保護植物[32]。林下山參指人工野外播種后，野生環(huán)境下自然生長而成，一般經(jīng)過15 年以上成株，存活率5%左右，且功效接近野生人參，在市場上常被標注為野山參進行銷售[33]。移山參是半自然半人工培育的人參，在采參時可以將小野山參或山參捻子移植到看護的山林中或人工的參園子里，也可以將人工種植的山參移植到野生環(huán)境條件下[33]。園參是人工栽培的品種，可分為山上栽參和平地栽參2種[34]。本研究探討的人參采集方法和預處理主要針對林下山參。

1.2.1 采樣地點 人參在中國吉林、遼寧和黑龍江三省東部的長白山脈、小興安嶺東南部、朝鮮半島北部和俄羅斯烏蘇里江流域等地區(qū)分布[32]。國內(nèi)林下山參主要分布在遼寧省和吉林省，主要產(chǎn)區(qū)是桓仁、集安等地，多集中在北緯40°—45°、海拔500～1000 m 的各種山地[32]。在采樣時根據(jù)其生長環(huán)境選擇合適的地點。

1.2.2 采樣時間 林下山參采收年限一般為15～20 年，若在20年后采收則品質(zhì)更好，可達到野生人參的藥用價值[35]。林下山參在每年7月下旬—8月上旬，秋季參葉變黃、越冬芽[36]長大之前進山挖掘為宜[37]。

1.2.3 采樣方法 根據(jù)《林下山參規(guī)范化生產(chǎn)標準操作規(guī)程（試行）》規(guī)定，選用鎬、鍬、軟質(zhì)小棍棒（如樹枝）、軟毛小刷等作為采收工具。以植株地上部分的面積確定參根部位挖掘的開盤位置，然后用板鎬在確定面積的四周擴散挖土，再由外向內(nèi)逐漸集中輕挖。以不傷參根為采集先決條件。采挖時，用樹棍先從植株基部清除近土，然后采用軟毛小刷沿須根、支根、主根，一根根小心刷去根須浮土，最后將參根取出，不損傷根系任何部位，保證參根的完整無缺。一般常用青苔、草皮或適量松軟的腐殖土，埋在藤筐等容器內(nèi)或將林下山參包好暫存，保護林下山參整體（包括參須）不受損害[37]。采集到的樣品集中后用保鮮袋真空包裝，做好標記，并在24 h內(nèi)運回實驗室進行處理。

因沒有相關采集方法的文獻報道，根據(jù)林下山參分布的地形特點，建議分層取樣，即在野外山林條件下以山頭作為選取區(qū)域的樣方總體，根據(jù)植被類型而進行分組，再從每組中隨機抽樣。因林下山參生長分布不均勻，無法在山林條件下規(guī)范化采收，所以需要劃定大的分布區(qū)域，在區(qū)域內(nèi)進行分組隨機抽取，以達到取樣的科學標準。受自然條件的限制，需嚴格控制林下山參采集的數(shù)量。林下山參屬于珍貴物種，為防止對種群整體分布產(chǎn)生影響，不能過度采集，滿足研究條件即可。

1.3 靈芝

靈芝子實體俗稱靈芝，靈芝孢子是靈芝的生殖細胞。靈芝子實體為一年生，屬木栓質(zhì)，由菌蓋和菌柄組成。靈芝孢子是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來極其細小的孢子顆粒，內(nèi)含靈芝全部遺傳活性物質(zhì)[8]。孢子顆粒具有重要藥理活性，是靈芝類保健產(chǎn)品的主要有效成分[38]。

1.3.1 采樣地點 野生靈芝一般生長在濕度高且光線昏暗山林中的腐樹或其根部[39]。靈芝分布于河北、山西、山東、江蘇、安徽、浙江、江西、福建、臺灣、湖南、海南、廣西、貴州、四川、吉林及云南等地[40]。采樣地點以這些地區(qū)為主。

1.3.2 采樣時間 靈芝一般在每年6—7 月進行采收[41]。當靈芝子實體菌蓋從白色生長圈消失開始，菌蓋不再增大，繼續(xù)增厚，邊緣由黃色變成棕褐色，菌蓋表面顏色一致，有少量孢子粉開始彈射，此時靈芝子實體已基本成熟[42]，可進行采收。

