楊雨清 姚瓊璐 徐濤濤*

創(chuàng)傷后骨關節(jié)炎（post-traumatic osteoarthritis，PTOA）是由前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）斷裂等急性機械損傷引起的以關節(jié)軟骨退變?yōu)橹饕±碜兓囊环N疾病，通常表現(xiàn)為關節(jié)疼痛以及活動功能障礙，可產生重大的社會和經(jīng)濟影響。最初的機械組織損傷以及隨后的炎癥反應是驅動PTOA 發(fā)生發(fā)展的重要因素，其機制目前尚未明確。研究發(fā)現(xiàn)機械損傷可對軟骨細胞產生重要影響，其中對其線粒體功能的改變可引起軟骨細胞能量代謝障礙、活性氧堆積，促使軟骨細胞釋放炎癥介質，造成軟骨退化，最終導致PTOA的發(fā)生。基于軟骨細胞線粒體可能在創(chuàng)傷后炎癥中發(fā)揮重要作用，軟骨細胞線粒體逐漸成為PTOA 防治研究的主要靶標之一。本文綜述軟骨細胞線粒體在PTOA 中的研究進展。

1 生理狀況下線粒體的功能及其在軟骨中的作用

線粒體以產生ATP 的形式為軟骨細胞的活動及軟骨細胞周期控制提供能量，同時，線粒體也是整合多種先天免疫信號通路的分子平臺。軟骨由軟骨細胞以及細胞外基質（extracellular matrix，ECM）組成，ECM 在軟骨細胞周圍大量存在，可產生ECM 蛋白酶，ECM 蛋白酶的活化是加速PTOA的關鍵因素，通常降解和分解軟骨是纖維ECM 蛋白［1］。線粒體調控ECM 中相關的蛋白酶產生及分解，有助于維持ECM的穩(wěn)態(tài)。在軟骨細胞中，線粒體是軟骨細胞中重要的代謝中心，軟骨細胞通過加強線粒體呼吸提高三羧酸循環(huán)效率，促進細胞外基質的生物合成［2］。

線粒體不僅有助于維持ECM 的穩(wěn)態(tài)，還調控軟骨細胞的生成、增殖、分化和衰老。線粒體自噬促進骨髓間充質干細胞的成軟骨分化［3］，而成軟骨細胞可進一步生成軟骨細胞。線粒體通過分配鈣、ATP 和活性氧以滿足軟骨細胞的需求，并幫助軟骨細胞克服代謝和微環(huán)境造成的壓力，實現(xiàn)軟骨細胞的增殖。當線粒體膜電位顯著下降時，軟骨細胞分化標志基因表達水平下調［4］，表明線粒體膜電位與軟骨細胞分化存在密切聯(lián)系。線粒體細胞膜電位損失會發(fā)生能量產生減少、膜通透性增加，最終導致各種凋亡誘導因子從線粒體釋放進入軟骨細胞基質［5］，引起軟骨細胞的衰老和凋亡。

2 PTOA狀態(tài)下軟骨細胞線粒體的作用和變化

軟骨細胞受到機械損傷后發(fā)生的一系列病理變化可分為3 期，分別為急性損傷期、炎癥期、慢性退化期。軟骨細胞首先進入PTOA 急性損傷期。急性損傷后會造成線粒體功能障礙，隨后ROS 產生增多［6］，激活NLRP3 炎癥小體引發(fā)炎癥反應［7］，此階段可視為PTOA 的炎癥期。繼而軟骨因急性損傷和線粒體功能障礙而發(fā)生退變，這可視為PTOA 的慢性退化期。軟骨細胞線粒體在急性損傷期、炎癥期及慢性退化期均起到重要作用。

