黎雨菲，羅露香，姜曉琳，黃嘉歡，張銘儒，楊全，程軒軒

（廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)研究室，國(guó)家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣州綜合試驗(yàn)站，廣東省南藥規(guī)范化種植與綜合開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006）

腹瀉是一種臨床常見(jiàn)的消化道疾病。近年來(lái)，全球疾病、損傷和風(fēng)險(xiǎn)因素負(fù)擔(dān)研究（Global Burden of Diseases，Injuries，and Risk Factors Study）分析數(shù)據(jù)顯示，腹瀉是造成＜5 歲幼童死亡的第5 大病因［1］。從病因?qū)W方面，腹瀉可分為感染性腹瀉和非感染性腹瀉兩大類(lèi)［2］。感染性腹瀉可由細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)等病原微生物引發(fā)，在細(xì)菌性腹瀉中大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）是發(fā)展中國(guó)家最常見(jiàn)的病原菌［2-6］。根據(jù)不同的生物學(xué)特性可將腹瀉性大腸桿菌分為腸致病性大腸桿菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、腸黏附性大腸桿菌和腸凝集性大腸桿菌［7-8］。這些大腸桿菌誘導(dǎo)腹瀉的途徑相似，即黏附于宿主細(xì)胞并定植，進(jìn)而破壞細(xì)胞骨架，釋放促炎細(xì)胞因子和趨化因子，募集活化炎癥細(xì)胞［7］。大腸桿菌性腹瀉是一種人畜共患病，臨床上多使用慶大霉素和土霉素等抗生素進(jìn)行治療。然而，抗生素不合理應(yīng)用引發(fā)的細(xì)菌耐藥性、不良反應(yīng)及藥源性疾病日趨嚴(yán)重［6，9］。在限制抗生素使用的情況下，采用中草藥治療感染性疾病日益受到關(guān)注［10］。中草藥具有多來(lái)源、多成分、多靶點(diǎn)等特點(diǎn)，不易產(chǎn)生耐藥性。多糖是一類(lèi)廣泛存在于植物中的天然高分子化合物，低毒或無(wú)不良反應(yīng)，具有免疫調(diào)節(jié)活性，已成為藥物開(kāi)發(fā)及畜牧養(yǎng)殖領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［10］。

辣蓼為蓼科植物水蓼（Polygonum hydropiperL.）的全草，具有祛風(fēng)利濕、散瘀止痛和殺蟲(chóng)等功效，主要用于治療腹瀉、胃腸炎、痢疾、跌打損傷、瘡疥和濕疹等癥［11］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，辣蓼提取物在體外對(duì)病原細(xì)菌（如糞腸球菌、肺炎克雷伯桿菌、大腸桿菌等）和真菌（如煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉等）表現(xiàn)出廣譜抗菌活性［12］；可通過(guò)增加抗氧化能力、抑制絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、NF-κB信號(hào)通路緩解腸道炎癥［13-14］；還具有鎮(zhèn)痛、清除自由基、降血糖、鎮(zhèn)靜和驅(qū)蟲(chóng)等藥理活性［15］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，辣蓼水提液能抑制大腸桿菌性腹瀉小鼠腸組織炎癥因子的釋放，促進(jìn)受損腸黏膜修復(fù)，進(jìn)而通過(guò)活性追蹤和導(dǎo)向分離初步確定中性多糖（neutral polysaccharide fromP.hydropiper，NPP）是辣蓼抗腹瀉的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，但作用機(jī)制尚不明確［16］。文獻(xiàn)報(bào)道，藥物抗腹瀉作用機(jī)制主要包括調(diào)節(jié)水和電解質(zhì)平衡、調(diào)節(jié)炎癥因子及其相關(guān)信號(hào)通路、干預(yù)胃腸激素分泌、促進(jìn)腸黏膜修復(fù)、改善腸道微生態(tài)和增強(qiáng)免疫力等［2，17-20］。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一門(mén)在整體水平上研究特定時(shí)空某一細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科。利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究疾病的分子機(jī)制，構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已成為醫(yī)藥學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［21-22］。本研究基于高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)探討NPP 對(duì)大腸桿菌性腹瀉小鼠十二指腸組織基因表達(dá)譜的影響，從轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平揭示NPP 治療大腸桿菌性腹瀉的潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

