馬銘，翟亞楠，邸金威，高翔，鄭愛萍，高靜

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京 100850；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第988醫(yī)院藥劑科，河南 鄭州 450042）

有機(jī)磷化合物（organophosphorus compounds，OP）產(chǎn)生于20 世紀(jì)30 年代，最初作為殺蟲劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，后來隨著戰(zhàn)爭的爆發(fā)逐漸被用作化學(xué)武器［1］。一方面，有機(jī)磷殺蟲劑在發(fā)展中國家被廣泛使用，使得每年仍有幾十萬人因有機(jī)磷中毒而死亡［2］，有機(jī)磷農(nóng)藥對農(nóng)業(yè)耕作安全和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量帶來了極大的挑戰(zhàn)；另一方面，自O(shè)P 被合成以來，多次在恐怖活動(dòng)和戰(zhàn)爭中被充當(dāng)化學(xué)武器使用［3-4］，東京地鐵沙林毒劑事件和敘利亞戰(zhàn)爭中數(shù)以萬計(jì)的平民因沙林毒劑而死去［5-6］，時(shí)至今日人們?nèi)匀簧钤谟袡C(jī)磷毒劑的陰影之下。

有機(jī)磷神經(jīng)性毒劑主要包括G 型、V 型和諾維喬克3 類。G 型毒劑含有P-F 或P-CN 鍵，以塔崩、梭曼、沙林和環(huán)沙林為代表；V型毒劑具有比G 型更強(qiáng)的毒性，分子結(jié)構(gòu)中含有P-S 鍵，不易揮發(fā)，會對環(huán)境造成長時(shí)間污染。諾維喬克公開信息較少，但有報(bào)道其為液體狀，也可吸附于載體成為粉塵狀，毒性強(qiáng)于G型和V型［7］。OP有親脂性，可以經(jīng)黏膜和皮膚迅速吸收，也可穿透血腦屏障，對神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害［8］。OP進(jìn)入人體后，可與膽堿能突觸的乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）不可逆結(jié)合，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿蓄積［9-10］，最終造成人體癱瘓、呼吸衰竭，甚至死亡［11-12］。該過程極為迅速，難以防護(hù)，因此對OP 中毒的預(yù)防一直是其抗毒藥物研發(fā)中最受關(guān)注的焦點(diǎn)。

及時(shí)清除或降解進(jìn)入機(jī)體的毒劑，是抗OP 中毒的首個(gè)重要環(huán)節(jié)。通過毒劑體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化和毒理機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，毒劑從進(jìn)入血液循環(huán)到作用于毒性靶標(biāo)的過程中，可通過結(jié)合或降解毒劑起到解毒作用。20 世紀(jì)中葉，Wales 等［13］發(fā)現(xiàn)外源芳基酯酶對對硫磷有良好解毒作用，從此以酶為代表的生物清除劑研究不斷進(jìn)步和發(fā)展，為有機(jī)磷中毒解救帶來了新方向［14］。生物清除劑是天然或重組的酶和抗體，在毒劑到達(dá)作用靶標(biāo)前可將其中和［15-17］，常通過注射給藥與血液中的毒劑發(fā)生反應(yīng)，肺吸入和經(jīng)皮給藥等方式也有報(bào)道［18］。生物清除劑顯著的解毒效果受人關(guān)注，但自身存在的免疫原性強(qiáng)、生物半衰期短等問題阻礙了其進(jìn)一步應(yīng)用。將現(xiàn)代藥物遞送技術(shù)用于生物清除劑研究，能夠解決生物清除劑固有問題，為OP 特別是神經(jīng)性毒劑的中毒防治帶來新的曙光。

1 生物清除劑分類

有機(jī)磷生物清除劑根據(jù)作用機(jī)制分為3 類（圖1）。①化學(xué)計(jì)量型，如AChE 和丁酰膽堿酯酶（butyrylcholinesterase，BChE），與OP 按摩爾比1∶1定量結(jié)合，減少血液中游離有機(jī)磷的數(shù)量，結(jié)合后的OP 不能繼續(xù)抑制其他膽堿酯酶。②假催化型，需將肟類化合物與膽堿酯酶共同使用。肟類化合物攻擊膦?；憠A酯酶活性位點(diǎn)絲氨酸上共價(jià)結(jié)合的膦?；?，從活性位點(diǎn)釋放OP 基團(tuán)，恢復(fù)膽堿酯酶活性［8］，通過肟類化合物與膽堿酯酶聯(lián)合使用達(dá)到類似“催化作用”的效果，解救未被有機(jī)磷完全老化的膽堿酯酶，從而達(dá)到治療作用［19］。③催化型，如有機(jī)磷水解酶，利用酶的催化特性快速水解OP，活性高且可重復(fù)利用，使用低劑量即可達(dá)到高效率解毒。