3 線粒體的功能障礙對PTOA發(fā)病機制的影響

3.1 軟骨細胞線粒體與急性機械損傷 機械力的影響下，線粒體的生物學特征發(fā)生一定的變化。單向循環(huán)拉伸研究表明機械力使線粒體發(fā)生腫脹。單向循環(huán)拉伸后機械力使細胞發(fā)生損傷，Ca2+通道被激活，細胞發(fā)生急速的鈣緩沖，細胞內Ca2+急劇上升，由于細胞膜通透性增大，細胞質基質內流入Ca2+，并迅速將Ca2+隔離在線粒體內，線粒體即發(fā)生腫脹［8］，后續(xù)線粒體呼吸功能受損，出現(xiàn)線粒體基質破壞、線粒體膜去極化等現(xiàn)象。最近一項研究報道表明機械力可激活一種高水平的鈣通道Piezo1［9］。機械壓力刺激下，軟骨細胞膜膽固醇結構被破壞，這直接導致Piezo1 通道的機械激活［10］。激活的Piezo1 可以促進鈣內流，線粒體腫脹，隨后發(fā)生功能障礙。另一個鈣內流通道TRPV4 被證明參與機械刺激及隨后的氧化應激反應［11］。機械力使TRPV4 離子通道激活后，線粒體基質降解酶（包括MMP 和ADAMTS）和去整合素金屬蛋白酶（ADAM）在軟骨中表達，并通過調節(jié)ACAN 基因的表達，誘導關節(jié)軟骨細胞Ca2+流入［12］，線粒體發(fā)生腫脹，功能受損，參與PTOA 中軟骨的破壞［13］。軟骨細胞受到機械刺激后，軟骨細胞中的Piezo1 通道和TRPV4 通道即產生上述變化，其介導壓力誘導的軟骨細胞膜張力增高，并導致胞漿內Ca2+濃度增高，這與隨后的損傷反應密切相關［10］。Piezo1 通道在軟骨細胞中的表達增加導致一個前饋機制，即在基礎狀態(tài)下和機械變形后誘導過量的細胞內Ca2+內流［14］。

受到機械刺激或損傷后2 h，內源性線粒體呼吸功能受損，出現(xiàn)線粒體基質破壞、線粒體膜去極化等現(xiàn)象。在損傷后早期靶向線粒體電位、容量和膜極化可能會導致軟骨的破壞。軟骨所受機械力沖擊的程度在決定疾病嚴重程度上也很重要，實驗表明，15～20 MPa的機械應力范圍內沖擊軟骨組織，即可導致軟骨細胞死亡［15］。而低于此范圍的沖擊力可導致線粒體基質破壞、線粒體基質降解酶（包括MMP 和ADAMTS）的上調、線粒體膜去極化［15］以及細胞反應［16］，但不導致軟骨細胞的死亡。當機械力超過閾值時，即可發(fā)生機械損傷。過度的機械力也可造成該區(qū)域一定比例的細胞死亡，繼而產生損傷相關分子模式（DAMPs）。DAMPs 在組織受損時可激活先天免疫系統(tǒng)，線粒體參與機體的天然免疫反應的調節(jié)，機械損傷后，線粒體相應發(fā)生損傷，可釋放mtDNA，線粒體轉錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM），ROS，ATP，心磷脂和甲酰肽等作為DAMPs 誘導后續(xù)的炎癥反應［17］。

3.2 軟骨細胞線粒體與信號通路 （1）TLR 信號通路：急性損傷期機械組織損傷可導致一定比例的細胞死亡，繼而產生損傷相關分子模式（danger-associated molecular patterns，DAMPs），然后由TLR 蛋白在細胞表面檢測到［18］。TLR 蛋白由細胞外結構、單路徑跨膜結構和細胞內結構組成，被歸類為模式識別受體（PRR），因其識別微生物中的保守分子結構，稱為病原體相關分子模式（PAMPs）［19］。TLR 通過骨髓分化因子88（MyD88）和MyD88 依賴性通路發(fā)出信號［20］。MyD88 由兩個結構域組成：TIR 結構域以及死亡結構域，TIR結構域與toll 樣受體的TIR 結構域相互作用。TLR4 的激活將TRAM 和干擾素反應因子（TRIF）招募至TLR4 的TIR 域。RIP1（受體相互作用蛋白1）介導由TRIF 的羧基末端區(qū)域誘導NF-κB。TBK1 磷酸化IRF3，IRF3 與p300 和CBP（CREB結合蛋白）復合，激活干擾素誘導基因IP-10 和RANTES 的表達。TRIF 可以結合TRAF6 并通過激活NF-κB 產生炎癥細胞因子［19］。而后可驅動炎癥級聯(lián)反應，使促炎、促分解代謝因子增加，使PTOA 進入炎癥期。（2）NF-κB 信號通路：過度的機械力也可刺激軟骨細胞通過激活NF-κB 和MAP 激酶等多種途徑，開始分泌對ECM 有降解作用的酶，如金屬蛋白酶（metalloprotease，MMP）和蛋白聚糖酶。這一過程受線粒體的調控，與其產生的ROS 增加密切相關［21］。過度的關節(jié)軟骨機械應力可觸發(fā)線粒體釋放ROS，ROS 可介導NF-κB信號通路的激活，同時激活MAP 激酶級聯(lián)途徑［22］，MMP 和蛋白聚糖酶等開始被分泌，導致ECM 的降解。細胞外膠原蛋白被這些降解性蛋白酶逐步破壞，蛋白聚糖丟失，促使ECM發(fā)生降解，而ECM 中充滿著膠原蛋白和聚集蛋白聚糖等維持軟骨細胞健康穩(wěn)態(tài)的必需物，ECM 降解后可軟骨細胞健康穩(wěn)態(tài)被破壞，導致軟骨細胞分解代謝活動明顯增強，細胞進入急性損傷期。