辣蓼采于江西省鷹潭市，經(jīng)廣東藥科大學(xué)楊全教授鑒定為蓼科植物水蓼的干燥全草，標(biāo)本保存于廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院標(biāo)本館。恩氟沙星（enrofloxacin，ENR；批號(hào)：120152526），佛山市北沙制藥有限公司；甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸（批號(hào)分別為：AF21051053，AF21071204，AF20110804，AF20060755，AF200-60854，AF20060753和AF20060751），成都埃法生物科技有限公司；木糖（批號(hào)：C12285705，純度＞98%），上海麥克林生化科技有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-pheny-3-methyl-5-pyrazolone，PMP），上海亨代勞商貿(mào)有限公司；三氟乙酸（TFA），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Trizol Reagent（批號(hào)：182805），美國(guó)Invitrogen公司；Evo M-MLV逆轉(zhuǎn)試劑盒Ⅱ（AG11711）和SYBR?Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR 試劑盒（AG11701），湖南艾科瑞生物工程有限公司；通用型組織固定液（批號(hào)：183218）、HE染液（批號(hào)：G1005）、分化液（批號(hào)：G1005-3）和返藍(lán)液（批號(hào)：G1005-4），武漢賽維爾生物科技有限公司；二乙胺基乙基纖維素-52（diethylamino ethyl cellulose-52，DEAE-52）和葡聚糖凝膠-75（Sephadex gel-75，Sephadex G-75），上海鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；牛肉浸膏（批號(hào)：3205105）、細(xì)菌學(xué)蛋白胨（批號(hào)：3205082）、技術(shù)瓊脂粉（批號(hào)：3207029），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）引物（表1），上海生工生物工程有限公司合成。致病性大腸桿菌（CICC 10663），中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。EX125ZH 十萬(wàn)分之一天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；LC-2030C高效液相色譜儀，日本島津有限公司；UV-3100PC 紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；HiseTM2500 高通量測(cè)序儀，美國(guó)Illumina 公司；Nano-100微量分光光度計(jì)，杭州奧盛儀器有限公司；C1000 TouchTMThermal cycler 熒光定量PCR 儀，美國(guó)Bio-Rad公司；BX53 研究級(jí)生物顯微鏡，日本Olympus公司。

Tab.1 Primer sequences of real-time quantitative PCR（RT-qPCR）

1.2 NPP的提取分離和純化

按照前期優(yōu)化的提取方法［16］，稱(chēng)取辣蓼粉末（過(guò)40 目篩）50 g，按料液比1∶38 加入蒸餾水，回流提取1.5 h，過(guò)濾，濾液濃縮至100 mL，離心取上清，按1∶4 體積比加入無(wú)水乙醇，靜置過(guò)夜，1200×g離心15 min后取沉淀，冷凍干燥得辣蓼粗多糖。

取1 g辣蓼粗多糖溶于蒸餾水中，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，將溶液上樣至DEAE-52 纖維素柱中，蒸餾水洗脫，流速1 mL·min-1，10 min 每管收集流分，苯酚-硫酸法檢測(cè)490 nm 吸光度，合并流分、濃縮、透析、冷凍干燥得NPP。稱(chēng)取適量NPP 溶于蒸餾水，超聲使溶解，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾后上樣至Sephadex G-75色譜柱中，蒸餾水洗脫，流速為每滴10 s，每管10 min，苯酚-硫酸法檢測(cè)，合并流分、濃縮、透析、冷凍干燥得純化的NPP。

1.3 NPP相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

取NPP 適量，加蒸餾水配制成5 g·L-1溶液，12 000×g離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm 微孔濾膜。以Dextran 系列不同相對(duì)分子質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品各2 mg 加蒸餾水配制成2 g·L-1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，10 000×g離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm 微孔濾膜。采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NPP 相對(duì)分子質(zhì)量。色譜條件：BRT105-104-102 串聯(lián)凝膠柱（8 mm×300 mm），RI-502 示差檢測(cè)器，流動(dòng)相為0.05 mol·L-1NaCl 溶液，流速0.6 mL·min-1，柱溫40℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.4 高效液相色譜法分析NPP單糖組成

