蔣春艷，洪鵬翔，張雙照，李春維，周美玲，李建彬，江巍

（1龍巖市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建龍巖 364000；2福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州 350002）

0 引言

除草劑是所有農(nóng)藥中的一個(gè)重要的組成成分，施用除草劑可使糧食增產(chǎn)10%以上，國(guó)際上常將除草劑在農(nóng)藥中所占的比例作為衡量國(guó)家農(nóng)藥市場(chǎng)的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)[1]。除了防控雜草的危害，除草劑在一定程度上也會(huì)影響農(nóng)作物的生長(zhǎng)，往往會(huì)出現(xiàn)農(nóng)作物生理及生長(zhǎng)不正常的現(xiàn)象，如葉片褪綠、植株矮化等，這也是廣泛意義上的除草劑藥害[2]。在花生生產(chǎn)中，農(nóng)民缺乏除草劑使用知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)，為了盡早看到藥效，經(jīng)常用藥過量，從而更容易導(dǎo)致除草劑藥害的發(fā)生[3]，一般情況下對(duì)花生的產(chǎn)量和品質(zhì)影響不大；但藥害嚴(yán)重且不可恢復(fù)時(shí)對(duì)花生產(chǎn)量影響較大，甚至?xí)斐山^產(chǎn)[4]。

作物出現(xiàn)除草劑藥害后，往往會(huì)影響某些生理指標(biāo)發(fā)生一系列變化，如酶活性和丙二醛含量等?；酋ｋ孱悺⑦溥蜻?、三唑嘧啶磺酰胺、嘧啶醚類等除草劑作用靶標(biāo)為乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)，在植物體內(nèi)主要催化亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸生物合成的第一階段[5]，ALS活性受抑制后，植物體內(nèi)支鏈氨基酸合成受阻，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)合成，造成植物細(xì)胞分裂與生長(zhǎng)停滯[6]。過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)是生物體內(nèi)重要的保護(hù)酶，POD 存在于動(dòng)植物體的細(xì)胞中，是一類以電子受體為過氧化氫的氧化還原酶，可以通過消除毒性物質(zhì)和過氧化氫對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)的作用[7]。CAT 是一種重要的機(jī)體保護(hù)酶，在生物演化的過程中可通過催化細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的分解而防止其過氧化，從而起到防御作用[7]。MDA是膜脂過氧化過程中的分解產(chǎn)物，表示膜脂過氧化程度和對(duì)逆境的反應(yīng)，MDA含量越高損傷越大[8]。范志金等[9]研究了單嘧磺隆對(duì)玉米ALS 酶活性的影響，表明低濃度的單嘧磺隆對(duì)ALS酶無抑制作用，高濃度則具有抑制作用；楊濤等[10]研究了樂果脅迫對(duì)菠菜葉片中CAT、POD 活性影響，結(jié)果顯示噴施樂果能夠增加菠菜葉片中CAT、POD活性；張清智等[8]研究了氰戊菊酯脅迫對(duì)小白菜抗氧化酶活性的影響，結(jié)果顯示施用不同濃度氰戊菊酯時(shí)小白菜體內(nèi)過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性明顯受到抑制，MDA含量顯著增加，且存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系；侯文煥等[11]研究了除草劑殘留對(duì)菜用黃麻幼苗生理特性的影響，表明噴施不同濃度除草劑后，2 個(gè)菜用黃麻品種幼苗葉片的MDA含量、POD和CAT活性均高于對(duì)照；王雅情等[12]研究了除草劑使它隆不同兌水量對(duì)谷子生理生化指標(biāo)的影響，使它隆處理初期谷子葉片的POD和CAT活性呈先升高后降低趨勢(shì)，且均高于對(duì)照；王玉琴等[13]研究了“清橐1 號(hào)”復(fù)配除草劑防除黃帚橐吾生理特性，結(jié)果顯示隨著施藥時(shí)間的推移，MDA 含量顯著增加，抗氧化酶活性均呈先升高后降低趨勢(shì)。錢蘭娟等[14]研究表明，炔草酯可提高小麥幼苗期葉片的MDA 含量及POD 活性；丁超等[15]研究表明3 種除草劑均可使高粱的POD活性以及MDA含量升高；王正貴等[16]研究了5種常用除草劑對(duì)小麥生理生化特性的影響，結(jié)果表明POD和CAT活性表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)；葉亞新等[17]研究了除草劑對(duì)蘿卜幼苗逆境生理指標(biāo)的影響，結(jié)果顯示隨著除草劑濃度升高和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，蘿卜幼苗MDA含量和POD活性都先上升后下降。