圖1 有機(jī)磷生物清除劑的類型與作用機(jī)制示意圖. a：化學(xué)計(jì)量型生物清除劑解救中毒過程；b：假催化型生物清除劑解救中毒過程；c：催化型生物清除劑解救中毒過程.

1.1 化學(xué)計(jì)量型和假催化型

1.1.1 羧酸酯酶（carboxylesterases，CaE）

CaE（EC 3.1.1.1）來源于羧酸酯酶家族，可將羧酸酯水解為對應(yīng)的醇和羧酸。CaE 廣泛存在于生物體，但自發(fā)現(xiàn)至今的100 多年里仍未確定特異性底物，目前認(rèn)為其可抵御外源性酯，保護(hù)機(jī)體正常功能［20］。CaE 可通過化學(xué)計(jì)量方式與OP 作用，但CaE 在人體血液中的含量很低，不足以抵抗高劑量的有機(jī)磷毒劑［21-22］。CaE 的優(yōu)勢在于其在自然界生物體中廣泛存在，有大量其他物種來源可以補(bǔ)充。與其他清除劑相比，CaE 的劣勢在于其老化后重活化的速率十分緩慢，與肟難以形成假催化型清除劑，使CaE的研究發(fā)展受到限制。

1.1.2 乙酰膽堿酯酶

AChE（EC 3.1.1.7）是絲氨酸水解酶類的重要成員之一［23］，在體內(nèi)通過水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，確保人體神經(jīng)信號傳遞功能正常有序。作為神經(jīng)信號傳遞過程中的一種必需酶，AChE 水解效率很高，在硫代乙酰膽堿作為酶底物時(shí)，AChE 作用速率能達(dá)到kcat/Km=9.6×1010L·mol-1·min-1［24］。有研究通過誘導(dǎo)AChE 突變來防止有OP 中毒，突變體在肟存在下重活化能力增強(qiáng)，同時(shí)老化速度有所降低［24］。Antonijevic 等［25］探究了6 種肟類物質(zhì)對敵敵畏誘導(dǎo)的體內(nèi)氧化應(yīng)激的影響，發(fā)現(xiàn)吡啶肟除對AChE 重活化外，同時(shí)可以緩解OP 引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕中毒導(dǎo)致的機(jī)體損害。

1.1.3 丁酰膽堿酯酶

BChE（EC 3.1.1.8）主要分布在血漿中，是一種非特異性膽堿酯酶，尚未發(fā)現(xiàn)其明確的生理功能，但由于其在人體含量明顯高于AChE，且能被OP顯著抑制活性，因此目前普遍認(rèn)為其能在OP 中毒時(shí)對AChE 起到一定保護(hù)作用。BChE 的活性中心能與OP 迅速發(fā)生反應(yīng)形成不可逆共價(jià)鍵，使結(jié)合的OP不能抑制其他膽堿酯酶而失去毒性［26］。大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，BChE 對多種有機(jī)磷神經(jīng)毒劑如沙林、塔崩、梭曼和VX 都具有一定的保護(hù)作用［6］，且其突變體G117H具有催化型生物清除劑的特性，能夠在一定程度上改善化學(xué)計(jì)量型用量大的問題［15］。Lushchekina等［27］對膽堿酯酶老化過程進(jìn)行了研究，并對G117H 變體自身活化機(jī)制進(jìn)行分析，表明膽堿酯酶老化機(jī)制與OP 進(jìn)攻絲氨酸的空間取向有關(guān)，且BChE的催化特性與氨基酸的質(zhì)子化途徑密不可分。

