姬紅嬌，徐麗莉，丁文通，李培慧，王彥九，潘爽

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱（150001）；2.北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院第二門診部，北京（100101）

在牙髓再生的組織工程領(lǐng)域中，主要包括神經(jīng)再生、血管再生和牙本質(zhì)再生，其中血管再生是關(guān)鍵，建立豐富和瞬時(shí)的血液供應(yīng)對于牙髓組織的成功再生和長期生存是必要的［1］。牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）是牙髓再生的種子細(xì)胞［2-4］。內(nèi)皮細(xì)胞是組織再生過程中新血管形成的潛在來源［5］。本課題組前期研究結(jié)果表明，以1∶5 的比例直接共培養(yǎng)DPSCs 和人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），可促進(jìn)血管形成，但形成的管狀結(jié)構(gòu)6 h 后便發(fā)生分解［6］。文獻(xiàn)報(bào)道，在共培養(yǎng)體系中加入生長因子可促進(jìn)更多管狀結(jié)構(gòu)的形成和長期穩(wěn)定［7-8］。

干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF），又稱為Kit配體，是介導(dǎo)細(xì)胞血管形成和調(diào)節(jié)造血及其他生物過程的細(xì)胞因子［9-11］，相關(guān)研究及本課題組前期結(jié)果證實(shí)適宜濃度（100 ng/mL）的SCF 可分別提高DPSCs 和HUVECs 的遷移能力和管狀結(jié)構(gòu)形成能力［12-13］。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過將SCF 作用于共培養(yǎng)條件下的DPSCs 和HUVECs，探討其是否可以促進(jìn)穩(wěn)定血管結(jié)構(gòu)生成。

1 材料和方法

本實(shí)驗(yàn)已獲得哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1 主要試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)基（SH30022.01，Hyclone，美國）；ECM 培養(yǎng)基（1001，ScienCell，美國）；胎牛血清（10099-141，Gibco，美國）；青霉素-鏈霉素混合溶液（15140-122，Gibco，美國）；SCF 干細(xì)胞因子（AF-300-07，PeproTech，美國）；Matrigel基質(zhì)膠（356234，Corning，美國）；活細(xì)胞示蹤劑CM-DiI（40718ES60，翌圣，中國）；活細(xì)胞示蹤劑CMFDA（40721ES60，翌圣，中國）；一抗（鼠抗人）：CD31（3528s，CST，美國）；一抗（兔抗人）：CD34（GB111693，賽維爾，中國）；一抗（兔抗人）：血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）（WL03335，萬類，中國）；羊抗小鼠二抗（BA1050，博士德，中國）；羊抗兔二抗（BA1054，博士德，中國）。酶標(biāo)儀（Epoch，Biotek，美國），熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)（IX73，Olympus，日本），顯影儀（FluorChem FC3，ProteinSimple，美國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

HUVECs 購買自iCell（賽百慷，中國）。本實(shí)驗(yàn)所采用的DPSCs 均為經(jīng)過課題組鑒定后凍存的原代細(xì)胞，選取第3 ～7 代的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)［14］。實(shí) 驗(yàn) 分 組 分 別 為：HUVECs 組、SCF+HUVECs 組、DPSCs+HUVECs 組和SCF+DPSCs+HUVECs 組，SCF濃度為100 ng/mL，DPSCs 與HUVECs 按照1∶5 的比例接種于孔板中。

1.3 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖能力

0.25%胰酶分別消化HUVECs 和DPSCs，用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基或者混合培養(yǎng)液（ECM∶DMEM=1∶1）重懸將其調(diào)整為3×103個(gè)/孔的細(xì)胞懸液備用。每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，其中兩個(gè)復(fù)孔只加培養(yǎng)液作為空白對照，將各組細(xì)胞混勻后接種在4 個(gè)96 孔板中，分別培養(yǎng)1、3、5、7 d，每孔避光加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵箱避光孵育1 h，取出冷卻至室溫，用酶標(biāo)儀測定波長在450 nm 處每個(gè)孔的吸光度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測水平向遷移能力