1.3.3 采樣方法 采收時，野生條件下生長的靈芝，用果樹剪從靈芝子實體的菌柄基部剪下，應盡量不觸摸碰撞菌蓋，以防孢子粉沾染掉落，再剪去過長的菌柄，清除菌蓋上的泥土和其他雜質(zhì)。保證靈芝子實體和孢子粉結構的完整。

人工栽培的靈芝，子實體采收與野生品種的操作基本相同，但孢子粉的收集方式不同。常用的孢子粉收集方法有培養(yǎng)架密封收集、套紙筒收集、小拱棚地膜收集、風機吸附收集[42]等，可選擇適宜的方法。將采集到的全部樣品用真空保鮮袋包裝，做好標記，并在24 h內(nèi)運送回實驗室。

建議根據(jù)靈芝生長方式的不同而選擇不同的采樣方法。野生條件下生長的靈芝有長在地上的，也有長在樹樁上的[43]。生長在地上的靈芝可以選擇分層取樣，即在野外山地條件下選取一定區(qū)域（參考區(qū)域大小1000 m×1000 m）作為樣方總體，將總體進行分組，再從每組中隨機抽樣。生長在樹樁上的靈芝可選擇分群取樣，以不同樹群作為取樣區(qū)域，在該區(qū)域內(nèi)隨機抽樣即可。野生靈芝生長分布不均勻，無法規(guī)范化采收，所以需要制定不同的取樣方法。受自然條件的限制，靈芝采集過程中，需嚴格控制采集的數(shù)量。靈芝屬于稀有保護物種，為防止對種群整體分布產(chǎn)生影響，不能過度采集，滿足研究條件即可。

2 樣品預處理

2.1 冬蟲夏草

樣品送至實驗室，將新鮮冬蟲夏草先做干燥預處理。當蟲體未干時，用鑷子除去附著在蟲體上的黃色蠟衣，再用刷子除去附著在蟲體上的浮土等雜質(zhì)，然后在干燥通風處陰干。待完全干燥后，將樣品統(tǒng)一收集管理，并粘貼標簽，記錄完整信息（采收名稱、采收時間、采收地點、采收人等）。也可將采集后的蟲草先清洗干凈，曬干至六七成再除去蟲體上多余的附著物及其他雜質(zhì)，最后陰干或低溫干燥[27]，待完全干燥后重復上述步驟。除傳統(tǒng)的干燥工藝外，真空冷凍干燥技術[44]也適用于冬蟲夏草的干燥預處理[45]，將采集的冬蟲夏草平鋪在凍干機的托盤中，低溫高真空條件下冷凍干燥96 h，至水分含量低于13%時即可收集[45]。水分含量的測定以《中國藥典》2015 年版四部中水分測定法（烘干法）進行操作[45]。

干燥后的冬蟲夏草可用研缽或打粉器粉碎，粉碎前后均記錄樣品質(zhì)量，計算損耗率，并將粉末全部過篩。過篩（50 目篩[46]、80 目篩[47]、100 目篩[48]）后稱重并充分混勻，封存于磨口的廣口瓶中，粘貼標簽記錄樣品的完整信息。

冬蟲夏草樣品有效成分萃取過程可以采用溶劑提取法、超聲波提取法、超臨界CO2萃取法和固相萃取法等技術。

2.1.1 溶劑提取法 溶劑提取法是利用物質(zhì)中各種成分在互不相溶的溶劑中其溶解度不同而將有效成分進行分離的一種方法[49-50]，也是常用的提取方法。保存的冬蟲夏草粉末適量稱取后加入蒸餾水水浴加熱，過濾后再加入水和甘油的混合液(V水:V甘油=1.0:21.5)，繼續(xù)水浴加熱提取，接著真空濃縮和離心，離心后取上清液并加入相同質(zhì)量的甘油，最后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，得到樣品中有效成分的提取物[51]，提取過程基本完成。

溶劑提取法作為樣品前處理過程中一種傳統(tǒng)的方法經(jīng)常被采用[52]，但其操作復雜、提取時間較長、效率較低、危害分析人員身體健康、污染環(huán)境[52]，需謹慎選擇。

