倪 敏， 謝沁璇， 李 岱， 周永健， 劉婷婷， 趙藝蒙， 潘 楊，3

（1.蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 江蘇 蘇州 215009； 2．蘇州科技大學(xué)江蘇省環(huán)境科學(xué)與工程重點實驗室， 江蘇 蘇州 215009； 3．蘇州科技大學(xué)城市生活污水資源化利用技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室， 江蘇 蘇州 215009）

藍(lán)藻是水華爆發(fā)的優(yōu)勢藻種，分布范圍廣、規(guī)模大、持續(xù)時間長，其中以微囊藻等為主的優(yōu)勢種屬代謝產(chǎn)生的藻毒素危害水環(huán)境和人類健康。 水華爆發(fā)的本質(zhì)是活性藍(lán)藻在適宜條件下的過度增殖，活性藍(lán)藻的數(shù)量受季節(jié)、溫度、營養(yǎng)、pH 等環(huán)境因素的影響[1-2]，快速監(jiān)測活性藍(lán)藻數(shù)量對預(yù)警和防治水華現(xiàn)象的發(fā)生具有重要指示作用，需長周期、多樣品、大面積的對活性藍(lán)藻進(jìn)行計數(shù)[3]。 常見的面向藻華預(yù)警的藍(lán)藻細(xì)胞計數(shù)方法有：（1）2022 年6 月1 日實施的《水質(zhì)浮游植物的測定0.1 mL 計數(shù)框-顯微鏡計數(shù)法》（HJ1216-2021）：經(jīng)魯戈試劑和甲醛固定的藻液，基于藻密度進(jìn)行稀釋或濃縮后于血球計數(shù)板中，經(jīng)熒光顯微鏡鏡檢計數(shù)藻細(xì)胞數(shù)； 甲醛在2017 年10 月27 日被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)列為一類致癌物，2019 年7 月23 日被我國列入有毒有害水污染物名錄（第一批），該方法使用的甲醛毒性大危害人體，甲醛固定后的藻液屬于危廢，產(chǎn)生次生污染物毒害環(huán)境，同時該方法還存在鏡檢觀察耗時長、人力投入大、對藻種識別人員經(jīng)驗要求高、計數(shù)結(jié)果是總藻細(xì)胞數(shù)對藻華預(yù)警的指示作用有限等不足[4-5]。 （2）使用流式細(xì)胞儀對經(jīng)SYBR green Ι 和PI 雙染后的藻液分別檢測，獲得各自的DNA 含量，結(jié)合已知細(xì)胞濃度的標(biāo)準(zhǔn)品DNA 含量獲得染色的總細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)，進(jìn)而得出活細(xì)胞數(shù)；存在操作繁瑣、染料和標(biāo)準(zhǔn)品價格昂貴不易保存、可檢出的細(xì)胞濃度范圍（大于100 萬個/L 與顯微計數(shù)結(jié)果差異較?。┯邢薜热秉c[6-7]。 需要建立一種綠色安全、高效快速的藍(lán)藻活細(xì)胞監(jiān)測方法。

藍(lán)藻氣囊是由眾多圓柱形的氣泡疊加而成，具有明顯的折光特征[8-9]，透射電鏡圖像分析法顯示銅綠微囊藻氣囊占總細(xì)胞體積的28%[10]。 藍(lán)藻氣囊能夠承受的壓力是0.4～0.7 MPa，超聲或加壓能在不影響細(xì)胞活性的前提下使氣囊裂解、氣體溢出[10]。 此外，藍(lán)藻不具有細(xì)胞核，但細(xì)胞中央有顆粒狀或網(wǎng)狀的核物質(zhì)，易受外界細(xì)胞器占位的干擾而改變分布狀態(tài)[11]。 PI 可通過死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞核，與細(xì)胞核中的DNA 結(jié)合使其于熒光顯微鏡下觀察呈紅色；與直接染藍(lán)藻活細(xì)胞的MTT 法、乳酸脫氫酶（LDH）法相比，靈敏性高、穩(wěn)定性好[12]。研究表明，葉綠素a 濃度可用于反應(yīng)藻細(xì)胞密度[13]。氣囊裂解后是否能夠顯著提高藍(lán)藻死細(xì)胞的檢出率，藍(lán)藻活細(xì)胞數(shù)與葉綠素a 濃度是否呈線性關(guān)系尚未可知。