1.2 催化型

1.2.1 對氧磷酶（paraoxonase，PON）

PON 是一種非特異性酯酶，能夠催化有機(jī)磷、芳香羧酸酯、氨基甲酸酯和不飽和脂肪酸等的水解［28］。PON 包括PON1，PON2 和PON3。PON1（EC 3.1.8.1）是一種與高密度脂蛋白結(jié)合的鈣依賴酶，分子質(zhì)量約45 ku，主要在肝合成，也有少部分在腎合成［29］。PON1 對OP 具有良好的水解作用［30］。Tripathy 等［31］通過隨機(jī)誘變的方法來提高重組人PON1 對對氧磷和二異丙基氟磷酸鹽的水解能力，發(fā)現(xiàn)突變體表現(xiàn)出不同的內(nèi)酯酶和芳基酯酶活性以及抑制劑敏感性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)離酶活性位點(diǎn)的突變也能調(diào)控酶的水解活性。Grunkemeyer 等［32］確定了水解酶活性位點(diǎn)內(nèi)和周圍常見的關(guān)鍵殘基，探究了PON1 水解二異丙基氟磷酸鹽等OP 的機(jī)制，結(jié)果表明Ca2+對PON1 水解OP 底物的活性非常重要。

1.2.2 磷酸三酯酶（phosphotriesterase，PTE）

PTE（EC 3.1.8.1）最初在假單胞菌中被發(fā)現(xiàn)，由336 個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為36 ku，空間結(jié)構(gòu)為兩個(gè)桶狀蛋白的二聚體。有機(jī)磷水解酶（organophosphorus hydrolase，OPH）是其中水解OP 的代表酶。PTE 活性中心有2 個(gè)金屬離子，與酶活性密切相關(guān)，天然酶中大多以Zn2+作為活性中心，但也存在Ni2+，Cd2+，Mn2+和Co2+的活性中心，其中Zn2+活性中心最穩(wěn)定，Co2+中心活性最強(qiáng)［33］。PTE 對對氧磷有很好的水解效果（kcat/Km=4×107L·mol-1·s-1），但對毒性較強(qiáng)的Sp型OP 水解效果較差［34］。Goldsmith 等［35］通過對PTE 進(jìn)行定向進(jìn)化突變，得到了對V 型毒劑水解速率提高了幾個(gè)數(shù)量級的突變體，同時(shí)優(yōu)化突變體篩選方法，高效篩選得到的酶能預(yù)防和治療多種神經(jīng)毒劑中毒。Escher 等［36］通過將2 種高活性但底物譜不同的PTE 進(jìn)行連接構(gòu)建異構(gòu)二聚PTE 變體，構(gòu)建酶具有2 個(gè)不同的活性位點(diǎn)，對V 型毒劑、環(huán)沙林和馬拉氧磷均表現(xiàn)出前所未有的水解能力，且結(jié)構(gòu)單一穩(wěn)定。

1.2.3 有機(jī)磷降解酶（organophosphate-degrading agent，OpdA）

OpdA 是與PTE 相關(guān)的一種同系物，有90%氨基酸序列與PTE 相同，最早從一株放射農(nóng)桿菌中分離而來［24，38］。OpdA 可水解多種OP，對甲基對硫磷的水解效率遠(yuǎn)超其他OP，這表明隨著底物空間位阻的增大，酶對其水解能力降低，且離去基團(tuán)中芳香基和雜環(huán)部分對OpdA 在底物選擇方面有很大影響［37］。Eddleston 等［38］探討了OpdA 在人血清中和小型豬體內(nèi)對常見有機(jī)磷殺蟲劑的降解能力，結(jié)果表明，在體外培養(yǎng)人血清中OpdA 能減少樂果、甲基對硫磷和丙泊磷中毒后血液中的OP 濃度，減弱對AChE 的抑制程度，證明了OpdA 對有機(jī)磷殺蟲劑的藥理作用，支持在人體內(nèi)進(jìn)一步研究。

