龔鈺雯，劉鳳聽(tīng)，伍淑婕，羅楊合，康 超

（1. 南寧學(xué)院食品與質(zhì)量工程學(xué)院，廣西南寧 530200；2. 廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；3. 賀州學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，廣西 賀州 542899）

0 引言

葡萄具有種植面積廣、品種豐富等特點(diǎn)，富含蛋白質(zhì)、糖、有機(jī)酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。葡萄的加工產(chǎn)品是國(guó)內(nèi)外一直研究的熱點(diǎn)。我國(guó)是最早釀造葡萄酒的國(guó)家之一。葡萄酒是用葡萄為原料破碎除梗后壓榨成葡萄汁，然后經(jīng)過(guò)發(fā)酵制成的酒精飲品。使用葡萄的特點(diǎn)一般為顆粒小、果皮厚、果肉少、多汁且濃縮、葡萄籽占比大、果皮有澀味[2]。隨著時(shí)代的進(jìn)步，人們對(duì)葡萄酒的風(fēng)味品質(zhì)要求越來(lái)越高，國(guó)外葡萄酒制作工藝成熟、風(fēng)味豐富，而國(guó)內(nèi)的葡萄酒產(chǎn)品和口味均比較單一，出現(xiàn)產(chǎn)品的同質(zhì)化現(xiàn)象[3]。因此，我國(guó)越來(lái)越多的技術(shù)都運(yùn)用在改善和提升葡萄酒口感風(fēng)味方面。在食品加工過(guò)程中，風(fēng)味物質(zhì)的添加是改善食品品質(zhì)和提高食品附加值的重要手段。目前，我國(guó)在葡萄酒加工中的風(fēng)味物質(zhì)添加主要集中在酯類(lèi)、醛類(lèi)和酮類(lèi)等。主要的風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)可分為呈香物質(zhì)和呈味物質(zhì)，呈香物質(zhì)主要包括萜烯類(lèi)、揮發(fā)酸、揮發(fā)酚，呈味物質(zhì)主要包括糖類(lèi)、酸類(lèi)、酚類(lèi)。發(fā)酵是整個(gè)葡萄酒制作工藝中最為關(guān)鍵的一步，決定了葡萄酒的色澤、口感和風(fēng)味。通過(guò)介紹葡萄酒的3 種不同的發(fā)酵技術(shù)，以及葡萄酒的風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)、作用及影響因素，為今后葡萄酒的口感和風(fēng)味的研究提供參考。

1 葡萄酒發(fā)酵技術(shù)

葡萄酒的發(fā)酵是多種微生物共同作用的結(jié)果，主要由酵母菌、細(xì)菌和霉菌三大類(lèi)所影響，酵母菌中的釀酒酵母是整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵。釀酒酵母具有較強(qiáng)的嗜殺性，在酵母細(xì)胞內(nèi)與其他微生物競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)，抑制其他微生物的生長(zhǎng)。釀酒酵母能產(chǎn)生很多酶，對(duì)葡萄中糖分、色素等物質(zhì)進(jìn)行分解，是一種能將糖轉(zhuǎn)化為酒精的產(chǎn)酒菌。不同的釀酒酵母種類(lèi)，所產(chǎn)的酒精含量也不同。釀酒酵母一般會(huì)在葡萄汁中繁殖2~3 d，在這個(gè)過(guò)程中不會(huì)將葡萄中原有的糖分完全轉(zhuǎn)化成酒精。抵御外界環(huán)境對(duì)葡萄酒發(fā)酵的影響；能產(chǎn)生硫化氫，其化合物是一種污染性物質(zhì)，會(huì)產(chǎn)生刺鼻氣味，對(duì)葡萄酒的風(fēng)味產(chǎn)生不良影響；具有絮凝性，用于葡萄酒的澄清；具有較高的耐受性，能順利進(jìn)行酒精發(fā)酵[4-5]。隨著時(shí)代的發(fā)展，葡萄酒的發(fā)酵技術(shù)逐漸變得豐富多樣，主要介紹以下3 種發(fā)酵技術(shù)。