1.4.1 樣品水解液制備

參照文獻(xiàn)方法［23］并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定NPP水解條件。精確稱(chēng)取NPP 50 mg，置10 mL 具塞試管中，加入2 mol·L-1TFA 溶液2 mL，混勻密封，于100℃水解6 h，冷卻至室溫，1100×g離心10 min，取上清液加1 mL 甲醇旋干（重復(fù)5 次），蒸干后加4 mL蒸餾水溶解，備用。

1.4.2 PMP衍生化

精密量取200 μL NPP 水解液，依次加入0.3 mol·L-1NaOH 和0.5 mol·L-1PMP 甲醇溶液各200 μL，混勻密封，70℃水浴60 min，冷卻至室溫，加入0.3 mol·L-1HCl 溶液200 μL，調(diào)節(jié)pH 至中性，混勻，用1 mL 氯仿萃取3 次，取水相經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，收集濾液備用。

1.4.3 空白溶液制備

精密量取蒸餾水200 μL，按1.4.2 方法進(jìn)行PMP衍生化，備用。

1.4.4 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱(chēng)取葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸4種單糖，加水定容，制成濃度分別為2.0，2.5，2.0 和2.0 g·L-1的混合對(duì)照品溶液。分別精確量取混合對(duì)照品溶液1.0，0.85，0.65，0.5，0.4，0.24和0.2 mL，加蒸餾水稀釋至1 mL，按1.4.2 方法進(jìn)行PMP衍生化，備用。

1.4.5 色譜條件

XSelectTMHSS T3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈∶磷酸鹽緩沖溶液（0.035 mol·L-1，pH6.8）18∶82（V/V），等度洗脫，流速1.0 mL·min-1，柱溫28℃，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.5 大腸桿菌懸液制備

將致病性大腸桿菌接種于20 mL 培養(yǎng)基（蛋白胨5.0 g，牛肉浸膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1.0 L，pH 7.0）中，37℃振蕩培養(yǎng)18～24 h，采用平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法［24］進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)菌液濃度為1.0×1012CFU·L-1。

1.6 動(dòng)物、模型制備和分組給藥

雄性BALB/c 小鼠120 只，6～8 周齡，體重18～22 g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（粵）2018-0002。小鼠預(yù)適應(yīng)7 d后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、模型+ENR 5 mg·kg-1組、模型+NPP 40 和80 mg·kg-1組，正常對(duì)照組20 只，其余每組25 只。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)［25］，除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠以10 mL·kg-1的給藥容積ip 給予1.5 制備的大腸桿菌菌液，每日1 次，連續(xù)8 d，正常對(duì)照組小鼠注射同體積生理鹽水。首次攻菌后4 h，小鼠腹瀉癥狀明顯，剖檢觀察到胃內(nèi)脹氣，腸道充滿黃色稀薄內(nèi)容物，腸壁變薄，顯示造模成功。給藥組于造模前2 d ig給藥，每日2次，連續(xù)給藥10 d；正常對(duì)照組和模型組小鼠ig 給予等量生理鹽水。于末次給藥12 h 后，各組隨機(jī)選取10 只小鼠麻醉后處死，取十二指腸組織，部分樣品迅速置液氮中保存，部分樣品用通用型組織固定液固定，剩余樣品置-80℃冰箱保存。

1.7 HE染色觀察十二指腸病理形態(tài)

取1.6 制備的固定液固定的小鼠十二指腸組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、制片、HE 染色、中性樹(shù)膠封片后，置顯微鏡下觀察病理形態(tài)。

1.8 小鼠十二指腸轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與數(shù)據(jù)分析

從正常對(duì)照組、模型組和模型+NPP 80 mg·kg-1組中隨機(jī)各取3只小鼠十二指腸組織樣本，加Trizol裂解液提取總RNA 用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。用帶有Oligo（dT）的磁珠富集具有polyA 尾的mRNA，并進(jìn)行隨機(jī)打斷，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 鏈，經(jīng)過(guò)末端修復(fù)、加A 尾及連接測(cè)序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫(kù)的構(gòu)建。將構(gòu)建好的測(cè)序文庫(kù)用IlluminaHiSeqTM進(jìn)行測(cè)序。文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

