王佳麗,周 寧,陳 曦,岳 華,湯 承

(西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,成都 610041)

犬腺病毒(canine adenovirs, CAV)屬于腺病毒科哺乳動物腺病毒屬,是一種無囊膜、線狀的雙鏈DNA病毒,具有兩種血清型:I型(CAV-1)、II型(CAV-2)[1]。CAV-1主要引起犬傳染性肝炎、狐貍腦炎;而CAV-2主要引起犬傳染性氣管支氣管炎,臨床表現(xiàn)為高熱、流涕、咳嗽等[2],還可能與致死性腹瀉病相關(guān)[3]。除了感染犬以外,CAV-2還有感染浣熊[4]、棕熊[5]、紅狐[6]以及狼[7]等野生動物的報道。1962年,Dithfield等[8]從呼吸道病犬首次分離出CAV-2毒株;1988年,Macartney等[3]從犬腹瀉樣本中分離出CAV-2,證實了可在犬的消化道中增殖;2009年,張洋等[9]首次從犬子宮上皮組織中分離出CAV-2,表明了該病毒有多種組織嗜性。據(jù)報道,CAV-2與犬呼吸道冠狀病毒、犬副流感病毒、犬瘟熱病毒等病毒存在混合感染[10]。

當前,GenBank中僅有3條CAV-2全基因組,分別來源于美國、加拿大、日本,基因組全長約31 000 bp。該病毒衣殼蛋白主要由Fiber、Hexon和Penton組成,Fiber由凸起、軸、尾三部分構(gòu)成,可介導(dǎo)病毒與宿主細胞受體間融合,在感染過程中起到關(guān)鍵作用[11];Hexon含量最多,是決定腺病毒抗原性的主要蛋白;Penton主要發(fā)揮內(nèi)化作用[12],并對病毒存活功能穩(wěn)定性有著重要作用。E3基因?qū)儆谠缙谵D(zhuǎn)錄基因,主要編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白[13],具有免疫抑制的作用[14]。此外,E3基因是CAV-2分子檢測的靶基因[15]。

目前國內(nèi)關(guān)于CAV-2的病原流行病學(xué)資料不多。薛林杰[16]對河南省2018—2020年采集的1 410份犬糞便樣本進行CAV-2檢測,結(jié)果顯示陽性率為2.48%;張發(fā)明等[17]對成都地區(qū)2016—2017年出現(xiàn)呼吸道癥狀的78份犬鼻拭子以及消化道癥狀的213份犬肛門拭子進行CAV-2檢測,結(jié)果顯示鼻拭子檢出率為17.95%,糞便樣本檢出率為15.96%;冀君(Ji)等[18]對河南、湖北、江蘇三省2017—2019年的224份犬腹瀉樣本進行CAV-2檢測,陽性率為8.5%。上述資料顯示不同地方CAV-2在犬中的流行率差異較大,但未見關(guān)于國內(nèi)CAV-2基因組研究的報道,其分子特征和遺傳演化仍待調(diào)查。本研究的目的是對川渝部分地區(qū)CAV-2的流行情況進行調(diào)查,并對流行毒株的基因組及生物學(xué)特性進行探究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 MDCK細胞由本實驗室保存;DMEM培養(yǎng)基、DNA提取試劑盒購自Aidlab Biotech 北京有限公司;PCR PremisTaq酶購自南京諾唯贊有限公司;胎牛血清購自武漢普諾賽生物;Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG、DAPI封片液購自Abbkine公司;大腸桿菌感受態(tài)細胞、pMD19-T 克隆載體購自寶生物工程(大連)有限公司;兔抗CAV-2高免血清由本實驗室保存。

1.1.2 樣本來源 2021—2022年,從重慶、成都、西昌7個寵物醫(yī)院,共采集121份患呼吸道疾病的犬鼻咽拭子,其中重慶30份、成都43份、西昌48份。

1.2 DNA的提取

將樣本拭子放入2 mL離心管中,加入適量含有1%雙抗的PBS溶液,振蕩渦旋混勻以后置于4 ℃,7 000 r·min-1離心10 min后吸取200 μL上清液,采用DNA提取試劑盒提取病毒DNA。

1.3 檢測CAV-2的PCR方法

選取CAV-2參考毒株U77082的E3基因作為靶基因,使用Primer5設(shè)計一對CAV-2特異性檢測引物,F:5′-CCTCAACGAGATGCCTCTTCCCA-3′;R:5′-CATGGGCCTGATTTTGTTGTTT-3′,目的片段736 bp。PCR擴增體系配比:2×PCR PremixTaq12.5 μL,ddH2O 8.5 μL,上、下游引物各1 μL,模板DNA 2 μL;反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸70 s,35個循環(huán);72 ℃終末延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后,取PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳(120 V,25 min)進行鑒定。所有陽性樣本的PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD19-T載體上,再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中,陽性質(zhì)粒送往北京擎科生物有限公司測序及分析。