1.1 固定化細(xì)胞技術(shù)

固定化細(xì)胞（Immobilized cell） 通常指采用物理、化學(xué)手段鎖定在一定載體空間范圍內(nèi)進(jìn)行生殖代謝的動(dòng)植物或微生物細(xì)胞[6]。固定化細(xì)胞技術(shù)常用于工業(yè)應(yīng)用，可在冷凍干燥、加工和儲(chǔ)存過(guò)程中保持細(xì)胞活力，并有高操作穩(wěn)定性、增強(qiáng)細(xì)胞活力、提高發(fā)酵生產(chǎn)率、細(xì)胞控制和細(xì)胞回收、應(yīng)用連續(xù)系統(tǒng)配置、提高最終產(chǎn)品質(zhì)量等優(yōu)點(diǎn)[7]。其中，在酒精發(fā)酵方面，應(yīng)用固定化細(xì)胞發(fā)酵可從組織中分離培養(yǎng)出大量的細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)、純化及鑒定，細(xì)胞純度高。而且，細(xì)胞制備過(guò)程中還可對(duì)其進(jìn)行分離培養(yǎng)，使細(xì)胞獲得了更多的生長(zhǎng)空間和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、促進(jìn)了其增殖與分化等功能；操作簡(jiǎn)便，細(xì)胞可以根據(jù)需要進(jìn)行包埋或包裹處理；抗雜菌能力增強(qiáng)、增加細(xì)胞濃度、提高酒精得率、提高設(shè)備利用率等特點(diǎn)[8]。張陽(yáng)等人[9]將目標(biāo)蛋白與釀酒酵母細(xì)胞壁蛋白融合，酵母表面會(huì)形成“真空層”，以此來(lái)削弱外界對(duì)BGL（β -葡萄糖苷酶） 的抑制作用，從而使葡萄酒的風(fēng)味更加復(fù)雜，香氣更加濃郁。Canonicl L 等人[10]用固定化M. pulcherrima菌株與釀酒酵母對(duì)比，發(fā)現(xiàn)固定后的菌株生產(chǎn)的乙醇含量低于未固定化的1.38%（V/V），并沒(méi)有出現(xiàn)負(fù)面影響，而由于風(fēng)味物質(zhì)的增加，葡萄酒的口感更加豐富。但在酒精發(fā)酵過(guò)程中也存在著某些問(wèn)題，如固定化載體結(jié)垢，是由于酒精發(fā)酵中雜質(zhì)增多，灰分增加，導(dǎo)致結(jié)垢；還容易雜菌污染，固定化細(xì)胞反復(fù)使用，導(dǎo)致酶活力降低，或是細(xì)胞載體存在死角，有雜菌存在[11]。雖然固定化細(xì)胞技術(shù)有一定的缺陷，然而利用固定化細(xì)胞技術(shù)制得的葡萄酒，除了保留葡萄的果香和營(yíng)養(yǎng)外，還具有醇厚的酒香味，從而受到很多消費(fèi)者的喜愛(ài)。

1.2 微氧化技術(shù)