為了解施用除草劑出現(xiàn)藥害癥狀后是否會(huì)對(duì)花生植株生理特性產(chǎn)生影響，本研究測(cè)定了施用丁草胺和草甘膦異丙胺鹽后花生體內(nèi)ALS、CAT和POD的活性和MDA的含量，對(duì)其變化情況進(jìn)行了研究，并探討除草劑與花生之間相互作用機(jī)理，旨在為尋找此類除草劑藥害修復(fù)方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料所選花生品種為‘龍花172’（龍巖市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育），試驗(yàn)于龍巖市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所植保室大棚內(nèi)進(jìn)行，播種前土壤未噴施任何藥劑，棚內(nèi)溫度白天(28±2)℃、夜間(22±2)℃，相對(duì)濕度75%±5%，在花生3片復(fù)葉時(shí)進(jìn)行除草劑噴霧處理。

1.1.2 供試藥劑及試劑50%丁草胺乳油（杭州穎泰生物科技有限公司），41%草甘膦異丙胺鹽（江蘇好收成韋恩農(nóng)化股份有限公司），ALS、CAT、POD試劑盒（北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司）和MDA試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司），均采購(gòu)于正規(guī)銷售代理公司。

1.1.3 試驗(yàn)儀器EPOCH2 型酶標(biāo)定量測(cè)定儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司），F(xiàn)570型超低溫冰箱（德國(guó)艾本德有限公司），scientz-IID 型超聲波細(xì)胞破碎器（新芝公司），AF103AS型制冰機(jī)（斯科茨曼制冰系統(tǒng)（上海）有限公司），TGL-16gR 型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），UPT-II-20T 型超純水系統(tǒng)（上海優(yōu)普公司），UV-5200 型紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

2 種除草劑均設(shè)置5 個(gè)濃度（編號(hào)為濃度1～濃度5），丁草胺乳油分別為2.55、5.10、10.20、20.40、40.80 L/hm2，草甘膦異丙胺鹽水劑分別為3.00、6.00、12.00、24.00、48.00 mL/hm2，兌水至750 L/hm2，于花生3 片復(fù)葉時(shí)莖葉噴霧，以清水噴霧的植株作為對(duì)照。藥后5、10、15、20 d分別拔出植株進(jìn)行酶（ALS、CAT和POD）活性和MDA含量測(cè)定，測(cè)定方法步驟按照試劑盒使用說明進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示；使用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行方差分析和Tukey 法多重比較進(jìn)行差異顯著性分析，利用Excel 2007和WPS做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種除草劑對(duì)花生ALS活性影響

由圖1 可得出，2 種除草劑各濃度處理花生植株后，20 d 內(nèi)ALS 活性出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，同一濃度在不同時(shí)間測(cè)得的ALS活性差異顯著，20 d時(shí)活性達(dá)最低值，與對(duì)照一致。從圖1A中可見，使用丁草胺各濃度處理后，濃度4 和濃度5 處理后5 d ALS 活性(395.87、399.10 U/L)和10 d ALS 活性(474.52、480.19 U/L)都顯著高于對(duì)照，濃度5 處理活性高于濃度4 處理，15 d 時(shí)ALS 活性下降，分別為444.52、440.48 U/L，濃度5 處理活性低于濃度4 處理，顯著低于對(duì)照(534.73 U/L)，到處理20 d時(shí)還是顯著低于對(duì)照(P＜0.05)；其余各濃度處理對(duì)花生ALS 活性基本沒有影響，與對(duì)照差異不顯著或略低于對(duì)照。

圖1 除草劑處理后花生植株ALS活性變化

使用草甘膦異丙胺鹽各濃度處理后10 d 內(nèi)，濃度3、濃度4和濃度5的ALS活性顯著高于對(duì)照，與對(duì)照相比15 d時(shí)出現(xiàn)下降趨勢(shì)且顯著低于對(duì)照(534.73 U/L)，分別為494.76、449.38、459.92 U/L，20 d時(shí)ALS活性出現(xiàn)上升接近對(duì)照(237.35 U/L)，分別為230.13、222.90、213.29 U/L；20 d 內(nèi)濃度1 處理與對(duì)照始終保持一致，差異不顯著，濃度2 出現(xiàn)小幅波動(dòng)，先升高再降低，到15和20 d時(shí)與對(duì)照無顯著差異（圖1B）。