1.2.4 二異丙基氟磷酸脂酶（diisopropyl fluorophosphatase，DFPase）

DFPase（EC 3.1.8.2）從魷魚體內(nèi)分離得到，具有由314 個(gè)氨基酸和2 個(gè)鈣離子組成的六葉β 螺旋結(jié)構(gòu)，能夠水解二異丙基氟磷酸鹽和其他OP［39-40］。其解毒作用通過將OP 水解成磷酸鹽和氟離子來實(shí)現(xiàn)［41］，大多DFPase 在25～50℃穩(wěn)定性最好，這也是與OP 反應(yīng)的最適溫度［42］。Purg 等［43］利用價(jià)鍵理論探討DFPase 的催化機(jī)制，發(fā)現(xiàn)DFPase 是通過D229 激活親核水分子途徑催化水解DFP，并觀察到酶活性差異的主要原因不僅與酶活性位點(diǎn)殘基有關(guān)，外部殘基也是導(dǎo)致底物特異性的原因之一。此發(fā)現(xiàn)對于構(gòu)建不同OP 底物的水解酶具有重要意義。

1.2.5 人衰老標(biāo)志物蛋白30（senescence marker protein 30，SMP30）

SMP30（EC3.1.1.17）分子質(zhì)量為34 ku，結(jié)構(gòu)為六葉β螺旋，是一種鈣調(diào)節(jié)蛋白，在腦、肺、肝和腎等組織中大量表達(dá)，具有抗凋亡、抗氧化和對抗OP中毒的作用，并與白內(nèi)障發(fā)生有關(guān)［24，44］。小鼠SMP30 對OP 的水解速率從高到低依次是沙林、梭曼、塔崩、二異丙基氟磷酸鹽，且對梭曼的4 個(gè)異構(gòu)體的水解速率相同［24］。Dutta 等［45］通過克隆人類和小鼠中SMP30，研究不同二價(jià)金屬對SMP30 結(jié)構(gòu)構(gòu)象和功能偏差的影響，并對不同金屬離子存在下的酶活進(jìn)行考察。結(jié)果表明，在不同金屬離子存在的情況下，2 種蛋白二級結(jié)構(gòu)略有變化，同時(shí)2 種蛋白含有不同金屬離子時(shí)對內(nèi)吸磷和γ-硫代丁內(nèi)酯的水解特異性有所不同，闡明了金屬離子對SMP30水解功能的重要性。

1.2.6 有機(jī)磷酸酐水解酶（organophosphorus acid anhydrolase，OPAA）

OPAA（EC 3.1.8.2）是一種具有PTE 活性的細(xì)菌脯氨肽酶，結(jié)構(gòu)類似于折疊的圓面餅，活性位點(diǎn)有2 個(gè)Mn2+。該酶最初由Abraham Mazur 在兔的組織中發(fā)現(xiàn)，后來DeFrank 和Cheng 從嗜鹽交替單胞菌JD6.5菌株中成功檢測并純化［46］。OPAA能水解OP 中常見的P-F，P-O，P-CN 和P-S 鍵，但長期儲存穩(wěn)定性較差，難以直接用于OP 解毒［47］。Jain等［48］在大腸桿菌中表達(dá)OPAA 突變體，純化后突變體最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH 為8.5，而后使用超聲霧化技術(shù)將OPAA 突變體固定在海藻酸微球中，增強(qiáng)了其穩(wěn)定性、活性和生物傳感能力，促進(jìn)了OPAA 突變體在對氧磷檢測中的應(yīng)用，并為構(gòu)建更多高效迅速的有毒化合物檢測設(shè)備提供了參考。Bae 等［49］通過定點(diǎn)突變方法提高OPAA對沙林的催化效率，其中突變體OPAA FL 活性明顯增強(qiáng)，且更傾向于水解毒性較小的（R）-（+）沙林對映體。

1.2.7 脯氨肽酶

脯氨肽酶（EC 3.4.13.9）廣泛存在于自然界，已從哺乳動(dòng)物體內(nèi)和微生物中成功分離。它是M24肽酶家族的一員，可參與多種化學(xué)反應(yīng)，包括肽水解、肌酸水解以及水解OP 等［50］。Wang 等［51］通過大腸桿菌培養(yǎng)純化脯氨肽酶，電泳結(jié)果顯示其純度可達(dá)96%，且在Mn2+存在時(shí)具有較好的催化效果。Rezk 等［52］通過將含有人肝脯氨肽酶基因的重組腺病毒導(dǎo)入小鼠肝中獲得大量重組人肝脯氨肽酶，該酶對沙林、環(huán)沙林和梭曼有水解作用，其中水解沙林的效率最高，但不能水解VX和塔崩。