微氧化技術(shù)是法國(guó)最早運(yùn)用在葡萄酒發(fā)酵上，在一定條件下，由于氧氣與其他氧化劑產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生過(guò)氧化氫等強(qiáng)氧物種和羥基自由基等強(qiáng)氧化性物質(zhì)，其反應(yīng)速度比常規(guī)工藝快數(shù)倍到幾十倍，具體是指將定量的氧氣送入高壓貯氣罐內(nèi)，通過(guò)中間的緩沖池將氧氣傳送到發(fā)酵罐中，其次通過(guò)陶瓷擴(kuò)散器將氧氣分散成細(xì)小的氣泡均勻地?cái)U(kuò)散到發(fā)酵罐中[12]。Dai Lingmin 等人[13]發(fā)現(xiàn)，微氧化（Mox） 可維持釀酒酵母群保持在一定的水平，提高酵母再M(fèi)ox 中的存活時(shí)間，可延緩自發(fā)MLF 的發(fā)生，并提及Mox 的主要目標(biāo)是加速葡萄酒化學(xué)成分的進(jìn)化，從而提高葡萄酒的品質(zhì)。氧氣的作用是改善酒的色澤，增強(qiáng)酒的風(fēng)味。有研究通過(guò)高劑量氧氣處理，發(fā)現(xiàn)葡萄酒中色相與藍(lán)黃成分顯著升高，同時(shí)也增加了錦葵素- 3 - 葡萄糖苷- 乙基黃烷-3 -醇加合物和吡喃花青素的濃度，這些色素比游離花青素更穩(wěn)定，它們的形成與葡萄酒顏色的穩(wěn)定有關(guān)。其中發(fā)酵過(guò)程中酚類(lèi)物質(zhì)與氧氣相互作用，影響葡萄酒的色、香、味。酚類(lèi)物質(zhì)在鐵離子的作用下轉(zhuǎn)換成醌類(lèi)，醌類(lèi)與酚類(lèi)進(jìn)一步反應(yīng)生成大分子褐色沉淀物，從而導(dǎo)致葡萄酒渾濁。花青素在微氧化過(guò)程中容易被氧氣氧化，使葡萄酒的色澤有所改變。單寧在微氧化過(guò)程中同樣被氧氣氧化，因此消耗了一定的氧氣，使花青素盡可能地減少氧化，保護(hù)了葡萄酒的顏色，減少苦澀感[14]。目前，國(guó)外對(duì)微氧化技術(shù)的研究比國(guó)內(nèi)偏多，因此國(guó)外葡萄酒的發(fā)酵技術(shù)比國(guó)內(nèi)成熟很多。

1.3 生物工程技術(shù)

生物工程技術(shù)在古代食品加工中就有運(yùn)用，現(xiàn)在也是非常重要的加工技術(shù)。生物工程技術(shù)是20 世紀(jì)70 年代末由日本的Horipoka 教授首先提出的，是利用基因技術(shù)對(duì)生物體進(jìn)行改造，使其能夠生產(chǎn)新的功能基因，從而使其能夠產(chǎn)生新的生物產(chǎn)品、藥物和化學(xué)品等的學(xué)科。其是指通過(guò)對(duì)生物體進(jìn)行人工干預(yù)以產(chǎn)生新的遺傳性能，并賦予新功能而進(jìn)行的一系列技術(shù)和工程[15]。生物工程技術(shù)主要是發(fā)酵工程、基因工程和酶工程這三大類(lèi)，葡萄酒的發(fā)酵主要應(yīng)用的使發(fā)酵工程技術(shù)。在葡萄酒蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵（MLF） 中，主要是利用發(fā)酵工程技術(shù)，是采用高菌密度的游離細(xì)胞能夠使MLF 快速啟動(dòng)并且使反應(yīng)進(jìn)程容易控制[16]，也是一種利用微生物的特殊功能來(lái)生產(chǎn)功能性的產(chǎn)品的技術(shù)，如可獲得苷酸和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。王曉勇[17]在堆積發(fā)酵與生物工程技術(shù)相結(jié)合時(shí)，汾酒的總酯含量有所提高，并且能優(yōu)化乙酸乙酯，提升汾酒的風(fēng)味口感。Gianvito Paola Di等人[18]通過(guò)BPCs（應(yīng)用基礎(chǔ)是接種微生物賦予生物保護(hù)活性的拮抗機(jī)制） 增加總滴定酸度和酯類(lèi)濃度，降低葡萄酒的pH 值，將VOCs 應(yīng)用到P.kluyveri酵母時(shí)，可觀察到葡萄酒的生物控制力受到了抑制，最終得出此拮抗機(jī)制對(duì)葡萄酒的質(zhì)量有所貢獻(xiàn)?，F(xiàn)在，生物工程技術(shù)已經(jīng)被運(yùn)用在葡萄酒的制作中，但其利用在葡萄酒的發(fā)酵方面研究還是較少，這也成為未來(lái)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。