1.4 病毒的分離

選取3份CAV-2陽性樣本,將其上清用0.45 μm的濾器過濾處理后,吸取200 μL上清液接種于長成單層MDCK細胞的六孔板上;同時設(shè)置陰性對照,接種等量的DMEM培養(yǎng)基;分離的病毒液經(jīng)噬斑純化3次后,進行病毒的鑒定及TCID50的測定。

1.5 病毒的鑒定

1.5.1 PCR鑒定 吸取200 μL純化后的病毒液提取DNA,采用“1.3”中的方法進行CAV-2檢測。

1.5.2 間接免疫熒光試驗 病毒液接毒48 h后,棄去培養(yǎng)液,使用PBS清洗三次后,加入冰丙酮放入4 ℃冰箱固定10 min,棄去丙酮使用PBS清洗后,加入5%的BSA溶液放入37 ℃培養(yǎng)箱封閉30 min,棄去BSA溶液后,將兔抗CAV-2血清作為一抗(1∶500稀釋),FITC標記山羊抗兔IgG為二抗(1∶3 000稀釋),進行免疫熒光,同時設(shè)置未接毒的細胞進行同步操作,作為陰性對照。

1.5.3 電鏡觀察 收集純化后的病毒液,10 000 r·min-1離心5 min,取上清送往成都里來生物有限公司進行透射電鏡制樣、觀察,觀察病毒形態(tài)及拍照。

1.6 E3基因自然缺失分離株對幼犬致病性

自某養(yǎng)殖場購買6只1月齡中華田園犬,未接種疫苗、已驅(qū)蟲,經(jīng)檢測犬細小病毒、犬冠狀病毒、犬副流感、犬瘟熱、CAV-2均為陰性,將幼犬平均分為2組,一組經(jīng)口鼻接種2 mL病毒滴度為10-9.46TCID50·0.1 mL-1的分離毒株病毒液;另一組接種等量的DMEM培養(yǎng)基;詳細記錄幼犬每日體溫以及臨床表現(xiàn),每日采集鼻咽拭子與肛門拭子,采用熒光PCR方法[19]檢測排毒情況。

1.7 分離株基因組擴增與拼接

根據(jù)GenBank中CAV-2全基因參考序列U77082,使用Primer 5設(shè)計18對基因組擴增引物,用于擴增分離毒株的全基因,相關(guān)引物信息見表1。獲得的PCR的產(chǎn)物純化后連接到pMD19-T載體上,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞后,挑取單個菌落送往北京擎科生物公司進行測序,最后使用Seqman軟件將所有測序結(jié)果拼接,獲得分離毒株全基因組序列。

表1 CAV-2全基因擴增引物Table 1 Primers are used to amplify whole gene of CAV-2

1.8 分離毒株的序列分析

將本研究獲得的CAV-2全基因、E3基因、Fiber基因、Hexon基因、Penton基因運用MEGA7軟件分別與其對應(yīng)參考序列的核苷酸及氨基酸進行多重比對,并采用最大似然法建立CAV-2全基因、E3基因遺傳進化樹,進行系統(tǒng)發(fā)育分析。采用RDP4.39軟件對本研究獲得的CAV-2全基因組進行重組分析。

2 結(jié) 果

2.1 CAV-2的檢測結(jié)果

121份樣本中,36份檢測為CAV-2,陽性率為29.8%,測序結(jié)果進一步證實了檢測結(jié)果的準確性。其中成都地區(qū)陽性率為27.8%、西昌地區(qū)陽性率為35.4%、重慶地區(qū)陽性率為23.3%,表明CAV-2已在上述地區(qū)流行,詳見表2。值得注意的是,36份CAV-2陽性樣本中,有25個毒株的E3基因存在同樣的9個核苷酸的連續(xù)缺失(1 035～1 043 nt),導(dǎo)致4個氨基酸的缺失(345～348 aa)。

表2 CAV-2檢測結(jié)果Table 2 The results of detecting CAV-2

2.2 E3基因片段的進化分析

選取GenBank中全部45條CAV-2E3基因片段和本研究獲得的36條長度為736 bp的E3基因片段(GenBank登錄號:OP018862～OP018896),采用最大似然法建立進化樹,結(jié)果顯示:本研究所獲得的36條E3基因序列共分為兩大支,其中11條序列與GenBank中現(xiàn)有CAV-2毒株序列聚為一大支,另25條E3基因部分缺失毒株序列則獨立聚為一大支,詳見圖1。