2.2 2種除草劑對(duì)花生CAT活性影響

如圖2 所示，20 d 內(nèi)CAT 活性總的變化規(guī)律為先升高后降低，同一濃度在不同時(shí)間測(cè)得的CAT活性與對(duì)照變化規(guī)律一致，5 d 為CAT 活性最低值，15 d 活性達(dá)最高值。從圖2A可得出，丁草胺對(duì)花生植株的CAT活性影響不大，各濃度處理后10 d內(nèi)與對(duì)照保持一致，差異不顯著；所有濃度處理15 d后CAT活性值與對(duì)照相比都出現(xiàn)下降，除濃度5處理顯著低于對(duì)照外，其余處理與對(duì)照差異不顯著；20 d時(shí)所有濃度處理CAT活性值接近對(duì)照，濃度5 處理(41.86 U/L)顯著高于對(duì)照(36.97 U/L)，其余處理與對(duì)照保持一致。

圖2 除草劑處理后花生植株CAT活性變化

草甘膦異丙胺鹽對(duì)花生植株的CAT 活性影響見圖2B，濃度5在20 d內(nèi)CAT活性（分別為29.83、41.29、54.17、43.68 U/L）始終高于對(duì)照（分別為27.75、37.44、51.24、36.97 U/L）；濃度4 在處理5 d 后與對(duì)照差異不顯著，10 d后出現(xiàn)上升，一直持續(xù)到20 d都顯著高于對(duì)照；濃度1、濃度2和濃度3在處理后5 d與對(duì)照持平或低于對(duì)照，10 d 開始與對(duì)照相比處于下降直到20 d 才恢復(fù)至對(duì)照，與對(duì)照無顯著差異或高于對(duì)照。

2.3 2種除草劑對(duì)花生POD活性影響

2 種除草劑處理花生植株后20 d 內(nèi)，POD 活性總體變化規(guī)律為先升高再降低，15 d達(dá)最高（圖3），與對(duì)照變化趨勢(shì)保持一致。從圖3A可得出，除草劑丁草胺處理花生植株后，濃度4和濃度5在處理5 d時(shí)POD活性顯著低于對(duì)照，10 d 時(shí)與對(duì)照一致，15～20 d 時(shí)與對(duì)照相比顯著升高；其余濃度處理15 d 后與對(duì)照持平，20 d 時(shí)相比對(duì)照POD 活性出現(xiàn)上升，顯著高于對(duì)照(P＜0.05)。

圖3 除草劑處理后花生植株P(guān)OD活性變化

草甘膦異丙胺鹽處理花生后POD 活性變化如圖3B。處理10 d后，除濃度1處理與對(duì)照一致外，其余濃度處理POD 活性值都低于對(duì)照；處理15 d 后，所有濃度處理POD 活性都升高達(dá)到20 d 內(nèi)最大值，分別為255.57、253.81、245.02、269.63、265.76 U/L，且顯著高于對(duì)照的237.77 U/L；處理20 d后，各處理POD活性值下降，濃度1和濃度2處理POD活性(218.32、224.63 U/L)顯著高于對(duì)照(210.92 U/L)，濃度3、濃度4 和濃度5 處理低于對(duì)照，但差異不顯著。

2.4 2種除草劑對(duì)花生MDA含量影響

MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，其含量可作為植物受到脅迫時(shí)的標(biāo)記物。由圖4A可知，使用丁草胺可引起花生植株MDA含量增加，各濃度在處理20 d后均高于對(duì)照，不同濃度處理在相同天數(shù)時(shí)隨著濃度的增加MDA 含量升高。藥后5 d，除濃度1 處理和濃度2處理MDA含量與對(duì)照差異不顯著外，其余濃度處理顯著高于對(duì)照(P＜0.05)，其中濃度5 處理MDA 含量為對(duì)照組的1.42 倍；各濃度處理20 d 后MDA 含量有所下降，仍顯著高于對(duì)照（除濃度1處理外）。