2 葡萄酒的風(fēng)味

葡萄酒風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)、含量直接影響到葡萄酒的風(fēng)味口感。近年來(lái)，葡萄酒風(fēng)味物質(zhì)的研究是一個(gè)熱點(diǎn)，隨著生活質(zhì)量的提高，愛(ài)酒人士對(duì)葡萄酒的風(fēng)味物質(zhì)需求也逐漸增加，因此風(fēng)味物質(zhì)是衡量葡萄酒品質(zhì)的重要指標(biāo)，也是影響消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)的重要因素，復(fù)雜平衡的風(fēng)味有助于提高市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力[19]。葡萄的風(fēng)味物質(zhì)包括主要呈味物質(zhì)（糖類(lèi)、酸類(lèi)、酚類(lèi)） 和主要呈香物質(zhì)（萜烯類(lèi)、揮發(fā)酸類(lèi)、揮發(fā)酚類(lèi)）。

2.1 呈味物質(zhì)

葡萄酒中主要的呈味物質(zhì)包括糖類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)和酚類(lèi)。糖類(lèi)是葡萄酒發(fā)酵中的重要組分，占比為17%~25%，主要包括葡萄糖、果糖、戊糖、蔗糖和多糖等。其中，葡萄糖和果糖能被酵母菌轉(zhuǎn)換成酒精，是發(fā)酵過(guò)程中必不可少的糖類(lèi)。部分糖分可轉(zhuǎn)化成酯和酚酸類(lèi)等物質(zhì)，是形成葡萄酒特殊香氣的關(guān)鍵化合物，同時(shí)也對(duì)葡萄酒的風(fēng)味具有重要的影響。有機(jī)酸包括可揮發(fā)、不可揮發(fā)有機(jī)酸，不可揮發(fā)有機(jī)酸類(lèi)包括酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、檸檬酸、丙酮酸等，占比約為9%，其中蘋(píng)果酸和酒石酸占總體的90%以上[20]，乳酸、丙酮酸等主要在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生。酒石酸的酸味比較強(qiáng)，常用來(lái)提高原料酸度。蘋(píng)果酸需要乳酸菌進(jìn)一步將其轉(zhuǎn)化，含量較高時(shí)能讓葡萄酒擁有酸澀感，使葡萄酒的口感更加細(xì)膩[21]。有機(jī)酸和糖類(lèi)對(duì)葡萄酒的風(fēng)味都很重要，有機(jī)酸的含量雖然低于糖類(lèi)，但對(duì)葡萄酒的口感品質(zhì)影響更大。酚類(lèi)物質(zhì)是葡萄酒的重要組成之一，對(duì)葡萄酒的色澤、口感、風(fēng)味有一定的影響。酚類(lèi)物質(zhì)可分為黃酮類(lèi)和非黃酮類(lèi)，非黃酮類(lèi)在葡萄中主要物質(zhì)是酚酸，占比20%~25%，以游離形式存在；黃酮類(lèi)主要有兒茶素、單寧、白藜蘆醇、花青素等[22]。因此，酚類(lèi)物質(zhì)不僅能夠提升葡萄酒的風(fēng)味，還能夠預(yù)防癌癥、抗氧化等作用，在許多方面都有運(yùn)用[23]。

2.2 呈香物質(zhì)