2.1.2 超聲波提取法 超聲波提取是利用超聲波輻射產(chǎn)生的強烈空化效應、機械振動、高加速度、乳化擴散、擊碎和攪拌作用等多級效應，增大物質(zhì)分子運動頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而加速目標成分有效進入溶劑，促進提取的進行[53-54]。將保存的冬蟲夏草樣品粉末加入提取液后充分混勻，經(jīng)超聲和離心處理后取上清液，再繼續(xù)水浴加熱，加熱后過0.22 μm 水系濾膜過濾，最終取濾液即可[46]。超聲波提取法具有操作簡便、提取時間較短、提取適應性廣、分析速度較快、污染少環(huán)保等優(yōu)點[53-54]，在食品、藥品、工業(yè)原料和農(nóng)業(yè)環(huán)境等方面有良好的發(fā)展前景[52]。

2.1.3 超臨界CO2萃取法 超臨界CO2萃取法是由萃取和分離組合而成的一種新型的萃取分離技術[55]。保存的冬蟲夏草樣品加入到超臨界CO2萃取池中（壓力20 MPa，解析溫度40℃），經(jīng)過動態(tài)和靜態(tài)萃取后用干燥劑過夜處理，最后將濾除干燥劑的濾液用二氯甲烷定容到容量瓶中[47]即可。超臨界CO2萃取法適用性強、靈活性高、無污染、節(jié)約能源[56]、操作簡單、提取效率較高、精密度較高，是一種發(fā)展較快、應用較廣的物質(zhì)分離技術[52,57-58]。

2.1.4 固相萃取法 固相萃取法通過采用選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對樣品的不同成分進行分離，從而實現(xiàn)分離和富集目標化合物的目的[52,57]。將準確稱取的蟲草粉末加入離心管后用純水渦旋混勻浸泡，再用乙腈振蕩提取和氯化鈉劇烈搖晃離心，最后取上清液等待下一步凈化[48]。緊接著將萃取柱(Supelclean ENVI-18)放入固定架并轉移提取液至固相萃取小柱上，先用乙腈預洗后將收集的提取液和洗滌液在水浴中濃縮，再加正己烷復溶等待進一步凈化。將另一萃取柱(DSC-SiSPE)放入固定架上并加入無水硫酸鈉，以二氯甲烷-正己烷和正己烷溶液預洗，當去除淋洗液后加入正己烷提取液并用二氯甲烷-正己烷混合溶洗脫，收集洗脫液及水浴濃縮至凈干，再用正己烷溶液進行溶劑置換，重復1～2次后用正己烷定容[48,59-60]。

固相萃取法可以提高樣品的處理量、減少雜質(zhì)的干擾、回收率較高、重現(xiàn)性較好、精確度較高，是目前國內(nèi)農(nóng)藥殘留樣品前處理過程中的主流技術[52,57,61-62]，可選為珍貴中藥材樣品提取方法。

2.2 人參

樣品送達實驗室后，將采集到的林下山參用3～5 cm 寬的毛刷或柔軟牙刷在水里把林下山參的蘆、膀、體、須等4 個部位上的浮土淤泥等雜質(zhì)刷洗干凈，清潔干凈后參體呈白色或黃白色為宜，注意清洗過程不能破壞主根表皮部分[37]。將清洗完的林下山參進行切片，切片技術包括輥壓切片法和冷凍切片法等，待全部完成后，將樣品統(tǒng)一收集管理并粘貼標簽，記錄完整信息（采收名稱、采收時間、采收地點、采收人等）。除了切片操作外，林下山參也可進行粉碎處理。將清洗干凈的林下山參放在通風處陰干，干燥后的林下山參可用研缽、打粉器或超微粉碎技術粉碎，待完全粉碎后，重復上述收集管理步驟。

2.2.1 輥壓切片法 將清洗完的林下山參樣品進行陰干，使其含水量控制在10%～25%。再用小型輥壓機一次性輥壓處理（壓力控制在5～20 kg），輥壓后切成厚度為1.0～1.5 mm 薄片，最后干燥至含水量為3%～7%即可[63]。輥壓切片法通過輥壓整個參體，合理破壞其纖維組織結構，更有利于水浸泡后纖維組織被重新浸潤，藥材成分可以被高效浸出[63]。