1.2.8 甲基對硫磷水解酶（methylparathion hydrolase，MPH）

MPH（EC 3.1.8.1）從假單胞菌屬分離而來，該菌將甲基對硫磷中的碳作為能量的主要來源。MPH由一個(gè)二聚體結(jié)構(gòu)組成，每個(gè)亞基都有混合雜化的雙核鋅，多種重組MPH 對甲基對硫磷和其他OP 都表現(xiàn)出較高的水解活性［7］。最初認(rèn)為此酶與OpdA 同源，但后來發(fā)現(xiàn)其同源性不足50%。雖然有所不同，但二者活性位點(diǎn)區(qū)域相似，都有3個(gè)疏水區(qū)域容納底物側(cè)鏈［53］。Zhao 等［54］從單胞菌中克隆并表達(dá)了MPH 基因，重組酶在加入一定濃度Mn2+后活性提高28.3 倍，且對對氧磷、敵敵畏和毒死蜱降解效果良好，但對對硫磷和馬拉硫磷的降解能力需進(jìn)一步優(yōu)化提升。

2 生物清除劑的體內(nèi)遞送

盡管生物清除劑在對抗OP 中毒方面展示出了獨(dú)特優(yōu)勢，但只有少部分存在于人體內(nèi)，大多來源于微生物，對人體而言是異源的，直接用于人體會產(chǎn)生嚴(yán)重免疫反應(yīng)，因此限制了其作為藥物的應(yīng)用。此外，人體內(nèi)天然存在的生物清除劑的量極為有限，往往難以抵御毒性強(qiáng)且毒發(fā)快的OP。因此，確保人體內(nèi)生物清除劑在不引發(fā)危險(xiǎn)免疫反應(yīng)的前提下，能夠較長時(shí)間內(nèi)維持一定濃度，是預(yù)防OP中毒的有效措施。利用適當(dāng)藥物制劑遞送技術(shù)，可隱藏異源性生物清除劑的“危險(xiǎn)信號”，避免被人體免疫系統(tǒng)快速識別和清除，從而延長其體內(nèi)血液循環(huán)半衰期。

2.1 聚羧基甜菜堿（polycarboxybetaine，PCB）修飾

兩性離子材料PCB 來源于天然甘氨酸甜菜堿，是一種分子中同時(shí)含有正、負(fù)離子基團(tuán)的聚合物，其分子中含有數(shù)量相等的正負(fù)離子，離子通過溶劑化作用結(jié)合水分子，在其表面形成一層牢固的水化膜，達(dá)到一種“水屏蔽”的隱身作用［55］。有研究表明，PCB 聚合物偶聯(lián)到顆粒表面可避免與環(huán)境發(fā)生非特異性相互作用，減少巨噬細(xì)胞攝取，并在進(jìn)入全身血液時(shí)改善蛋白質(zhì)的免疫原性，增加藥物在體內(nèi)血液循環(huán)中的時(shí)間［56-58］。Zhang 等［59］通過構(gòu)建兩性離子水凝膠和直接在蛋白表面進(jìn)行PCB 修飾，使修飾后的OPH 在大鼠體內(nèi)半衰期延長為天然酶的60倍，極大延長了對對氧磷和沙林中毒的保護(hù)時(shí)間，且多次給藥后未發(fā)生血液加速清除現(xiàn)象，有助于多次預(yù)防給藥。PCB 修飾藥物給藥方式靈活，可通過皮下注射、靜脈注射［59］和肺部插管滴注給藥［60］等，均有很好的效果。特別是肺部給藥后，有機(jī)磷水解酶的生物利用度從5%提高到了53%，對分子質(zhì)量＞50 ku 的蛋白來說，生物利用度的提升非常顯著。然而，盡管PCB 遞送有機(jī)磷水解酶優(yōu)勢顯著，但兩性離子材料體內(nèi)代謝研究報(bào)道較少，其作為載體在人體內(nèi)的長期安全性還需進(jìn)一步考察。