將測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)（raw data）經(jīng)過(guò)去除接頭、引物及低質(zhì)量數(shù)據(jù)，獲得待分析數(shù)據(jù)（clean data），并將過(guò)濾得到的待分析數(shù)據(jù)與參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)。采用FPKM（fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。采用DESeq2 方法篩選出正常對(duì)照組、模型組和NPP 組小鼠十二指腸組織的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEG），篩選標(biāo)準(zhǔn)為：錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05 且差異倍數(shù)|log2（fold change）|≥2。對(duì)DEG 進(jìn)行GO 功能分類(lèi)與富集、KEGG 信號(hào)通路富集分析以及趨勢(shì)分析。

1.9 RT-qPCR 檢測(cè)小鼠十二指腸趨化因子家族和Toll樣受體信號(hào)通路中目標(biāo)基因mRNA表達(dá)

采用Trizol 裂解液提取正常對(duì)照組和模型組十二指腸組織總RNA，紫外法檢測(cè)RNA 濃度，按Evo M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ操作說(shuō)明合成cDNA。隨機(jī)選取8 個(gè)DEG 進(jìn)行RT-qPCR 驗(yàn)證，以β 肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，55℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct方法計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示，采用SPSS 23.0 軟件，兩組間比較用Dunnettt檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NPP的分離純化和相對(duì)分子質(zhì)量

將水提醇沉法制備的辣蓼粗多糖進(jìn)行DEAE-52 柱色譜分離，蒸餾水洗脫，以管數(shù)為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制流出曲線（圖1A），收集流分、濃縮、透析、凍干后得NPP。將NPP 繼續(xù)進(jìn)行SephadexG-75 柱色譜分離，蒸餾水洗脫，繪制洗脫曲線（圖1B），得純化NPP。采用HPLC 法測(cè)得NPP 的數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量為Mn=6305，重均相對(duì)分子質(zhì)量Mw=7434，分布寬度D=1.18。

Fig.1 Elution curves of crude polysaccharide on DEAE-52 column（A）and neutral polysaccharide from P.hydropiper（NPP）on Sephadex G-75 column（B）by phenolsulfuric acid method.

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性關(guān)系

以各單糖對(duì)照品質(zhì)量濃度（x，mg·L-1）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸的回歸方程分別為：y=13682x-315246（R2=0.9995），y=17616x-124149（R2=0.9998），y=17200x- 281840（R2=0.9996）和y=12402x-199125（R2=0.9996），4 種單糖的線性范圍分別為：75～2000 mg·L-1，80～2000 mg·L-1，72～300 mg·L-1和8～200 mg·L-1。

2.2.2 精密度

連續(xù)測(cè)定6 次的葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸峰面積的RSD 值分別為0.26%，0.16%，1.31%和0.85%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性

分別于0，4，8，12，18，24 h測(cè)得葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸峰面積的RSD 值分別為0.28%，0.50%，0.76%和0.29%。表明NPP 水解液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復(fù)性

葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸峰面積的RSD 值分別為0.52%，2.22%，1.65%和1.65%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 加樣回收率

葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸的平均加樣回收率分別為99.03%，102.41%，99.10%和100.47%；RSD分別為0.67%，0.95%，1.79%和2.42%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 NPP的單糖組成分析

NPP 主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸組成，各單糖摩爾比為13.66∶10.33∶2.34∶1.00，此外亦含有少量木糖（圖2）。