胰酶分別消化HUVECs 和DPSCs，用混合培養(yǎng)液或ECM 重懸將其調(diào)整為3×105個(gè)/孔的細(xì)胞懸液，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，將各組細(xì)胞混勻后接種在6 孔板中。待細(xì)胞貼壁并鋪滿孔板后，使用200 μL槍頭垂直于孔板劃痕，然后用PBS 輕輕洗滌2 遍，洗去脫落的細(xì)胞，吸凈PBS 后在各組中加入含或不含SCF 的無血清培養(yǎng)液，放入37 ℃，5% CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在0、12、24 h 后放置在倒置顯微鏡下觀察拍照，圖像采集后用Image J 軟件檢測劃痕面積，計(jì)算各組細(xì)胞12、24 h 的愈合面積百分比，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測HUVECs 垂直向遷移能力

先用胰酶消化DPSCs，用混合培養(yǎng)液將其重懸為4×103個(gè)/孔的細(xì)胞懸液，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，按照分組設(shè)置分別在24 孔板下室中加入500 μL 含或不含SCF的培養(yǎng)液。然后用胰酶消化HUVECs，無血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基將其制備成2×104個(gè)/孔的細(xì)胞懸液，均勻接種于上室中，將24 孔板置于孵箱中培養(yǎng)48 h。孵育完成后，于各孔上下室加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS 沖洗3 遍后加入0.1%結(jié)晶紫染色30 min，用干凈的棉簽輕輕擦去上室未穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞，將上室放于顯微鏡下隨機(jī)取5 個(gè)視野觀察并拍照計(jì)數(shù)。

1.6 體外基質(zhì)膠管形成實(shí)驗(yàn)檢測血管形成能力

將所需基質(zhì)膠插入冰盒，置于4 ℃冰箱過夜備用。向經(jīng)過預(yù)冷處理的96 孔板中加入60 μL/孔基質(zhì)膠，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，放入37 ℃孵箱預(yù)凝膠化30 min。在此期間，用胰酶分別消化HUVECs 和DPSCs，按照分組要求向鋪膠的孔板內(nèi)每孔加入100 μL 含1.2×104個(gè)細(xì)胞的懸液。完成上述操作后，將孔板置于37 ℃孵箱中培養(yǎng)，分別在第3、6、9、12 h 后，于顯微鏡下觀察并拍照記錄管狀結(jié)構(gòu)的形成情況，使用Image J 軟件量化各組管狀結(jié)構(gòu)的分支數(shù)量和分支總長度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。此外，將用細(xì)胞示蹤劑CMFDA 標(biāo)記的DPSCs、CM-DiI 標(biāo)記的HUVECs 按照1：5 的比例接種于凝膠化的Matrigel 基質(zhì)膠上，用于觀察兩種細(xì)胞的分布情況。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測VEGFA 的濃度

采用雙抗體夾心ELISA法檢測上清液中VEGFA的濃度。依照分組將3×105個(gè)/孔的細(xì)胞懸液均勻接種于6 孔板中，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)3 d。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液后在4 ℃，1 000×g 條件下離心20 min，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片，取上清加入抗人VEGFA 抗體包被的酶標(biāo)板上進(jìn)行檢測。用酶標(biāo)儀在450 nm 波 長 處 測OD 值，VEGFA 濃 度 與OD450值之間成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中VEGFA 的濃度。

1.8 Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測成血管相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

Western blot 檢測不同分組的細(xì)胞中CD31、CD34 和VEGFA 蛋白表達(dá)情況。按照分組將3×105個(gè)/孔的細(xì)胞懸液均勻接種于6 孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后72 h 加入細(xì)胞裂解液（RIPA∶PMSF＝100∶1），分組收集于EP 管中超聲裂解，離心后提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白濃度測定。用10%Tris-甘氨酸SDS 聚丙烯氨酸凝膠電泳后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%封閉蛋白粉室溫封閉2 h，4 ℃冰箱過夜孵育一抗CD31（1∶1 000）、CD34（1∶1 000）、VEGFA（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）。取出洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h，使用超敏ECL發(fā)光試劑盒，F(xiàn)C3 顯影儀檢測顯影，圖像采用ImageJ 軟件進(jìn)行灰度值分析，GAPDH 為內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DPSCs 與HUVECs 共培養(yǎng)可提高細(xì)胞的增殖能力

