伏慶琳,余安定,宗欽伶,潘 靚,邢 偉,陳 杰
(蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院放射科,江蘇 常州 213003)
腎缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury, IRI)常見于休克、腎移植及心血管手術(shù)后,是造成急性腎損傷的重要原因之一;而紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, EPO)對腎臟及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等具有一定保護(hù)作用[1-2]。 IRI所致腎臟濃縮功能下降與腎小管上皮細(xì)胞水通道蛋白(aquaporin, AQP)改變有關(guān)[3]。超高b值彌散加權(quán)成像(ultra-high b value diffusion weighted imaging, HBV-DWI)可通過擬合一系列超高b值獲得水分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)信息,間接反映腎IRI后細(xì)胞膜AQP表達(dá)水平及其功能[4]。本研究通過比較兔腎IRI模型經(jīng)EPO治療前后超高b值表觀彌散系數(shù)(ultra-high apparent diffusion coefficient, ADCuh)的差異,觀察HBV-DWI用于監(jiān)測EPO治療兔腎IRI效果的價(jià)值。
1.1 建立動(dòng)物模型 18只2~3月齡健康新西蘭大白兔,體質(zhì)量2.0~2.5 kg,由蘇州大學(xué)動(dòng)物中心提供;將其隨機(jī)均分為IRI+EPO組、IRI組及對照組,分籠飼養(yǎng),室溫22~25℃,自由采食與飲水。建模前12 h停飼、停飲,記錄體質(zhì)量。肌內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg體質(zhì)量)誘導(dǎo)麻醉,吸入異氟烷(2%~3%異氟烷與100%氧氣混合,3 L/min)維持麻醉。將實(shí)驗(yàn)兔以右側(cè)臥位保定于手術(shù)臺,常規(guī)備皮、消毒左腎區(qū),暴露左腎,以無創(chuàng)性動(dòng)脈夾夾閉左腎蒂,以腎臟由鮮紅色轉(zhuǎn)為暗紅色為夾閉成功[5];60 min后對IRI+EPO組松開動(dòng)脈夾并立即腹腔注射EPO(3 000 U/kg體質(zhì)量),之后關(guān)閉腹腔;對IRI組于松開動(dòng)脈夾后立即腹腔注射等量生理鹽水;對對照組于暴露左腎60 min后經(jīng)腹腔注射等量生理鹽水。本研究經(jīng)院倫理委員會批準(zhǔn)[編號:(2019)科第008號]。
1.2 MR檢查 于建模后48 h采用GE Discovery Silent 3.0T MR儀及12通道相控陣柔性線圈采集兔常規(guī)T2WI及多b值DWI。掃描前停飼、停飲12 h,吸入異氟烷麻醉動(dòng)物后,以左側(cè)臥位保定,使軸位掃描定位線中心位于左腎門水平并垂直于左腎長軸;參數(shù):快速自旋回波T2WI,TR 1 807 ms,TE 85 ms,FOV 14 cm×14 cm,層厚4.0mm,層間距1.0 mm,矩陣256×224,帶寬31.25 Hz,掃描時(shí)間1.52 min;平面回波多b值DWI,TR 2 000 ms,TE 112 ms,FOV 11 cm×11 cm,層厚4.0 mm,層間距0.3 mm,矩陣64×32,帶寬125 Hz,b值=0、50、100、150、200、300、500、800、1 000、1 300、1 500、1 700、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000、4 500 s/mm2,掃描時(shí)間6.22 min。
將DWI數(shù)據(jù)傳送至GE AW 4.7工作站,以TRI ADC模型軟件擬合b≥1 700 s/mm2超高b值至公式(1),經(jīng)計(jì)算得到ADCuh偽彩圖:
(1)
式中,S為采用對應(yīng)b值時(shí)的DWI信號強(qiáng)度,S0為b值為0時(shí)的信號強(qiáng)度。
由2名具有5年以上工作經(jīng)驗(yàn)的影像科醫(yī)師參照T2WI于軸位DWI左腎門層面避開出血及偽影區(qū)域,分別沿皮質(zhì)(cortex, CO)和外髓(outer medulla, OM)手動(dòng)勾畫ROI并將其映射至ADCuh偽彩圖上,獲得腎臟CO、OM的ADCuh。