圖4 除草劑處理后花生植株MDA含量變化

如圖4B 所示，草甘膦異丙胺鹽處理花生后MDA含量呈波動(dòng)性變化，所有濃度處理10 d 內(nèi)MDA 含量都高于對(duì)照，在10 d時(shí)上升到最大值，濃度4、5處理分別為393.28、397.58 nmol(g·FW)，顯著高于對(duì)照(P＜0.05)，隨后下降，藥后15 d 時(shí)濃度4、5 降至對(duì)照水平，其余處理顯著低于對(duì)照，藥后20 d 濃度4、5 繼續(xù)下降達(dá)最低值，其余濃度處理與對(duì)照保持一致。噴藥相同天數(shù)時(shí)，濃度1、2、3處理間差異不顯著，處理10 d內(nèi)與對(duì)照持平，濃度4、5 顯著高于對(duì)照。丁草胺和草甘膦異丙胺鹽處理濃度相同時(shí)，隨處理后天數(shù)增加出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，基本與對(duì)照一致。結(jié)果顯示，花生MDA含量的變化不僅受濃度的影響，除草劑種類也對(duì)其產(chǎn)生影響，同一種除草劑高濃度對(duì)花生MDA 含量影響較大。

3 結(jié)論

常用除草劑丁草胺和草甘膦異丙胺鹽對(duì)花生植株生長(zhǎng)方面存在不同程度的影響。測(cè)定2種除草劑不同濃度處理后花生體內(nèi)的乙酰乳酸合成酶(ALS)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)酶活性以及丙二醛(MDA)含量，結(jié)果表明處理濃度對(duì)花生植株影響呈正相關(guān)，高濃度處理對(duì)花生的生長(zhǎng)脅迫作用最明顯。與對(duì)照處理相比，2種除草劑濃度4和5處理后ALS活性先升高后降低；丁草胺濃度5 處理15 d 時(shí)CAT 活性顯著低于對(duì)照，而后有所上升，甘膦異丙胺鹽濃度5在處理20 d 內(nèi)CAT 活性均顯著高于對(duì)照；丁草胺濃度4 和5處理花生植株后，POD活性先降低后升高，草甘膦異丙胺鹽各濃度處理后POD 活性先升高后降低，處理15 d時(shí)達(dá)最大值；丁草胺處理后MDA含量20 d內(nèi)均高于對(duì)照，草甘膦異丙胺鹽處理后MDA 含量先升高后降低。由此分析得出花生植株受到除草劑脅迫時(shí)做出了不同防御響應(yīng)，以維持植株正常生理功能。

4 討論

使用除草劑給作物帶來了不適宜的生長(zhǎng)環(huán)境[18]。植物體內(nèi)靶標(biāo)酶、保護(hù)酶活性和丙二醛含量等在逆境脅迫下會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化，目前已把這種變化量作為評(píng)價(jià)逆境傷害程度和植物適應(yīng)性的指標(biāo)而廣泛應(yīng)用。相關(guān)研究表明，在除草劑脅迫下植物體內(nèi)乙酰乳酸合成酶(ALS)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)酶活性以及丙二醛(MDA)含量等會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化來應(yīng)對(duì)脅迫[19-20]。乙酰乳酸合成酶(ALS)的活性受到抑制時(shí)，干擾生理代謝，破壞蛋白質(zhì)合成，使植物細(xì)胞有絲分裂停止，造成生長(zhǎng)停滯，最終導(dǎo)致植株死亡[21]。在逆境的脅迫下，一些植物能夠激活體內(nèi)的抗氧化防衛(wèi)系統(tǒng)，清除受到逆境脅迫而產(chǎn)生的自由基和過氧化物，防止膜脂過氧化，為了保護(hù)自身，植物在進(jìn)化過程中形成了一系列清除自由基的酶，這些酶被統(tǒng)稱為抗氧化酶[4]，過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)屬于已知的抗氧化酶[22]。植物在遭受逆境脅迫時(shí)，首先是植物的細(xì)胞膜遭到破壞[13]，會(huì)產(chǎn)生丙二醛(MDA)與活性氧發(fā)生過氧化反應(yīng)來保護(hù)細(xì)胞膜[13]，MDA 含量越高，其產(chǎn)生的活性氧自由基越多，膜脂過氧化反應(yīng)越大，對(duì)細(xì)胞膜的傷害越大[23]。