CCK-8 增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖1），第1、5、7 天DPSCs+HUVECs 組的細(xì)胞增殖能力高于HUVECs組（P＜0.05），SCF+DPSCs+HUVECs 組在第5 天時(shí)增殖能力顯著優(yōu)于HUVCs 和SCF+HUVECs 組（P＜0.001，P= 0.001），第7 天時(shí)SCF+DPSCs+HUVECs組增殖能力依舊高于HUVCs 和SCF+HUVECs 組（P= 0.003，P= 0.003），但加或不加SCF 組間無顯著差異（P= 0.999，P= 0.892）。

Figure 1 The proliferative ability of the cells was measured by the CCK-8 assay圖1 CCK-8 法檢測細(xì)胞的增殖能力

2.2 SCF 促進(jìn)共培養(yǎng)的DPSCs 和HUVECs 劃痕愈合

為檢測SCF 和DPSCs 與HUVECs 直接共培養(yǎng)時(shí)，對各組細(xì)胞遷移能力的影響，進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。首先，于顯微鏡下對0、12、24 h 各組細(xì)胞的遷移情況拍照觀察（圖2a）。劃痕實(shí)驗(yàn)的量化結(jié)果顯示12、24 h 后，相較于其他三組，SCF +DPSCs+HUVECs 組的細(xì)胞向劃痕處遷移明顯（HUVECs 組vs.SCF +DPSCs+HUVECs 組，12 h：P＜0.001，24 h：P＜0.001；SCF+HUVECs 組vs.SCF +DPSCs+HUVECs 組，12 h：P= 0.001，24 h：P＜0.001；DPSCs+HUVECs 組vs.SCF +DPSCs+HUVECs 組，12 h：P=0.029，24 h：P＜0.001），DPSCs+HUVECs 組劃痕愈合面積百分比大于HUVECs 組（12 h：P= 0.003，24 h：P＜0.001)。24 h，SCF+HUVECs 組的愈合面積百分比大于HUVECs 組（P＜0.001）（圖2b）。

Figure 2 Effect of SCF on migration capacity of DPSCs and HUVECs under direct coculture conditions圖2 SCF 對DPSCs 和HUVECs 直接共培養(yǎng)條件下遷移能力的影響

2.3 SCF 和DPSCs 促進(jìn)HUVECs 遷移

為檢測SCF 和DPSCs 與HUVECs 間接共培養(yǎng)時(shí)，二者對HUVECs 遷移能力的影響，進(jìn)行了Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)。圖3a 是48 h 后各組具有代表性的遷移圖像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與下室只加入培養(yǎng)液的對照組相比，單獨(dú)加入SCF 或DPSCs 組可誘導(dǎo)上室HUVECs 的遷移（P＜0.001），當(dāng)SCF 和DPSCs 共同作用時(shí)，HUVECs 的遷移數(shù)量顯著多于二者單獨(dú)使用時(shí)（P＜0.001）（圖3b）。

Figure 3 Effect of SCF and DPSCs on HUVECs migration capacity圖3 SCF 和DPSCs 對HUVECs 遷移能力的影響

2.4 SCF 作用于共培養(yǎng)的DPSCs 和HUVECs 促進(jìn)管狀結(jié)構(gòu)的形成

體外基質(zhì)膠管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果中顯示，3 h 各組開始形成小管樣結(jié)構(gòu)，6、9、12 h 管狀結(jié)構(gòu)進(jìn)一步成熟穩(wěn)定，管腔直徑增加（圖4a）。SCF+DPSCs+HUVECs 組與其他組相比，形成的小管樣結(jié)構(gòu)分支數(shù)目多，分支的總長度也相對較長。通過對4 個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)管狀結(jié)構(gòu)分支的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（圖4b），結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCF+HUVECs 組和DPSCs+HUVECs組分支數(shù)目高于HUVECs 組（HUVECs 組vs.SCF +HUVECs 組，3 h：P＜0.001，6 h：P= 0.002，9 h：P=0.017，12 h：P= 0.021；HUVECs 組vs.DPSCs+HUVECs 組，3 h：P＜0.001，6 h：P＜0.001，9 h：P=0.001，12 h：P= 0.001），SCF+DPSCs+HUVECs 組管狀結(jié)構(gòu)的數(shù)目高于其他三組（P＜0.001）。從對各組管狀結(jié)構(gòu)分支總長度的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果中（圖4c）發(fā)現(xiàn)，管狀結(jié)構(gòu)形成的12 h 后，SCF+DPSCs+HUVECs 組分支總長度顯著高于其他三組（HUVECs組vs.SCF +DPSCs+HUVECs 組，P＜0.001；SCF+HUVECs組vs.SCF+DPSCs+HUVECs組，P＜0.000 1；DPSCs+HUVECs 組vs.SCF +DPSCs+HUVECs 組，P= 0.001）。