2.2.2 冷凍切片法 冷凍切片法是利用低溫條件使樣品組織快速冷凍，并達到一定的硬度后進行切片的方法[64]。將清洗完的林下山參樣品通風陰干，含水量控制在5%～15%，然后在-20～-5℃下冷凍處理后切為厚度1.0～1.5 mm 的薄片，干燥至含水量為3%～7%即可[63]。冷凍切片法相比于其他方法更加快速方便，能很好地保留樣品組織中的抗原和酶活性，但也存在保存時間較短、無法進行回顧性研究等缺點[65]。

2.2.3 超微粉碎技術 超微粉碎技術是利用機械或流體動力的方法克服固體內(nèi)部凝聚力進行破碎，使樣品物料的直徑小于10μm，甚至達到1μm 的超微水平[66-67]。對林下山參樣品進行粉碎，需要將人參樣品烘干后置于破碎機中破碎，使其呈小塊狀，然后選用振動式超微粉碎機將其進行粉碎[68]。超微粉碎技術的特點是速度快、時間短、操作簡便、粒徑大小均等、利用率高等[69]，在中藥材粉碎技術中可廣泛應用。

2.3 靈芝

靈芝孢子粉和靈芝子實體分別需要進行干燥預處理。采集到的野生靈芝先用毛刷（或毛筆）將菌蓋及保鮮袋上的孢子粉輕輕刷入培養(yǎng)皿中，并晾干。再清除靈芝子實體上的泥沙雜質(zhì)，剪除附有的朽木，晾曬或在40～50℃烘箱中烘干[70]。待全部干燥后將樣品統(tǒng)一收集管理，并粘貼標簽，記錄完整信息（采收名稱、采收時間、采收地點、采收人等）。干燥的靈芝子實體可用研缽或打粉器粉碎，粉碎前后均記錄樣品質(zhì)量，計算損耗率，并將粉末全部過篩。過篩后稱重并充分混勻，封存于磨口的廣口瓶中，粘貼標簽記錄樣品的完整信息。干燥的靈芝孢子粉采用破壁技術進行處理，達到有效成分的合理運用與檢測。常用的破壁方法有機械法、物理法、化學法、生物法、綜合法等[71]，其中綜合法包括機械與物理、機械與生物或化學等組合方法[72]。根據(jù)樣品具體形態(tài)和要求選擇合適的細胞破壁方法。

2.3.1 機械破壁法

（1）超微粉碎孢子破壁法。該方法利用超微粉碎技術，借用機械或流體動力克服固體內(nèi)部凝聚力從而實現(xiàn)孢子破碎，破碎后樣品物料的直徑小于10 μm，甚至達到1 μm的超微水平[66-67]。超微粉碎技術可分為機械粉碎和化學合成粉碎，其中機械粉碎包括氣流式、高頻振動式、旋轉球（棒）磨式、錘擊式和自磨式，以及膠體磨和均質(zhì)機[67]。超微粉碎孢子破壁技術有利于增加有效物質(zhì)的溶出，提高生物利用度，增強藥用效果并節(jié)約資源，避免了環(huán)境污染[66,73]。目前，超微振動粉碎法是工業(yè)上靈芝孢子破壁的主要方法，氣流粉碎機也是近年來粉碎中藥材的重要方法之一[71]。

（2）擠壓膨化孢子破壁法。利用螺桿擠壓膨化的方式，通過壓力、剪切力、摩擦力、升溫等作用對物料進行處理，完成高溫高壓條件下靈芝孢子的細胞壁破壁，達到破壁的效果[74]，這種方法稱為擠壓膨化孢子破壁法。它將靈芝孢子與一定量的純凈水進行混合調(diào)配，待孢子充分濕潤后利用雙螺桿擠出機處理，使其保持濕潤狀態(tài)，再放入恒溫干燥箱內(nèi)干燥，并粉碎處理[75]。擠壓膨化孢子破壁法操作簡便，適合大量連續(xù)的孢子進行破壁處理，能效高、污染少。但操作過程中伴隨著壓力和溫度的升高，可能會造成個別靈芝孢子性質(zhì)的改變，影響其破壁效果[72,76]。