葡萄酒中的呈香物質(zhì)主要有萜烯類(lèi)、揮發(fā)酸類(lèi)、揮發(fā)酚類(lèi)。萜烯類(lèi)主要是以異戊二烯為結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的烴類(lèi)化合物，是葡萄酒中重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)身體健康很有好處，不僅可以增強(qiáng)人體免疫力還具有抗菌的作用。其是以糖苷配基形式連接在β - D -葡萄糖上形成單糖苷，再進(jìn)一步與其他糖鍵合生成雙糖苷或三糖苷，而且其中鍵合態(tài)的糖苷只有轉(zhuǎn)化為游離態(tài)的香氣成分才能被人的器官所感知[24]。葡萄酒中的揮發(fā)酸主要有甲酸、乙酸、丙酸等，其中乙酸是揮發(fā)酸的主體部分，約占90%[25]。在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生大量的揮發(fā)酸，當(dāng)揮發(fā)酸含量過(guò)高時(shí)會(huì)產(chǎn)生異味，從而影響葡萄酒的風(fēng)味與口感[26]。揮發(fā)酚類(lèi)也是影響葡萄酒風(fēng)味重要的組成之一。當(dāng)酚類(lèi)物質(zhì)含量較高時(shí)，葡萄酒中會(huì)產(chǎn)生異味；含量較低時(shí)，對(duì)葡萄酒風(fēng)味有促進(jìn)作用[22]。

3 發(fā)酵技術(shù)對(duì)葡萄酒風(fēng)味的影響

影響葡萄酒風(fēng)味的影響因素有很多，如葡萄品種、環(huán)境因素（光照、氣候、土壤等）、發(fā)酵技術(shù)、貯藏方式等。發(fā)酵技術(shù)對(duì)葡萄酒的色澤、口感、品質(zhì)起著決定性的作用，并且不同的發(fā)酵技術(shù)影響葡萄酒不同的風(fēng)味。酵母菌在酒精發(fā)酵過(guò)程中將糖類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了酒精、CO2和其他物質(zhì)，與揮發(fā)性物質(zhì)及非揮發(fā)性物質(zhì)一起形成了葡萄酒特有的風(fēng)味。

固定化細(xì)胞技術(shù)通過(guò)構(gòu)建共固定化體系，使多種微生物協(xié)調(diào)共生，再通過(guò)發(fā)酵形成豐富的酶系和產(chǎn)物體系，避免了各種菌株因發(fā)酵而發(fā)生突變，從而提高葡萄酒的風(fēng)味和質(zhì)量。有研究表明，將酵母固定在FSS 上，固定化后酵母比普通酵母生產(chǎn)出的酒含有微量的糖和11.12%~11.24% （V/V） 的酒精，有更好的透明度，同時(shí)還產(chǎn)生了甲酸和豐富的琥珀酸，和FSS 中含有的乙酸，一起增加了葡萄酒的香氣。Carmen B 等人[27]發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母固定在橡木屑與纖維粉上，會(huì)顯著影響32 種揮發(fā)性物質(zhì)中的20 種（IOC 18-2007 發(fā)酵得到的葡萄酒） 和27 種（55A 發(fā)酵得到的葡萄酒） 的濃度；當(dāng)考慮揮發(fā)性化合物家族的總濃度時(shí)，固定化酵母中發(fā)現(xiàn)更多的酯類(lèi)和酒精，還有產(chǎn)生的丁酸乙酯、己酸、辛酸、異戊酸和1-丙醇，都能增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性。Anastasios N等人[28]運(yùn)用釀酒酵母凍干固定化Kefir 培養(yǎng)物，得出了固定化酵母會(huì)使發(fā)酵時(shí)間變短、乙醇生產(chǎn)率為55.3 g /（ld），而且乙醛和乙酸乙酯濃度處于較低水平，增加了葡萄酒的果味特征，使得葡萄酒的氣味增加；還在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了十六酸乙酯（糖果、草藥、辛辣氣味），辛酸、正癸酸以底氣味閾值限值而聞名，會(huì)影響到葡萄酒的風(fēng)味。