● .本研究獲得序列●. Sequences obtained in this study圖1 CAV-2 E3基因核苷酸序列進化樹Fig.1 Evolutionary tree of CAV-2 E3 gene nucleotide sequence

2.3 病毒的分離與鑒定

樣本上清液接種于MDCK細胞,盲傳3代以后,其中1份出現(xiàn)了細胞病變,連續(xù)傳遞至第5代后,細胞培養(yǎng)物在48 h左右出現(xiàn)穩(wěn)定病變,表現(xiàn)為細胞圓縮、聚集呈典型的葡萄串狀病毒,如圖2B。經(jīng)測定,該分離株純化后細胞半數(shù)感染值為10-9.46TCID50·0.1 mL-1。

經(jīng)PCR和間接免疫熒光試驗及電鏡鑒定該分離株為CAV-2 。間接免疫熒光試驗結(jié)果顯示接毒的細胞胞漿內(nèi)可見特異性的綠色熒光(圖2C);電鏡下可見排列整齊、無囊膜、大小約80 nm的典型腺病毒樣粒子(圖2D)。

綜上,本研究成功分離出一株CAV-2E3基因自然缺失株,命名為G1/China/CAV-2。

2.4 G1/China/CAV-2株對幼犬致病性

2.4.1 臨床表現(xiàn) G1/China/CAV-2株經(jīng)口鼻感染幼犬3 d后,3只幼犬均出現(xiàn)體溫增高、流鼻涕、打噴嚏的臨床癥狀,體溫變化詳見圖3A;有2只第5天出現(xiàn)咳嗽的癥狀。第7天后感染犬臨床癥狀逐漸減輕,第9天恢復(fù)正常。陰性組3只幼犬體溫、臨床表現(xiàn)正常。

A .試驗犬體溫;B.試驗犬排毒情況A. Temperature detection of puppies; B. Detoxification of the puppies圖3 G1/China/CAV-2攻毒后幼犬的體溫和排毒情況Fig.3 Temperature changes and detoxification of the puppies post challenge

2.4.2 排毒情況 攻毒組幼犬在感染后第2天開始排毒,鼻咽拭子、糞便同時檢測到病毒的排出;鼻咽排毒量在第5天達到高峰,第11天結(jié)束;糞便排毒第4天達到高峰,第8天排毒結(jié)束。排毒情況詳見圖3B。

2.5 G1/China/CAV-2株基因組分析

2.5.1 G1/China/CAV-2完整基因組特征 本研究成功獲得G1/China/CAV-2株完整基因組(GenBank登錄號:OP060355),與GenBank中全部3條CAV-2全基因組核苷酸相似性為98.8%～98.9%。與已知CAV-2全基因組相比,本研究分離毒株除了在E3基因第1 035～1 043 nt缺失外,在基因組5′端第341 nt有一個堿基G插入、E1A基因上第531～542 nt缺失、DNA polymerase上第4 034～4 036 nt缺失、基因組5′第28 232 nt處,有一個堿基G插入。與GenBank全部33條Fiber蛋白完整序列相比,G1/China/CAV-2株有2個獨特的氨基酸位點突變(F220S、K493R);與GenBank全部35條Hexon蛋白完整序列相比,有1個獨特的氨基酸位點突變(A559T);Penton蛋白無獨特的氨基酸位點突變,遺傳穩(wěn)定。

選取GenBank中全部3條CAV-2全基因組,以及3條CAV-1和其他物種2型腺病毒全基因序列作為外圍毒株,采用最大似然法建立進化樹,結(jié)果顯示G1/China/CAV-2株與CAV-2參考序列聚為一大支,但單獨聚為一小分支,見圖4。經(jīng)RDP4.39軟件分析未見重組事件發(fā)生。

●.本研究所獲得的CAV-2基因組●. Complete genome of CAV-2 obtained in this study圖4 CAV-2全基因的最大似然法進化樹Fig.4 Maximum likelihood evolutionary tree of CAV-2 complete genome

2.5.2 G1/China/CAV-2株E3基因特征 G1/China/CAV-2株的E3基因共1 086 bp,與GenBank中全部3條完整CAV-2E3基因序列核苷酸之間相似性為97.0%～97.4%、氨基酸相似性為95.3%～95.9%。與已知E3基因完整序列比對后發(fā)現(xiàn):G1/China/CAV-2株除了E3蛋白有4個氨基酸連續(xù)缺失(345～348 aa)外,還有9個獨特的氨基酸位點突變,見表3?；贕1/China/CAV-2株完整E3基因的進化樹與基因組進化樹一致(結(jié)果未展示)。

表3 分離毒株G1/China/CAV-2 E3蛋白氨基酸位點突變Table 3 Amino acid site mutation of E3 protein of the isolate G1/China/CAV-2