3.3 軟骨細胞線粒體與炎癥介質 研究發(fā)現(xiàn)，促炎細胞因子的水平在人關節(jié)損傷后數(shù)天內達到峰值。在一項針對34 例急性前交叉韌帶損傷患者的橫斷面研究中，在損傷后24 h 內檢測到滑液中最高水平的炎性細胞因子。這表明炎癥期在PTOA前期中占重要地位。機械損傷后可產生DAMPs，線粒體發(fā)生功能障礙，能量代謝異常，隨后ROS 產生增多，從而激活NLRP3 炎癥小體［7］。在損傷后即刻，NLRP3 等一些重要的炎癥前體在關節(jié)滑膜液中大量存在［23］，表明急性機械損傷后，線粒體立刻發(fā)生功能障礙，引發(fā)后續(xù)炎癥。

3.3.1 DAMPs DAMPs 是PTOA 炎癥期一個重要的相關信號。DAMPs 誘發(fā)關節(jié)炎癥的一個中心機制是激活NLRP3 炎癥小體和隨后產生白細胞介素1β（IL-1β）［16］。機械關節(jié)損傷造成一定比例的細胞死亡時，會導致DAMPs 的產生，DAMPs 可造成軟骨細胞線粒體功能障礙，其主要表現(xiàn)為呼吸鏈復合物活性下降和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成減少［24］，線粒體膜電位（membrane potential，MMP）下降，活性氧（reactive oxygen species，ROS）和氧化應激（oxidative stress，OS）增加［25］，線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）受損，鈣調節(jié)障礙等［26］。這些變化可誘導軟骨細胞激活NLRP3 炎癥小體，釋放炎癥介質［26］。有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥介質如白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等在PTOA 關節(jié)中高度上調，誘導過量ROS 產生和基質降解蛋白酶的表達，導致軟骨ECM 降解，從而導致關節(jié)功能障礙。

3.3.2 NLRP3炎癥小體 NLRP3炎癥小體是炎癥期一個重要的相關信號。NLRP3 炎癥小體由受體蛋白NLRP3，適應分子ASC 以及Caspase-1 組成［16］。IL-1β 前體從無生物活性活化為有生物活性需要Caspase-1 的裂解。NLRP3 通過進入NLRP3 炎癥小體的Caspase-1 和ASC 而得到激活信號，繼而與ASC 和Caspase-1 發(fā)生寡聚化，這就激活Caspase-1，隨后IL-1β 被激活而進入活性形式［16］。然而，這整個過程已被證明處于線粒體控制之下。炎癥小體激活的調節(jié)與高線粒體膜電位、線粒體ROS 和線粒體DNA 均有關。