2.4 NPP對(duì)大腸桿菌性腹瀉小鼠十二指腸病理形態(tài)的影響

正常對(duì)照組小鼠十二指腸組織結(jié)構(gòu)清晰，黏膜層、肌層、漿膜層清晰可見(jiàn)，腸絨毛豐富，排列緊密，絨毛上皮完整，肌層肌纖維形態(tài)正常。模型組固有層水腫，結(jié)構(gòu)疏松；較多腸腺上皮細(xì)胞水腫變性，胞質(zhì)疏松淡染，少量腸腺上皮細(xì)胞點(diǎn)狀壞死或凋亡。模型+ENR 組黏膜層腸腺豐富，排列緊密，固有層輕度水腫，結(jié)締組織疏松，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型+NPP 40 mg·kg-1組十二指腸組織結(jié)構(gòu)清晰，黏膜層少量毛細(xì)血管淤血，少量腸腺腔內(nèi)可見(jiàn)嗜酸性小團(tuán)塊。模型+NPP 80 mg·kg-1組黏膜層、肌層、漿膜層清晰可見(jiàn)，排列緊密，腸絨毛豐富，絨毛上皮完整，固有層內(nèi)少量毛細(xì)血管淤血，黏膜層少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3）。

2.5 小鼠十二指腸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估與比對(duì)分析

通過(guò)Illumina Hiseq 2500 平臺(tái)完成正常對(duì)照組、模型組、模型+NPP 80 mg·kg-1組各3 個(gè)隨機(jī)十二指腸組織樣本的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。原始數(shù)據(jù)過(guò)濾后，9 個(gè)樣本待分析數(shù)據(jù)的數(shù)值大于30 的堿基占總體堿基的百分比（Q30）均高于93%，待分析數(shù)據(jù)比率均高于98%，比對(duì)到基因組上數(shù)據(jù)（clean reads rate）的比率均高于90%，比對(duì)到唯一位置的數(shù)據(jù)（uniquely mapped reads）比率均高于89%，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量較高，符合后續(xù)分析要求（表2）。

Fig.2 High performance liquid chromatography（HPLC）of blank control（A），mixed monosaccharide control（B）and NPP（C）. HPLC separation was accomplished on an XSelect? HSS T3 C18 column（4.6 mm×250 mm，5 μm）with a mobile phase composed of acetonitrile 0.035 mol·L-1 phosphate buffer solution（18∶82，V/V）at a flow rate of 1.0 mL·min-1. 1：galacturonic acid；2：glucose；3：galactose；4：xylose；5：arabinose.

2.6 小鼠十二指腸組織DEG的篩選

與正常對(duì)照組比較（圖4A），模型組共有1020個(gè)DEG，其中587 個(gè)上調(diào)，433 個(gè)下調(diào)；與模型組比較（圖4B），模型+NPP組共有960個(gè)DEG，其中385個(gè)上調(diào)，575個(gè)下調(diào)。與正常對(duì)照組相比，在模型組上調(diào)，經(jīng)NPP 干預(yù)后下調(diào)的基因有631 個(gè)；在模型組下調(diào)，經(jīng)NPP 干預(yù)后上調(diào)的基因有498 個(gè)（圖5）。表明致病性大腸桿菌可導(dǎo)致小鼠十二指腸內(nèi)較多基因表達(dá)水平的改變，NPP 對(duì)這些基因的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。

Fig.3 Effect of NPP on duodenal pathomorphology in mice with Escherichia coli（E.coli）-induced diarrhea. Except for the normal control group，the mice in other groups were ip given enteropathogenic E.coli（EPEC，1.0×1012 CFU·L-1，10 mL·kg-1）suspension once a day for 8 days. The mice in the normal control group were ip given saline. Two days before EPEC induction，the mice in the model+enrofloxacin（ENR）and model+NPP groups were ig given NPP twice a day for 10 days，and those in the model and normal control groups were ig given the same volume saline. Arrows show punctuate necrosis and apoptosis in intestinal glandular epithelial cells（in red），inflammatory cell infiltration and exudation，eosinophilic cytoplasm（in yellow），capillary congestion and edema in epithelial cells（in black）.

Tab.2 Statistical results of transcriptome sequencing data of mouse duodenum

Fig.4 Volcanic maps of differentially expressed genes（DEGs）. See Fig.3 for the mouse treatment. Compared with the normal control group，433 genes（green）were down-regulated，and 587 genes（red）were up-regulated in the model group （A）. Compared with the model group，575 genes（green）were down-regulated，and 385 genes（red）were up-regulated in the model+NPP 80 mg·kg-1 group（B）. Nodiff：non-differential genes；FDR：false discovery rate.