3 討 論

犬呼吸道疾病是犬的常見病和多發(fā)病,感染性因素是主要原因,常見的病原包括病毒、細菌、支原體等[20];CAV-2是犬重要的呼吸道病毒之一[21],但國內(nèi)對其研究不多。本研究對2021—2022年川渝部分地區(qū)患呼吸道疾病的犬鼻咽拭子進行CAV-2檢測的檢出率為29.8%,表明CAV-2已在川渝部分地區(qū)廣泛流行,其與犬呼吸道疾病的關(guān)系值得進一步關(guān)注。與薛林杰[16]對河南省犬糞便樣本的CAV-2檢出率為2.48%以及冀君等[18]對河南、湖北、江蘇三省犬腹瀉樣本的CAV-2檢出率為8.5%相比,川渝部分地區(qū)鼻咽拭子的CAV-2檢出率明顯更高,可能與地域差異或樣本類型有關(guān)。本研究成都地區(qū)的檢出率為27.8%,高于張發(fā)明等[17]對成都地區(qū)2016—2017年犬鼻拭子的CAV-2檢出率(17.75%),提示犬呼吸道樣本中CAV-2的流行有上升的趨勢,值得進一步關(guān)注。

有趣的是,本研究獲得的36條E3基因片段中,有25條的E3基因出現(xiàn)9個核苷酸的連續(xù)缺失,導(dǎo)致4個氨基酸的缺失(347～349 aa),占陽性樣本69.4%,表明E3基因自然缺失株已成為當前川渝部分地區(qū)CAV-2優(yōu)勢流行毒株。E3基因序列相對保守,但是近年國外報道了E3基因發(fā)生點突變現(xiàn)象[22-23],本研究發(fā)現(xiàn)E3基因缺失株,說明當前CAV-2E3基因已經(jīng)出現(xiàn)變異現(xiàn)象。腺病毒E3基因編碼的蛋白可以阻斷MHC-Ⅰ類限制性抗原的呈遞以減少細胞毒性T細胞對病毒的殺傷作用,以及抑制免疫介質(zhì)發(fā)揮作用,從而使病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊[13]。因此,E3基因突變可能會影響其免疫逃避能力,使得病毒粒子更易入侵動物機體,加大了臨床防控的難度。本研究E3基因自然缺失毒株有4個氨基酸缺失和9個獨特的氨基酸突變,是否會影響該病毒的免疫逃避功能仍需進一步研究。此外,E3基因作為CAV-2檢測的靶基因[24],核苷酸突變可能會影響臨床檢測的準確性,延誤動物的疾病診斷與治療,臨床上需要高度關(guān)注。

作者成功分離到一株E3基因自然缺失毒株G1/China/CAV-2,該毒株口鼻感染幼犬后引起明顯的呼吸道癥狀,包括打噴嚏、流鼻涕以及咳嗽,未觀察到腹瀉癥狀,與其他學(xué)者的人工感染結(jié)果相似[25-26];也有CAV-2毒株人工感染幼犬后出現(xiàn)腹瀉[27-28]或致死[29]的報道,表明CAV-2不同毒株引起的臨床癥狀差異較大。但遺憾的是,所有人工感染試驗均無毒株基因組信息的報道,無法分析其癥狀多樣化的分子基礎(chǔ)。因此,進一步加強基因組研究對探究CAV-2毒株致病性差異是非常必要的。

本研究成功獲得了分離毒株G1/China/CAV-2的基因組序列,這是首次獲得中國CAV-2毒株的基因組序列?；诨蚪M的進化分析顯示,G1/China/CAV-2在進化樹上單獨位于一分支,和已知的CAV-2有明顯的遺傳距離,顯現(xiàn)了獨特的遺傳進化方式。進一步分析發(fā)現(xiàn)該毒株除了E3基因的獨特突變外,還在Fiber、Hexon和E1A等蛋白有獨特的氨基酸突變,這些氨基酸突變對CAV-2生物學(xué)特性的影響還需進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究對2021—2022年川渝部分地區(qū)呼吸道病犬的鼻拭子進行了CAV-2檢測,檢出率為29.8%,表明CAV-2已在川渝部分地區(qū)廣泛流行,該病毒與犬呼吸道疾病的關(guān)系值得進一步關(guān)注。首次發(fā)現(xiàn)E3基因自然缺失毒株,且該毒株已成為川渝部分地區(qū)優(yōu)勢流行毒株。成功分離出一株E3基因自然缺失毒株,人工感染幼犬后引起典型的呼吸道癥狀;獲得該毒株的完整基因組,這是首次獲得中國CAV-2毒株基因組。本研究結(jié)果有助于了解CAV-2的流行及遺傳進化。