（3）超高壓超臨界流體撞擊流孢子破壁法。采用超臨界二氧化碳作為靈芝孢子破壁的工作流體，實現(xiàn)破壁的一種方法[71,77]。通過將超臨界二氧化碳作為撞擊粉碎過程中的載體，在超高壓的條件下，形成一個高壓、高速射流區(qū)，在此區(qū)域內(nèi)靈芝孢子相互碰撞、摩擦，產(chǎn)生的擠壓力和剪切力使孢子達到破壁的效果[77]。該方法的破壁效率較高，但由于靈芝孢子的質(zhì)量較小，撞擊的著力點難以找尋，所以可以結合其他方法共同完成靈芝孢子破壁[71]。

2.3.2 物理破壁法

（1）超聲波孢子破壁法。通過超聲波技術，引起靈芝孢子周圍溶液氣泡炸裂而產(chǎn)生的機械作用力使其達到破壁的效果[71]。超聲波孢子破壁法能夠縮短其破壁時間，但如果單獨使用超聲波破壁，容易產(chǎn)生局部高熱，而使孢子失活變性，降低破壁效率[72]。

（2）微波孢子破壁法。以輻射形式加熱的電磁波直接作用于孢子體內(nèi)的水分子，使其吸熱蒸發(fā)后的壓力破壞孢子的細胞壁[71]。用微波爐將靈芝孢子微波處理后加入到特制的振動磨中，并沖入氬氣，然后低溫震動粉碎即可[78]。微波孢子破壁法具有操作簡便、成本低、無污染等優(yōu)點，但也同樣容易造成孢子失活變性[71]。

（3）超低溫液氮脆化孢子破壁法。利用液氮的超低溫原理，將靈芝孢子快速凍結后再解凍，從而達到破壁的效果[79]。使用真空泵制取一定過冷的液氮，將過篩的靈芝孢子用滌綸布打包直接彈入過冷液氮中進行超快速凍結后并迅速取出，在恒溫水浴中解凍，解凍后的靈芝孢子于顯微鏡下直接觀察拍照并統(tǒng)計破壁率[79]。超低溫液氮脆化破壁法耗能較低、操作簡便、破壁效果較好，但作用時間相對較長[72]。

2.3.3 化學破壁法 使用化學溶劑提取靈芝孢子中的有效成分，或利用酸、堿等試劑降解其孢子的細胞壁結構[72]，多用于靈芝孢子破壁的前處理或孢子粉有效成分提取等?；瘜W破壁法的優(yōu)點是設備投入少、能量消耗低，缺點是提取或破壁時間相對較長，容易造成溶劑殘留等污染情況[72]。

2.3.4 生物破壁法

（1）酶解孢子破壁法。通過利用溶壁酶來破壞靈芝孢子的細胞壁達到破壁的效果[71-72]。將靈芝孢子粉配制成液體，再進行復水[80]。稀釋少量樣品并觀察細胞復水情況。用檸檬酸調(diào)制至pH 4.5，并添加溶壁酶。調(diào)制完的混合液恒溫攪拌，待酶解完成后按鈍酶處理。將酶解液預凍，取出后加水融化，再繼續(xù)冷凍。在凍融液中添加硅藻土，攪拌均勻后用醋酸纖維膜減壓過濾。然后在干燥塔中，經(jīng)過霧化器噴成霧狀與高溫熱風接觸后水分迅速蒸發(fā)，干燥成靈芝孢子粉[81]。酶解孢子破壁法的破壁效率較高，破壁效果明顯[72,82]。

（2）微生物孢子破壁法。微生物孢子破壁法先將靈芝孢子粉滅菌，再采用灰色鏈霉菌作為溶壁菌對靈芝孢子進行破壁處理。該方法可以最大程度保留靈芝孢子體內(nèi)的有效活性成分，更有利于人體吸收[72,83]。

2.3.5 綜合法

（1）變溫壓差脆化結合超微粉碎孢子破壁法。周萍等[84]利用變溫壓差脆化技術結合超微粉碎技術對靈芝孢子進行破壁處理，破壁率可達99%以上。以變溫壓差脆化技術作為樣品預處理，將保存的樣品放在變溫壓差脆化的罐中，保溫保壓一段時間后瞬間泄壓使樣品脆化，且在真空環(huán)境條件下脫水干燥，得到干燥的靈芝孢子[85]。接下來將脆化、干燥的靈芝孢子放入振動式超微粉碎機中進行粉碎處理，孢子破壁過程基本完成[84]。該方法可以提高孢子破壁的效率[86]。