2.7 GO富集分析DEG

模型組與正常對(duì)照組相比（圖6A），DEG 富集于41 個(gè)功能項(xiàng)中，包括20 個(gè)生物學(xué)過(guò)程，13 個(gè)細(xì)胞組分和8 個(gè)分子功能。模型+NPP 80 mg·kg-1組與模型組相比（圖6B），DEG 同樣富集于20 個(gè)生物學(xué)過(guò)程、13 個(gè)細(xì)胞組分和8 個(gè)分子功能。在2 個(gè)比較組中，DEG 參與的生物學(xué)過(guò)程主要包括細(xì)胞過(guò)程、單有機(jī)體過(guò)程、代謝過(guò)程、應(yīng)激反應(yīng)、發(fā)育過(guò)程和生物調(diào)節(jié)等；參與的細(xì)胞組分主要包括細(xì)胞、細(xì)胞器、膜、胞外區(qū)等；參與的分子功能主要包括結(jié)合、催化活性和分子功能調(diào)節(jié)因子等。

Fig.5 Trend maps of DEGs.

2.8 KEGG富集分析DEG

KEGG 分析結(jié)果顯示（圖7），大部分DEG 歸屬于代謝、有機(jī)系統(tǒng)和人類(lèi)疾病途徑。模型組與正常對(duì)照組相比，DEG 主要富集于代謝相關(guān)通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、吞噬體、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路和磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3 kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路等。NPP組與模型組相比，DEG主要富集于代謝相關(guān)通路、TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、PI3K-Akt信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路等。可見(jiàn)與炎癥相關(guān)的信號(hào)通路在2個(gè)對(duì)比組中均有顯著富集。

Fig.6 GO enrichment analysis of DEGs. A：DEGs between the model and the normal control groups；B：DEGs between the model+NPP 80 mg·kg-1 and the model groups.

Fig.7 KEGG enrichment analysis of DEGs. A：DEGs between the model group and the normal control group；B：DEGs between the model+NPP 80 mg·kg-1 group and the model group. TNF：tumor necrosis factor；PPAR：peroxisome proliferator-activated receptor；PI3K：phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3 kinase；Akt：protein kinase B.

2.9 DEG的驗(yàn)證

KEGG 分析結(jié)果顯示，DEG 主要富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路等炎癥相關(guān)信號(hào)通路。為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，從趨化因子家族和Toll樣受體信號(hào)通路中隨機(jī)選擇8 個(gè)DEG，分別為C-C 趨化因子配體7（C-C motif chemokine ligand 7，CCL7）、CCL22、CCL2、C-X-C 趨化因子配體5（C-X-C motif chemokine ligand 5，CXCL5）、CXCL10、CXCL1、C-X-C 趨化因子受體2（C-X-C motif chemokine receptor 2，CXCR2）、Toll 樣受體2（toll-like receptor 2，TLR2），采用RT-qPCR 法對(duì)上述DEG 在模型組的mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖8 所示。與正常對(duì)照組比較，模型組CCL7，CXCR2，CXCL5，CXCL10，CXCL1，TLR2和CCL2mRNA 表達(dá)水平上調(diào)，而CCL22mRNA 表達(dá)水平下調(diào)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與RT-qPCR 檢測(cè)的上述基因表達(dá)差異倍數(shù)一致（圖9），表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可靠、重復(fù)性好。

Fig.8 Levels of DEGs mRNA in duodenal tissue of mice in normal control group and model group by RT-qPCR. See Fig.3 for the treatment.±s，n=3. ＊P＜0.05, compared with normal control group.

Fig.9 Verification of the RNA-seq results of DEGs expression by RT-qPCR. Logarithm of gene expression fold change detected by RNA-seq and RT-qPCR，respectively.