2.2 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾

PEG 是一種兩親性高分子聚合物，具有無毒、水溶性極好等特點(diǎn)，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)用于體內(nèi)注射。目前，PEG 化處理，即PEG 的共價(jià)鏈接，已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)和多肽類藥物的修飾［61-62］，以改善藥物體內(nèi)理化性質(zhì)和治療效果。Efremenko等［63］在三維蛋白結(jié)構(gòu)表面電荷分布引導(dǎo)下，將OPH、PEG 和聚-L-谷氨酸嵌段共聚物簡單混合，形成納米清除劑。納米清除劑中的酶的保質(zhì)期顯著延長，在不添加任何穩(wěn)定劑的情況下，8℃下其半衰期＞1000 d，且在全血中活性提高17%～26%，而裸酶則在30 d 內(nèi)失去了80%活性。此外，通過改變嵌段共聚物與酶的電荷比，還可優(yōu)化OPH 的催化活性和其他性能。不過，PEG 化蛋白藥物技術(shù)雖已較為成熟，有多款制劑批準(zhǔn)先例，但大量研究報(bào)道其應(yīng)用于人體后會產(chǎn)生抗PEG 抗體，多次注射會產(chǎn)生血液清除加速現(xiàn)象，從而影響制劑療效。

2.3 紅細(xì)胞膜（red blood cell membrane，RBCM）遞送

RBCM 負(fù)載和包覆是近幾十年來藥物遞送技術(shù)高度活躍的研究領(lǐng)域。RBCM 載體具有優(yōu)秀的生物相容性、長循環(huán)性和免疫的特殊性，有望成為生物清除劑療法的理想載體。McCranor 等［64］將PON1 突變體與Ter119 scFv 連接表達(dá)為融合蛋白并靶向RBCM 表面，利用紅細(xì)胞在體內(nèi)長循環(huán)的特性，使清除劑在血液中保留較長時(shí)間，這種方法為開發(fā)長效循環(huán)且穩(wěn)定的生物清除劑創(chuàng)造了可能。

細(xì)胞膜涂層是一種新興納米技術(shù)，已被證明可顯著提高合成納米材料在體內(nèi)復(fù)雜生物環(huán)境中的穩(wěn)定性。細(xì)胞膜涂層納米顆粒通過借助不同類型細(xì)胞而被成功制備，各有其獨(dú)特功能，特別是RBCM 涂層在改善生物相容性和降低免疫原性方面效果突出［65］。RBCM 表面具有膜蛋白AChE，可與OP 進(jìn)行定量結(jié)合，為RBCM 設(shè)計(jì)成為抗OP 藥物提供可能。Pang 等［66］將純化的RBCM 包覆在100 nm 的丙交酯乙交酯共聚物核上，用細(xì)胞膜上的AChE 阻斷血液中的敵敵畏。結(jié)果表明，仿生表面設(shè)計(jì)的納米顆?？勺璧KOP 和內(nèi)源性AChE 的結(jié)合，從而降低OP 中毒的嚴(yán)重程度；同時(shí)，在制備納米顆粒之后，RBCM上AChE損失量少，酶活變化較小，敵敵畏中毒小鼠存活率顯著提高，且用血型匹配的RBCM 包裹納米粒子對中毒受試者進(jìn)行OP 中和，可不考慮免疫原性。因此，RBCM 包裹納米粒子作為一種新型抗OP 生物清除劑具有巨大的應(yīng)用潛力。但另一方面，RBCM 作為一種生物載體，對環(huán)境要求高，體外存儲困難，人源紅細(xì)胞獲取受限，且多種血型之間紅細(xì)胞表面抗原不同，需要匹配血型才能使用，未來臨床使用仍然具有挑戰(zhàn)。