3.3.3 線粒體膜電位 有研究發(fā)現(xiàn)，線粒體膜內電位不可逆降低時導致NLRP3 觸發(fā)的Caspase-1 激活，因此可以認為線粒體膜電位與NLRP3 炎癥小體的激活有關。NLRP3 被激活后Caspase-1 通過Ca2+信號途徑被鈣蛋白酶釋放［27］。鈣蛋白酶活性增強依賴于接近40 mV 的未破壞的真核細胞膜電位。由于真核細胞的去極化或超極化抑制鈣蛋白酶活性的增強，從而抑制NLRP3 的激活［27］。這表明，去極化或超極化帶來的線粒體膜電位對于NLRP3 的激活具有抑制作用，高線粒體膜電位參與調節(jié)炎癥小體的激活。

3.3.4 線粒體ROS 另一方面，線粒體ROS 積累時可激活NLRP3 炎癥小體［7］。研究表明線粒體ROS 產生可能導致NLRP3 活化，以及IL-1β 分泌，繼而使線粒體膜通透性提高和細胞死亡。NAKAHIRA 等發(fā)現(xiàn)使用線粒體復合物I 抑制劑魚藤酮治療能增強LPS 和ATP 刺激巨噬細胞中的caspase-1活化和IL-1β 分泌［28］。因此，線粒體中ROS 是導致NLRP3活化以及后續(xù)炎癥反應產生的一個重要因素。

3.3.5 線粒體DNA 研究顯示受損的線粒體DNA 可參與激活NLRP3 炎癥小體，進一步支持線粒體在炎癥小體激活中的作用［29］。線粒體DNA 由雙鏈環(huán)狀分子組成，附著在基質側的線粒體內膜上，靠近細胞ROS 的主要來源，因此，線粒體DNA 特別易發(fā)生氧化損傷［29］。NLRP3 炎癥小體激活劑如細胞外ATP 可觸發(fā)鉀離子外流、線粒體膜電位喪失和線粒體ROS產生［29］。這些可導致線粒體DNA 氧化并釋放到細胞質中，而氧化的線粒體DNA 可直接作為NLRP3 激動劑［30］。氧化的線粒體DNA 與NLRP3 結合可促進炎癥小體的寡聚［30］。通過抑制線粒體自噬能使細胞中功能障礙性線粒體不斷積累，且最終增加細胞質基質中的線粒體DNA 總和［28］，然后導致NLRP3炎癥小體的激活。

3.3.6 白細胞介素1β（IL-1β） 白細胞介素1β（IL-1β）是創(chuàng)傷性損傷后急性關節(jié)炎癥的重要介質，同樣也是PTOA的一個重要相關信號。IL-1β的釋放需要一系列步驟。前體蛋白的合成和積累是必需的，包括pro-IL-1β 和NLRP3，這個過程由幾個刺激步驟完成，其中包括病原體相關分子模式分子（PAMPs）等微生物產物的刺激。病原體識別受體（PRRs）（如Toll 樣受體（TLRs））在 PAMPs 刺激下被激活［31］。PRR被激活后，Caspase-1 和ASC 進入NLRP3 炎癥小體，NLRP3得到激活信號，繼而與ASC 和Caspase-1 發(fā)生寡聚化，這就激活了Caspase-1，隨后IL-1β 被激活的Caspase-1 裂解進入活性形式［16］。

3.4 軟骨細胞線粒體與PTOA 慢性退化 炎癥期后，關節(jié)進入慢性退化期。PTOA慢性退化期的病理特征以軟骨和軟骨下骨的吸收引起的軟骨退化以及病理性炎癥和血管增生為主，其與骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）病理表現(xiàn)相似，但急性組織損傷導致的PTOA 骨吸收和血管增生更為活躍［32］。大量證據(jù)支持線粒體功能障礙在PTOA 慢性期中的作用［24］，其與PTOA 慢性期中的骨吸收作用和血管增生作用存在密切聯(lián)系。

PTOA 急性組織損傷期和炎癥期造成線粒體功能障礙，繼而生物能量衰竭、氧化應激累積。ROS 增加是氧化應激的直接產物，可引發(fā)線粒體DNA 損傷，引起終末期線粒體功能障礙。在從終末期OA 患者中分離出的軟骨細胞中可以發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙與后期病理變化相關，包括金屬蛋白酶-1（MMP-1），金屬蛋白酶-3（MMP-3）和金屬蛋白酶-13（MMP-13）表達上調，膠原蛋白和蛋白聚糖合成減少以及軟骨病理性鈣化［33］，間接表明線粒體功能障礙可引起軟骨吸收作用，而PTOA 下的軟骨吸收作用更為強烈，這或許可以反推出急性損傷條件下更為強烈的線粒體功能障礙能引起更強烈的破骨作用進而導致軟骨吸收作用的增強，引發(fā)軟骨退化。線粒體功能障礙導致的軟骨退化促進PTOA 的發(fā)展。