1.3 病理學(xué)檢查 以空氣栓塞法處死動(dòng)物,摘取左腎并于腎門層面進(jìn)行橫切,行HE染色,觀察兔腎臟病理改變;行AQP免疫組織化學(xué)染色,于400倍顯微鏡下隨機(jī)選取CO、OM層各5個(gè)視野,利用Image-Pro Plus 6.0軟件量化AQP-1、AQP-2陽性表達(dá)部位,測量其累積光密度(integral optical density, IOD)。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。以組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(intra-class correlation coefficient, ICC)評價(jià)觀察者間測量結(jié)果的一致性:ICC<0.4為一致性差,0.4≤ICC≤0.75為一致性中等,ICC>0.75為一致性較好。以±s表示服從正態(tài)分布的計(jì)量資料,采用單因素方差分析比較3組腎CO及OM的ADCuh、AQP-1及AQP-2 IOD值差異,以LSD-t檢驗(yàn)行兩兩比較。采用Pearson相關(guān)分析評估兔左腎CO及OM的ADCuh與免疫組織化學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性:|r|<0.5為弱相關(guān),0.5≤|r|≤0.75為強(qiáng)相關(guān),|r|>0.75為極強(qiáng)相關(guān)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 兔CO及OM ADCuh變化 MR T2WI示各組左腎皮髓質(zhì)分界尚清晰;DWI圖示各組左腎CO均呈高信號、OM均呈低信號,皮髓質(zhì)分界尚清晰;ADCuh偽彩圖示對照組左腎皮髓質(zhì)以紅色為主,IRI組左腎皮髓質(zhì)由紅色逐漸變黃變綠、顏色變淺,IRI+EPO組左腎皮髓質(zhì)顏色逐漸向紅色恢復(fù)、顏色加深(圖1)。2名醫(yī)師測量左腎CO ADCuh的ICC為0.834[95%CI(0.610,0.934)],測量左腎OM ADCuh的ICC為0.884[95%CI(0.716,0.955)],觀察者間一致性較好,后續(xù)取均值進(jìn)行分析。IRI+EPO組及IRI組左腎CO、OM的ADCuh均低于對照組(P均<0.05);IRI+EPO組左腎CO、OM的ADCuh高于IRI組(P均<0.05),見表1。
圖1 各組兔左腎T2WI、DWI及ADCuh偽彩圖
表1 各組兔左腎CO及OM ADcuh比較(×10-3 mm2/s)
2.2 病理學(xué) 光鏡下見IRI組腎小管上皮細(xì)胞大量壞死、凋亡,刷狀緣消失,腎小管管腔內(nèi)見紅細(xì)胞管型及蛋白質(zhì)管型積聚,腎間質(zhì)內(nèi)見炎細(xì)胞浸潤及點(diǎn)片狀出血灶;IRI+EPO組腎小管壞死細(xì)胞和管型較IRI組明顯減少,間質(zhì)充血、出血較IRI組明顯減輕。對照組腎小管上皮細(xì)胞排列整齊、間質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰,未見炎癥細(xì)胞浸潤。見圖2。
圖2 各組兔左腎病理改變(HE,×400) A.IRI組; B.IRI+EPO組; C.對照組
免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)兔左腎CO及OM的AQP-1、AQP-2均以對照組最強(qiáng),IRI+EPO組次之,IRI組最弱(圖3)。IRI+EPO組及IRI組左腎CO及OM的AQP-1、AQP-2 IOD值均低于對照組(P均<0.05);IRI+EPO組左腎CO的AQP-1 IOD值及OM的AQP-1、AQP-2 IOD值均高于IRI組(P均<0.05)。見表2。
圖3 各組兔左腎CO及OM的AQP-1、AQP-2免疫組織化學(xué)染色圖(×400)
表2 各組兔左腎CO及OM的AQP-1、AQP-2 IOD值比較(×104)
2.3 相關(guān)性分析 兔左腎CO的ADCuh與AQP-1 IOD值呈極強(qiáng)正相關(guān)(r=0.756,P<0.01),與AQP-2 IOD值呈極強(qiáng)正相關(guān)(r=0.819,P<0.01);左腎OM的ADCuh與AQP-1 IOD值呈強(qiáng)正相關(guān)(r=0.720,P=0.001),與AQP-2 IOD值呈極強(qiáng)正相關(guān)(r=0.848,P<0.01)。