2.4 聚唾液酸（polysialic acid，PSA）修飾

PSA 是由N-乙酰神經(jīng)氨酸經(jīng)過糖苷鍵連接而成的線性多聚糖〔N-乙酰神經(jīng)氨酸的α（2→8）酮苷鍵聚合物〕，水解后可得到唾液酸寡糖和唾液酸單體，常作為蛋白類藥物分子的體內(nèi)遞送材料。PSA可降低包括免疫反應(yīng)在內(nèi)的不良反應(yīng)，改善藥物的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特性［67-68］，且其線性同聚物和異聚物在人體中沒有任何受體，分解代謝產(chǎn)物無毒，這些優(yōu)點(diǎn)為PSA 成功構(gòu)建長效的生物清除劑，大量注射到人體用于治療和預(yù)防OP 毒劑奠定了基礎(chǔ)，其也被認(rèn)為有望成為PEG 的替代品。Ilyushina 等［69］通過PSA 修飾重組人BChE（recombinant human BChE，rhBChE）使其在血液中的穩(wěn)定性增強(qiáng)，且通過PSA的組合優(yōu)化得到了活性損失小的rhBChE 偶聯(lián)物，修飾產(chǎn)物比未修飾酶穩(wěn)定6 倍，具有保護(hù)作用的同時(shí)，長期在體內(nèi)無不良反應(yīng)，能夠保護(hù)小鼠抵抗4.2倍LD50的高毒性神經(jīng)毒劑S-〔2-（二乙基氨基）乙基〕O-異丁基甲烷硫代膦酸鹽的損傷。不過PSA降低異源蛋白免疫原性能力仍然有限，且工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)量較低，限制了其大規(guī)模使用。

2.5 脂質(zhì)體負(fù)載

脂質(zhì)體的粒徑一般在100～500 nm 之間，由磷脂分子在溶液中自組裝而成，外部是親水的磷酸基團(tuán)，內(nèi)部是疏水的脂質(zhì)基團(tuán)［70］。在水環(huán)境中，磷脂分子定向排列，形成一個(gè)由親脂雙層膜包封的球形結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體具有生物相容性和生物可降解性，可通過改變脂質(zhì)組成來調(diào)節(jié)載藥能力，且多種藥物和小分子可結(jié)合在脂質(zhì)體表面發(fā)揮特異性作用，加之脂質(zhì)體具有靶向、安全、高效、長循環(huán)的優(yōu)勢，作為藥物遞送載體被廣泛使用。Petrikovics 等［71］將OPAA 封裝于脂質(zhì)體內(nèi)，對OP 二異丙基氟磷酸鹽進(jìn)行快速解毒，發(fā)現(xiàn)二異丙基氟磷酸鹽能夠輕易進(jìn)入脂質(zhì)體，且其水解產(chǎn)物無毒。Han 等［72］通過薄膜分散法制備了PON1 脂質(zhì)體，并對其包封率、酶活和粒徑分布等參數(shù)進(jìn)行考察。結(jié)果表明，該方法制備的脂質(zhì)體外觀形狀適宜、包封率高，粒徑小，分布均勻，酶活性相對穩(wěn)定，能在較長時(shí)間內(nèi)維持一定的血藥濃度，產(chǎn)生持續(xù)抗毒作用。但脂質(zhì)體作為載體也有其局限性，儲存穩(wěn)定性較差、批次差異大、粒徑控制難和有機(jī)溶劑殘留難以清除等，限制了其作為生物清除劑載體的進(jìn)一步應(yīng)用。

3 結(jié)語與展望

有機(jī)磷神經(jīng)性毒劑毒性強(qiáng)、毒發(fā)快，一旦侵襲人體，便會快速奪取人的生命。生物清除劑在OP中毒解救應(yīng)用中前景廣闊，通過對酶進(jìn)行生物工程改造、活性篩選和長循環(huán)修飾，可在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)長時(shí)間高效抗OP 能力，對于執(zhí)行特殊任務(wù)和戰(zhàn)場上的預(yù)先防護(hù)具有重大意義。

化學(xué)計(jì)量型生物清除劑是最早被研發(fā)出來的一類生物清除劑，其與OP 1∶1 結(jié)合，結(jié)合后的清除劑難以依靠自身水解OP 使其從結(jié)合位點(diǎn)脫離，無法重復(fù)使用，導(dǎo)致只能進(jìn)行低劑量中毒的解救，當(dāng)中毒劑量過大時(shí)，必須注射更大劑量生物清除劑才能取得較好的效果。但人源性的CaE 和膽堿酯酶由于倫理等問題，難以保證充足來源，大量研究聚焦于從其他哺乳動(dòng)物體內(nèi)獲得或者利用生物工程技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。這些研究在解決數(shù)量問題的同時(shí)會引入新的難題，即大量異源性酶進(jìn)入人體后如何保證在體內(nèi)不被快速清除且不會引發(fā)嚴(yán)重免疫反應(yīng)。因此，將制劑技術(shù)應(yīng)用于此類清除劑的遞送是非常必要的。另一方面，為解決化學(xué)計(jì)量型生物清除劑中和效率低的問題，假催化型和突變的化學(xué)計(jì)量型清除劑受到了更多關(guān)注，二者都可使化學(xué)計(jì)量型獲得催化能力，解決化學(xué)計(jì)量型使用量大的困難，但未來還需發(fā)現(xiàn)低毒、廣譜的肟類和催化活性更高的化學(xué)計(jì)量型突變體。