PTOA 創(chuàng)傷后慢性退化期的發(fā)病機制中，DAMPs 誘導的炎癥起重要作用，DAMPs 的釋放會對組織穩(wěn)態(tài)造成傷害［34］。慢性退化期，受傷或壞死的軟骨細胞釋放DAMPs，激活免疫反應并動員修復機制，促進病理性炎癥的發(fā)生和血管生成，以應對慢性損傷［35］。研究表明，DAMPs 可進一步導致成纖維細胞的局部增殖，從而促進血管的增生［36］。因此，DAMPs及其誘導形成的IL-1β 等促炎癥因子在慢性退化期中起著引起病理性炎癥和血管增生的作用。研究表明，促炎介質可能在損傷后數(shù)月仍然升高，并被認為會導致關節(jié)永久性退行性改變。

4 通過軟骨細胞線粒體方向治療PTOA的應用前景

由于目前PTOA 的發(fā)病機制未完全明確，在治療方法方面，非手術治療以緩解疼痛為主，手術治療多進行關節(jié)置換手術，尚未出現(xiàn)簡單有效的PTOA 治療方案。綜合軟骨細胞線粒體在PTOA 中的研究可以發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞線粒體在多種機制的作用下對PTOA 的誘發(fā)產生重要影響。因此，通過軟骨細胞線粒體方向治療PTOA 存在廣闊的前景。

可通過對軟骨細胞線粒體的靶向防護預防PTOA。Szeto-Siller（SS）多肽在撞擊后的變性中，通過與心磷脂和細胞色素c 相互作用而靶向對線粒體膜的通透性升高和ROS 的生成產生抑制［37］，從而實現(xiàn)對線粒體的保護作用。同時也在體外模型中被證明具有保存軟骨完整性和沖擊后軟骨細胞活力的能力［38］。這一研究表明，SS 多肽通過對軟骨細胞線粒體靶向保護可能成為預防PTOA 的可行途徑之一。通過抗氧化劑直接針對線粒體ROS 產生也不失為一種可行的PTOA 預防方法。最近的一項研究使用抗氧化劑甘草查耳酮A（Lico A）限制NLRP3 炎癥小體在體外和手術模型OA 中對軟骨細胞的損傷［39］。研究表明，Lico A 可通過促進NRF2/ HO-1 軸限制損傷過程中NF-kB 的活化，從而改善軟骨細胞損傷和死亡，對PTOA 起到預防作用。此外，通過抗氧化劑減輕ROS 對軟骨細胞的損害也可成為預防PTOA 的新途徑，研究證實通過納米粒子向軟骨細胞輸送抗氧化劑同樣具有一定的PTOA 治療潛力，以及對軟骨具有保護作用。這些研究在促進抗氧化劑使用的同時，也證實NLRP3 抑制劑在PTOA 中的可行性。MCC950 作為NLRP3 的一種強效抑制劑，在人類疾病模型中被證明可以安全有效限制NLRP3 活性［38］，有較大潛力作為預防PTOA 的第一線。

5 小結與展望

綜上所述，軟骨細胞線粒體在PTOA 的發(fā)病過程中起重要作用。發(fā)生機械損傷后，在機械生物學因素的參與下關節(jié)軟骨細胞對損傷作出急性反應，導致線粒體功能障礙，引起炎癥，其中涉及DAMPs、NLRP3 炎癥小體、IL-1β 等PTOA相關因素，最終導致慢性退化期的軟骨退化、PTOA 發(fā)生?？梢酝ㄟ^對軟骨細胞線粒體的靶向防護，減少線粒體ROS 的產生及ROS 對軟骨細胞的損害，抑制炎癥小體NLRP3 等方法預防治療PTOA，這為臨床上預防治療PTOA 提供了新思路。