（2）高壓冷凍孢子破壁法。吳鐵等[87]采用高壓滅菌法在121℃、維持30 min 條件下先對靈芝孢子進行高壓破壁，然后在烤箱中烘干，再放置到冰箱冷凍，取出后繼續(xù)烘干即可，靈芝孢子的破壁過程基本完成。高壓冷凍破壁法的破壁率可達到99%以上，提高了孢子的破壁效率[72]。

3 樣品保存方法

將制備的樣品用于試驗研究后，剩余的樣品放入密封干凈的容器中，貼好標簽（樣品名稱、制備時間、制備地點、剩余樣品質(zhì)量等）并保存。一般保留半年，時間不宜過長。冬蟲夏草剩余干燥粉末放置在磨口的廣口瓶中并于冰箱冷藏保存。林下山參剩余切片晾干后低溫干燥保存，林下山參干燥粉末也放置在磨口的廣口瓶中低溫保存。靈芝子實體剩余干燥粉末放置在磨口的廣口瓶中并于冰箱冷藏保存。破壁后的靈芝孢子粉應低溫、避光保存。

4 展望

文章通過整理冬蟲夏草、人參、靈芝3種名貴野生中藥材農(nóng)藥殘留檢測分析中樣品采集與制備的方法，歸納總結了其采樣、樣品前處理及樣品保存的具體過程。該操作簡單完整，可較大限度減少樣品的損耗，進一步完善野生中藥材農(nóng)藥殘留樣品預處理的方法。

目前，中藥材中農(nóng)藥殘留檢測樣品前處理過程，往往都是以萃取、凈化為主，根據(jù)樣品有效成分和性質(zhì)，通過改變其萃取、凈化條件而進一步優(yōu)化試驗方案。主要包括使用不同的有機溶劑，選擇不同的萃取方法（固相萃取、固相微萃取、液液微萃取、微波萃取、超臨界流體萃取等），縮短試驗時間和完善試驗步驟等，但萃取、凈化2 個試驗過程無法制定詳細具體的操作準則，不能完全保留試驗所需樣品的有效成分，造成樣品浪費及分析結果誤差，這是目前農(nóng)藥殘留檢測分析中面臨的問題。此外，中藥材采集也是藥材加工炮制的重要環(huán)節(jié)，針對其采集方法的研究也是按照中藥材的種類，分類討論其采集方法和注意事項，沒有具體實現(xiàn)某一藥材的采樣過程，是目前樣品采集與制備中存在的問題。因此，面對以上問題，現(xiàn)階段需要更多的研究人員關注中藥材樣品采集制備領域，通過更多實踐操作去總結開創(chuàng)新的采樣方法，并整理一套完整科學的樣品處理過程，未來可能不僅體現(xiàn)在中藥材上，也應展現(xiàn)在不同樣品種類中。最終，筆者選擇了中藥材中具有重要價值的3 種，結合大量文獻資料總結了相關農(nóng)藥殘留檢測分析中采樣及樣品前處理的方法。

王新風[88]通過整理蔬菜樣品相關資料，概括了農(nóng)藥殘留檢測分析中蔬菜樣品采集與制備的具體方法，依據(jù)不同種類的蔬菜樣品，總結了其采集數(shù)量和制備等標準。對于中藥材的樣品采集與制備來說，參考蔬菜樣品可以一定程度上應用相關的基本方法，例如在采樣數(shù)量和樣品運輸方面可以吸取經(jīng)驗，還有鮮樣制備方面去除多余殘留物等，對于特殊中藥材可以采取該方法，但具體樣品還需具體分析，在蔬菜樣品采樣方法的基礎上進一步細化樣品種類，爭取在中藥材樣品中創(chuàng)新制備過程，然后通過實際運用等改進或調(diào)整方案，以得到更加適合中藥材樣品的采樣方法，為中藥材樣品提供理論和技術指導。

采樣與制備方法的標準化不僅對農(nóng)藥殘留檢測分析工作具有價值，對樣品加工處理等環(huán)節(jié)也有重要作用，因此在未來還需探討和學習。