Figure 4 Effect of SCF on the vascular formation capacity of cocultured DPSCs and HUVECs圖4 SCF 對共培養(yǎng)的DPSCs和HUVECs 成血管能力的影響

雖然SCF 和DPSCs 單獨(dú)與HUVECs 培養(yǎng)也可促進(jìn)管狀結(jié)構(gòu)的形成，但促進(jìn)效果低于SCF 作用于共培養(yǎng)的DPSCs 和HUVECs 的情況。將活細(xì)胞示蹤劑CMFDA 標(biāo)記的DPSCs（綠色熒光）、CM-DiI 標(biāo)記的HUVECs（紅色熒光）按照1∶5 的比例接種于凝膠化的Matrigel 基質(zhì)膠上，分別在3、9 h 于熒光顯微鏡下拍照，用于觀察兩種細(xì)胞的分布變化情況。在3 h，DPSCs 多分布于管狀結(jié)構(gòu)交叉點(diǎn)處，隨著小管的進(jìn)一步成熟穩(wěn)定，到9 h，DPSCs 會慢慢由交叉點(diǎn)處向分支上轉(zhuǎn)移，發(fā)揮周細(xì)胞樣細(xì)胞的功能，維持管狀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定（圖4d）。

2.5 SCF 促進(jìn)DPSCs 和HUVECs 共培養(yǎng)組中血管生成相關(guān)蛋白的表達(dá)

ELISA 結(jié)果顯示，經(jīng)100 ng/mL SCF 處理的DPSCs 和HUVECs 共培養(yǎng)組上清液中VEGFA 的濃度高于其他三組（P＜0.001），DPSCs+HUVECs 組的VEGFA 濃度也顯著高于HUVECs 單獨(dú)培養(yǎng)組（P＜0.001）（圖5a）。通 過Western blot 檢 測CD31、CD34 和VEGFA 這三種血管生成相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。SCF+DPSCs+HUVECs 組血管生成相關(guān)蛋白的表達(dá)量多于其他三組（圖5b）。與HUVECs 組相比，SCF+HUVECs 組、DPSCs+HUVECs 組 和SCF+DPSCs+HUVECs 組中CD31 的表達(dá)水平均有所提高（P＜0.001），SCF+DPSCs+HUVECs 組 中CD34 和VEGFA 的表達(dá)水平高于SCF+HUVECs 組和DPSCs+HUVECs 組（P＜0.001，P＜0.001）（圖5c）。因此，與對照組相比，單獨(dú)使用SCF 或DPSCs 作用于HUVECs，也可促進(jìn)成血管相關(guān)蛋白表達(dá)水平的提高，但作用不如二者共同作用時(shí)明顯。

Figure 5 Effect of SCF on angiogenesis-related proteins expression of cocultured DPSCs and HUVECs圖5 SCF 對共培養(yǎng)的DPSCs 和HUVECs 血管形成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

牙髓是一種發(fā)育成熟的非礦化牙體組織，僅通過牙體硬組織包繞形成的狹窄根尖孔與根尖周組織建立聯(lián)系，當(dāng)其暴露于機(jī)械創(chuàng)傷和致齲環(huán)境中時(shí)會導(dǎo)致根管內(nèi)或根尖周組織的感染［15］。在牙髓再生中，根尖孔的存在限制了宿主向整個(gè)根管系統(tǒng)供血的能力，為了彌補(bǔ)這一局限性，潛在實(shí)驗(yàn)策略是將干細(xì)胞與能夠誘導(dǎo)血管生成的生長因子協(xié)同應(yīng)用，從而促進(jìn)更多牙髓血管的生成［16］。