微氧化技術(shù)中的氧氣可以改善葡萄酒的色澤，其中酚類(lèi)物質(zhì)與氧氣結(jié)合生成醌類(lèi)，乙醇轉(zhuǎn)變?yōu)橐胰?，它們的產(chǎn)物會(huì)使葡萄酒變渾濁，之后生成的乙酸乙酯，也會(huì)影響葡萄酒的風(fēng)味。同時(shí)，單寧對(duì)葡萄酒中的苦澀感有影響，而在微氧過(guò)程中，葡萄酒中單寧容易被氧化，苦澀感下降。Yang Yi 等人[29]發(fā)現(xiàn)Mox 用量越大，SO2總濃度下降幅度越大，葡萄酒顏色的發(fā)展產(chǎn)生了負(fù)面影響；Mox 處理對(duì)單寧濃度沒(méi)有影響，然而在單寧成分方面發(fā)現(xiàn)，（-）-表兒茶素延伸單位、沒(méi)食子?；推骄鶈螌幘酆隙蕊@著升高，但（-）-表兒茶素末端單位和單寧三羥基化顯著降低，表明對(duì)澀味強(qiáng)度有長(zhǎng)期的負(fù)面影響。Zhang Z 等人[30]通過(guò)Mox 與傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)Mox處理后葡萄酒中的總酚、單寧、游離花青素含量低于傳統(tǒng)發(fā)酵，使其澀味減少，擁有更好的顏色穩(wěn)定性；但酯類(lèi)化合物沒(méi)有受到影響，苯甲醛增加19.9%~228%，雙乙酰增加15.6%~95.1%，最終發(fā)現(xiàn)Mox 處理會(huì)使葡萄酒中的干果味、花香味、堅(jiān)果味增強(qiáng)，動(dòng)物味減弱，也能去除綠色氣味，從而提高葡萄酒的品質(zhì)。

生物工程技術(shù)中的傳統(tǒng)發(fā)酵工藝難以控制葡萄酒發(fā)酵產(chǎn)物的穩(wěn)定性，而現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)會(huì)根據(jù)發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵產(chǎn)物的含量和酶的活性選擇特定的菌株或酶，不僅可以縮短發(fā)酵時(shí)間，提高發(fā)酵效率，還可有效避免細(xì)菌污染，保證發(fā)酵過(guò)程的穩(wěn)定和安全，并提升葡萄酒的整體風(fēng)味[31]。Ruiz-Mu?oz M等人[32]發(fā)現(xiàn)，非酵母菌在純培養(yǎng)物和基酒，以及僅含有乙醇和甘油作為碳源的培養(yǎng)基中，具有高的乙醇耐受性和生物活性，其中可提高5.5%~7.0%（V/V） 的耐受性，酵母菌株中的β -葡萄糖苷酶活性通過(guò)破壞糖苷鍵從非揮發(fā)前體中釋放萜烯和其他揮發(fā)性化合物，從而提高葡萄酒的風(fēng)味。

4 結(jié)語(yǔ)

雖然葡萄酒的發(fā)酵技術(shù)種類(lèi)豐富多樣，關(guān)于發(fā)酵技術(shù)的研究越來(lái)越多，但完全投入到葡萄酒工廠中的發(fā)酵技術(shù)仍單一。了解到葡萄酒發(fā)酵技術(shù)的研究進(jìn)展，有了新的研究方向：選擇不同品種的葡萄原料，提高葡萄酒的品質(zhì)；通過(guò)發(fā)酵技術(shù)來(lái)提升葡萄酒風(fēng)味和品質(zhì)的方向；研究不同的發(fā)酵技術(shù)提高葡萄酒的發(fā)酵效率，提升葡萄酒的風(fēng)味，進(jìn)一步研究討論，從而提高葡萄酒的質(zhì)量和品質(zhì)。