高劑量的除草劑使用后會(huì)對(duì)當(dāng)茬及后茬作物造成明顯藥害，同時(shí)也會(huì)對(duì)其生理生化指標(biāo)產(chǎn)生明顯影響[24]。本試驗(yàn)中，藥劑處理花生后，低濃度對(duì)花生植株ALS 活性基本沒有影響，處理后20 d 內(nèi)與對(duì)照持平，這可能是植株可以通過自身調(diào)控使其達(dá)到平衡；高濃度處理（濃度4和濃度5）對(duì)花生植株的影響較大，處理后10 d內(nèi)都處在ALS活性大幅升高的狀態(tài)，這可能是植株受到高濃度除草劑的侵入使機(jī)體生理代謝平衡遭破壞，蛋白質(zhì)不能正常合成，從而激發(fā)體內(nèi)ALS合成，ALS活性迅速增加，來平衡生理代謝以減輕藥物的侵害，到15 d時(shí)，由于植株吸收到大量除草劑生理代謝減弱，ALS 合成受阻導(dǎo)致活性下降，20 d 時(shí)ALS 活性上升，與對(duì)照差距縮小。使用丁草胺各濃度處理后，只對(duì)最高濃度5 處理的CAT 活性影響較大，能使其活性增加，這可能是除草劑濃度太高使其機(jī)體抵抗激烈，導(dǎo)致CAT活性始終處于一種高水平，以減輕藥劑對(duì)它的傷害，其余處理濃度對(duì)植株還不足以達(dá)到促使此類酶活性發(fā)生較大變化，機(jī)體能正常運(yùn)轉(zhuǎn)；使用草甘膦異丙胺鹽各濃度處理后，對(duì)花生都能產(chǎn)生一定的影響，植株受到低濃度草甘膦異丙胺鹽侵入后，CAT活性受到抑制先出現(xiàn)下降，后能恢復(fù)正常生長(zhǎng)使其活性能恢復(fù)至對(duì)照水平；高濃度5 處理使花生植株CAT 活性始終處于較高水平，說明植株啟動(dòng)免疫系統(tǒng)抵抗除草劑入侵導(dǎo)致正常生長(zhǎng)的恢復(fù)能力弱。除草劑丁草胺處理花生植株后，濃度4 和濃度5 在處理5 d 時(shí)POD 活性降低，可能是受到大劑量藥劑侵入后，機(jī)體還不能立刻產(chǎn)生有力的抵抗，使保護(hù)酶POD合成受阻，隨著時(shí)間的增加，機(jī)體增強(qiáng)POD合成來抵抗除草劑的入侵，所以10 d時(shí)POD活性增強(qiáng)至對(duì)照水平，高濃度處理植株恢復(fù)能力較弱，使其20 d 時(shí)POD 活性還處于較高值；草甘膦異丙胺鹽處理花生植株后，各濃度5 d時(shí)由于剛受到藥劑入侵，POD 合成受阻低于對(duì)照，10 d 時(shí)高劑量處理仍然處于降低狀態(tài)，處理15 d后開始恢復(fù)正常生長(zhǎng)。噴施2種除草劑后，增加了花生植株體內(nèi)的活性氧，導(dǎo)致MDA含量增加，促進(jìn)了花生葉片膜脂過氧化作用。丁草胺各濃度處理MDA含量在20 d內(nèi)始終維持在高于對(duì)照狀態(tài)，說植株一直受到藥劑的傷害，促使葉片MDA含量增加以保護(hù)花生植株不受丁草胺侵害[11]；草甘膦異丙胺鹽濃度1、2、3 處理后對(duì)MDA 含量影響不是特別明顯，濃度4、濃度5在處理后10 d內(nèi)MDA含量一直處于高位，以保護(hù)植株不受除草劑傷害，處理15 d后出現(xiàn)下降，說明除草劑脅迫促進(jìn)了細(xì)胞的膜脂過氧化作用，植株受到更進(jìn)一步的傷害，MDA 含量無法增加，呈下降趨勢(shì)。

噴施不同濃度丁草胺和草甘膦異丙胺鹽對(duì)花生的ALS、CAT、POD 活性和MDA 含量都造成了不同程度的影響，高濃度處理短時(shí)間內(nèi)很難恢復(fù)至對(duì)照水平。因此，合理使用除草劑對(duì)花生的安全生產(chǎn)至關(guān)重要，本研究對(duì)農(nóng)作物安全生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義，至于除草劑對(duì)其產(chǎn)量方面的影響還有待進(jìn)一步研究。