催化型清除劑使用較少劑量就可達(dá)到良好催化效果，是OP 中毒解救藥物研究的重要方向。大量研究集中于篩選活性更高和具有廣譜作用的突變體，得到了許多用于解救OP 中毒的候選酶。但在所有的催化型清除劑中，只有PON和脯氨肽酶在人體中有發(fā)現(xiàn)，其他酶都來源于動(dòng)物或細(xì)菌。人體內(nèi)高免疫原性和快速清除為大多數(shù)催化型清除劑的使用設(shè)置了障礙。通過將制劑遞送技術(shù)應(yīng)用于高效的催化型清除劑中，可明顯改善清除劑的藥動(dòng)學(xué)特性，增強(qiáng)其在體內(nèi)的穩(wěn)定性，從而長效且高效地預(yù)防OP 中毒。未來催化型生物清除劑的研究可聚焦于篩選對劇毒戰(zhàn)劑梭曼和Sp型OP具有強(qiáng)效水解作用的突變體，解決OP中毒解救的難點(diǎn)問題。

遞送技術(shù)應(yīng)用于生物清除劑具有明顯優(yōu)點(diǎn)：①可實(shí)現(xiàn)靶向性，通過對載體或藥物表面連接靶向分子，使藥物特異性到達(dá)膽堿能突觸與OP 作用，進(jìn)行高效解毒；②可降低生物抗毒劑的免疫原性，逃逸機(jī)體的免疫識別；③通過修飾藥物增大其分子質(zhì)量，避免被腎清除，使藥物在體內(nèi)長期存在，達(dá)到良好預(yù)防效果，或有助于中毒后體內(nèi)殘余OP 的清除；④在遞送過程中會對生物抗毒劑進(jìn)行修飾和固定，降低體內(nèi)環(huán)境因素對制劑的影響，保護(hù)抗毒劑結(jié)構(gòu)和性質(zhì)穩(wěn)定，提高制劑體內(nèi)穩(wěn)定性。這些優(yōu)勢為生物清除劑作為藥物用于治療和預(yù)防OP 中毒奠定了基礎(chǔ)。不過雖現(xiàn)有部分研究報(bào)道了生物清除劑的動(dòng)物體內(nèi)遞送，但要將其成功應(yīng)用于人體不僅要突破遞送技術(shù)自身的固有局限，還需進(jìn)行嚴(yán)格的安全性評價(jià)。未來遞送技術(shù)的發(fā)展，①要嘗試使用新型藥物遞送材料與技術(shù)遞送生物清除劑，在關(guān)注其遞送效果的同時(shí)，更要明確其在人體長期代謝安全；②對于現(xiàn)有遞送技術(shù)而言，遞送過程中要盡可能保留生物清除劑的原始活性并嘗試向毒性靶標(biāo)的特異性遞送，更快更準(zhǔn)地進(jìn)行解救；③使用FDA已批準(zhǔn)藥用輔料進(jìn)行初步人體遞送探索，使生物清除劑的成藥性更進(jìn)一步提高。

OP 依然在世界范圍內(nèi)作為農(nóng)藥和毒劑應(yīng)用，預(yù)防和解救OP 中毒損傷仍具有重要意義。生物清除劑因其高效和無二次污染等優(yōu)勢，是對抗OP 中毒最有潛力的選擇。藥物遞送技術(shù)不但可以解決生物清除劑體內(nèi)免疫原性強(qiáng)和作用時(shí)間短的問題，還可在穩(wěn)定生物清除劑空間結(jié)構(gòu)的同時(shí)增強(qiáng)其本身的催化活性，為生物清除劑從實(shí)驗(yàn)室研究轉(zhuǎn)向?qū)嶋H應(yīng)用搭建堅(jiān)實(shí)橋梁。尋找適宜的遞送技術(shù)，有效遞送生物清除劑，將成為預(yù)防和治療OP 中毒損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。