3 討論

本研究采用HPLC 法測(cè)得NPP 數(shù)均和重均相對(duì)分子質(zhì)量分別為6305 和7434。通過(guò)PMP 柱前衍生化HPLC 法分析發(fā)現(xiàn)，NPP 主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖及半乳糖醛酸組成，在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為99.03%～102.41%，各單糖摩爾比為13.66∶10.33∶2.34∶1.00。本實(shí)驗(yàn)分離得到的NPP 中含少量半乳糖醛酸，可能與采用DEAE-52 纖維素柱色譜進(jìn)行純化時(shí)，水洗脫用水量較多或上樣量較多有關(guān)。采用ip給予致病性大腸桿菌的方法建立腹瀉小鼠模型，HE染色結(jié)果表明，NPP 對(duì)腹瀉小鼠的受損十二指腸具有明顯修復(fù)作用。為進(jìn)一步探討NPP 的抗腹瀉作用機(jī)制，采用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)獲得了正常組、模型組和模型+NPP 80 mg·kg-1各3 個(gè)隨機(jī)十二指腸樣本的9個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。各組平均待分析數(shù)據(jù)為26.89×106條，Q30＞93.4%，各組平均比對(duì)率＞91.1%。通過(guò)對(duì)DEG進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，除代謝相關(guān)通路外，這些基因主要涉及多條與炎癥相關(guān)的信號(hào)通路：趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路、Toll樣受體信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路等，說(shuō)明NPP抗大腸桿菌性腹瀉的作用機(jī)制具有多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

細(xì)胞因子與膜受體的相互作用參與到疾病或藥物調(diào)節(jié)機(jī)體狀態(tài)的生命活動(dòng)中，也是目前眾多研究者重點(diǎn)關(guān)注的信號(hào)通路之一［26-29］。趨化因子是細(xì)胞因子超家族成員之一，是一類(lèi)可趨化細(xì)胞定向移動(dòng)的小分子蛋白質(zhì)，大多數(shù)趨化因子屬于CC 和CXC 2 個(gè)亞家族。趨化因子能參與炎癥細(xì)胞的介導(dǎo)和招募過(guò)程，誘導(dǎo)病灶組織的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，在多種炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［30-32］。TLR 是一類(lèi)參與天然免疫的模式識(shí)別受體，當(dāng)病原體入侵時(shí)，宿主體內(nèi)的TLR 可引發(fā)一系列信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)［33］。本研究的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示在模型組中，TLR2和趨化因子CCL7，CXCR2，CXCL5，CXCL10，CXCL1和CCL2mRNA表達(dá)水平上調(diào)，CCL22mRNA表達(dá)水平下調(diào)。采用RT-qPCR法對(duì)上述關(guān)鍵DEG表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果。CXCR2 是CXCL1，CXCL2，CXCL3 和CXCL5等多種趨化因子受體，可募集中性粒細(xì)胞向炎癥區(qū)域轉(zhuǎn)移，與機(jī)體炎癥免疫過(guò)程密切相關(guān)；CXCR2與其配體相互作用形成的信號(hào)軸在多種疾病中發(fā)揮作用［34］。近年來(lái)研究表明，CXCL1/CXCR2 生物軸在骨癌痛、化療藥物致疼痛、坐骨神經(jīng)損傷致慢性疼痛的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中以及炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中均發(fā)揮重要作用［35-38］。CXCL5/CXCR2 生物軸在機(jī)體抗感染、抗病毒免疫過(guò)程、腸道炎癥性疾病的調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用，CXCL5 也是表達(dá)于克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎和急性闌尾炎小腸黏膜上皮細(xì)胞最主要的CXC 趨化因子［39-40］。已有研究報(bào)道TLR2在宿主對(duì)大腸桿菌感染的免疫和炎癥反應(yīng)中起重要作用［41］。

綜上，NPP 可修復(fù)大腸桿菌性腹瀉小鼠的受損腸黏膜，緩解炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)CXCL1/CXCR2、CXCL5/CXCR2生物軸以及TLR2介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路有關(guān)。后期還將對(duì)DEG富集的關(guān)鍵信號(hào)通路進(jìn)行深入研究，采用分子生物學(xué)技術(shù)從基因和蛋白水平發(fā)現(xiàn)NPP抗大腸桿菌性腹瀉的作用機(jī)制，為辣蓼的臨床應(yīng)用和資源開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。