腎臟為高灌注器官,其皮髓質(zhì)交界區(qū)血流分布不均,腎小管逆流倍增效應(yīng)及近端小管和髓襻升支粗段的鈉離子重吸收機(jī)制導(dǎo)致耗氧量增加[6-7],極易發(fā)生IRI,使腎臟濃縮和重吸收功能下降,引發(fā)水、電解質(zhì)紊亂。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[8]結(jié)果表明,缺血60 min后,即使實(shí)現(xiàn)再灌注,兔腎已受到嚴(yán)重不可逆損傷。
近年功能MRI評估腎IRI已取得一定成果。MR血氧水平依賴成像可通過反映組織氧合水平而間接評價(jià)腎IRI[9],但無法準(zhǔn)確區(qū)分脫氧血紅蛋白濃度的變化是由灌注還是組織代謝所致,不能絕對量化腎臟氧環(huán)境。動(dòng)脈自旋標(biāo)記成像以水質(zhì)子作為內(nèi)源性示蹤劑,可無創(chuàng)反映腎臟血流灌注水平,但其信噪比較低。動(dòng)態(tài)對比增強(qiáng)MRI可反映腎臟皮髓質(zhì)血流變化情況,但需要使用對比劑。
HBV-DWI在DWI基礎(chǔ)上引入超高b值并擬合至三指數(shù)模型中而獲得水分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)信息,即ADCuh[10],AQP存在于多種細(xì)胞膜表面,可介導(dǎo)自由水快速被動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。腎臟調(diào)節(jié)機(jī)體水平衡時(shí),AQP-1和AQP-2發(fā)揮主要作用[11]。HBV-DWI的b值越高,血流灌注及水分子自由擴(kuò)散引起的信號衰減越明顯,檢測結(jié)果也越接近AQP轉(zhuǎn)運(yùn)的水分子信息[12]。WANG等[13]認(rèn)為HBV-DWI可評估腎AQP表達(dá),以早期評估腎損傷。
IRI早期,缺血細(xì)胞內(nèi)ATP水平迅速下降、H+增加,酸中毒引起細(xì)胞水腫;再灌注后,白細(xì)胞分泌大量趨化因子和細(xì)胞因子,觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng),造成細(xì)胞損傷、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;同時(shí),大量氧自由基被釋放及鈣超載等進(jìn)一步引起組織損傷,其共同作用使位于腎小管上皮細(xì)胞及集合管主細(xì)胞膜上的AQP明顯減少[14]。除促紅細(xì)胞生成外,EPO還可通過抗炎、抗凋亡及調(diào)節(jié)AQP表達(dá)等機(jī)制對機(jī)體多種組織器官起到保護(hù)作用[1,15]。GONG等[3]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)于缺血前給予EPO能有效防止IRI誘導(dǎo)的AQP表達(dá)下調(diào),改善腎小管濃縮功能。本研究IRI組左腎CO及OM的ADCuh均較對照組明顯降低,與AQP變化趨勢一致;IRI+EPO組建模后48 h腎臟CO的AQP-1 IOD值及OM的AQP-1、AQP-2 IOD值均高于IRI組,ADCuh變化趨勢也與其一致,提示EPO干預(yù)后兔AQP-1、AQP-2表達(dá)較IRI組有所恢復(fù),而HBV-MRI可無創(chuàng)反映腎IRI后AQP表達(dá)變化。本研究IRI+EPO組與IRI組左腎CO的AQP-2的表達(dá)量無明顯差異,可能與樣本量小、AQP-2在腎臟皮髓質(zhì)分布差異有關(guān)。
EPO可通過抑制缺血性損傷時(shí)合成一氧化氮而影響抗利尿激素分泌,以防止AQP-2表達(dá)下調(diào)[16]。既往研究[17]發(fā)現(xiàn)再灌注24 h內(nèi)腎皮質(zhì)小管周圍成纖維細(xì)胞受損使合成EPO明顯減少,而EPO受體表達(dá)則維持在良好水平;由此推測,外源性EPO可減輕腎臟負(fù)擔(dān)的原因還可能與其抗炎、抗凋亡及誘導(dǎo)血紅素加氧酶1的表達(dá)對抗氧化應(yīng)激等機(jī)制有關(guān)[18]。本研究相關(guān)性分析結(jié)果表明,腎ADCuh與AQP-1、AQP-2表達(dá)均呈正相關(guān),進(jìn)一步提示ADCuh可在一定程度上反映腎IRI經(jīng)EPO治療后AQP變化,進(jìn)而評估療效。
本研究的局限性:①樣本量小;②僅針對再灌注48 h后,未進(jìn)一步動(dòng)態(tài)分析不同再灌注時(shí)間點(diǎn)ADCuh變化;③EPO合理劑量有待確定。
綜上,HBV-MRI可無創(chuàng)反映腎IRI兔經(jīng)EPO治療后AQP表達(dá)變化,進(jìn)而監(jiān)測其治療效果。