DPSCs 被認(rèn)為是牙髓再生的重要細(xì)胞來源［17］，主要通過兩種方式誘導(dǎo)牙髓血管的生成。一種方式是DPSCs 和內(nèi)皮細(xì)胞通過旁分泌途徑分泌促血管生成因子，從而增強(qiáng)細(xì)胞的增殖遷移和管形成能力［18-20］。Kim 等［21］證明DPSCs 與HUVECs聯(lián)合使用可顯著增加后肢缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭形⒀艿臄?shù)量，且DPSCs 分泌的VEGF 能夠促進(jìn)HUVECs的增殖和新血管的形成。本實(shí)驗(yàn)中，DPSCs 和HUVECs 共培養(yǎng)組與單獨(dú)的HUVECs 相比，細(xì)胞的增殖、遷移能力以及管狀結(jié)構(gòu)形成能力均顯著增加。另一種方式是DPSCs 利用其多向分化潛能分化為周細(xì)胞樣細(xì)胞直接參與管狀結(jié)構(gòu)的形成［22-23］。據(jù)報(bào)道，DPSCs 表達(dá)周細(xì)胞標(biāo)記物，并且在與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)血管生成模型中穩(wěn)定形成的管狀結(jié)構(gòu)［24］。本研究使用活細(xì)胞示蹤劑分別對DPSCs 和HUVECs 進(jìn)行標(biāo)記，通過熒光顯微鏡拍照觀察共培養(yǎng)組細(xì)胞在3 h 和9 h 的細(xì)胞分布動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)DPSCs 由管狀結(jié)構(gòu)的節(jié)點(diǎn)向分支方向轉(zhuǎn)移，包繞在管腔周圍，依附于HUVECs 類似周細(xì)胞樣細(xì)胞，穩(wěn)定管狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，DPSCs 代表了周細(xì)胞的有效來源，適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件可以產(chǎn)生具有穩(wěn)定血管和促進(jìn)血管成熟能力的群體。

SCF 既可以發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞血管形成的作用，也可以誘導(dǎo)干細(xì)胞的自我更新、遷移和存活［25-26］。本研究中，SCF 明顯促進(jìn)了HUVECs 的遷移，使其形成更多的血管樣結(jié)構(gòu)。Cucco 等［27］發(fā)現(xiàn)DPSCs 表達(dá)SCF 和CD117，證實(shí)了SCF 信號通路可通過CD117 調(diào)控DPSCs 中Bmi-1 基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)DPSCs 的自我更新。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)SCF 作用于共培養(yǎng)的DPSCs 與HUVECs 時(shí)，遷移能力和成管能力顯著高于其他組，同時(shí)對血管生成標(biāo)志物的檢測結(jié)果表明，SCF+DPSCs+HUVECs 組中CD31、CD34和VEGFA 三種蛋白的表達(dá)水平最高，即SCF 的應(yīng)用可進(jìn)一步促進(jìn)DPSCs 和HUVECs 成血管相關(guān)蛋白表達(dá)的增加，提高細(xì)胞的血管形成能力。

SCF 作用于共培養(yǎng)的DPSCs 和HUVECs 時(shí)，形成的管狀結(jié)構(gòu)的數(shù)目更多且更加穩(wěn)定，血管形成相關(guān)蛋白的表達(dá)水平也較高，即SCF 可促進(jìn)共培養(yǎng)DPSCs 和HUVECs 的遷移，增強(qiáng)細(xì)胞的血管形成能力。下一步的目標(biāo)是研究此過程中涉及的成血管的具體信號通路和作用機(jī)制，以及如何在體內(nèi)應(yīng)用形成富含血管樣結(jié)構(gòu)的牙髓組織，從而成功實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化。

【Author contributions】Ji HJ performed the experiment, analyzed the data and wrote the article.Xu LL, Ding WT , Li PH and Wang YJ performed the experiment, analyzed the data and revised the article.Pan S designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.