本研究通過超聲裂解藍(lán)藻氣囊，經(jīng)固定、染色、鏡檢后計數(shù)藍(lán)藻活細(xì)胞數(shù)，建立藍(lán)藻活細(xì)胞數(shù)與葉綠素a濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得待測樣品藍(lán)藻活細(xì)胞數(shù)，可提供一種新的綠色、高效的藍(lán)藻活細(xì)胞數(shù)獲取方法。

1 材料與方法

1.1 藻種培養(yǎng)

本研究以銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa，F(xiàn)ACHB-905）作為實驗藻種。 銅綠微囊藻培養(yǎng)基為BG11培養(yǎng)基（購自海博生物），配制方法為：稱取BG11 培養(yǎng)基1.7 g，加熱溶解于1 000 mL 蒸餾水中，分裝，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。取500 mL 的培養(yǎng)基，于超凈工作臺中接種50 mL 的種子液，搖晃均勻后在恒溫光照培養(yǎng)箱中，25 ℃、2 000 lx 靜置培養(yǎng)，期間每天搖晃2～3 次，待其長到指數(shù)生長期用于后續(xù)實驗研究。

1.2 超聲裂解藍(lán)藻氣囊與計數(shù)

分別取葉綠素a 濃度在30～100 μg/L 的藻液20 mL，在45 kHz 超聲頻率、200 W 超聲功率下使用三頻數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500VDE 型）分別超聲藻液0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 min。 超聲完畢后，取40 mL 磷酸鹽緩沖液清洗藻液，經(jīng)3 000～4 000 rpm 離心收集藻液，重復(fù)1～2 次去除培養(yǎng)基；將樣品放置在熒光正置顯微鏡下觀察氣囊裂解情況，用移液槍取100 μL 樣品于浮游植物計數(shù)框（0.1 mL）中進(jìn)行計數(shù)，每個樣品計100 個細(xì)胞、3 個平行重復(fù)，有氣囊的記為1，無氣囊的記為0，計算超聲后氣囊的去除率[14]。

1.3 超聲后藻細(xì)胞活性檢測

藻細(xì)胞活性檢測使用噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒（碧云天，型號ST316），MTT 溶液的配制方法：取100 mg MTT試劑，使用20 mL 磷酸鹽緩沖液充分溶解，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾去除溶液中的細(xì)菌待用。 取250 μL 樣品，用1/2 濃度的藍(lán)藻培養(yǎng)基清洗后，懸于250 μL 的1/2 濃度的培養(yǎng)基中，加入60 μL MTT 貯存液進(jìn)行染色，于恒溫水浴鍋中35 ℃染色2 h，取10 μL 樣品于血球計數(shù)板中，在熒光顯微鏡下計數(shù)（尼康NI-U），觀察藍(lán)紫色細(xì)胞占比即為活細(xì)胞占比，每個樣品至少計數(shù)300 個細(xì)胞、設(shè)置三組平行[15-16]。

1.4 未知藍(lán)藻活細(xì)胞計數(shù)

1.4.1 藍(lán)藻葉綠素a 濃度測定和活細(xì)胞計數(shù)

取一份待測藍(lán)藻藻液20 mL，進(jìn)行5 個濃度10 倍梯度稀釋（1 倍、10 倍、100 倍、1 000 倍、10 000 倍），使用浮游植物熒光儀（phyto-PAM，上海澤泉科技股份有限公司）測定5 個濃度梯度稀釋藻液的葉綠素a。 取葉綠素a 濃度在30～100 μg/L 的稀釋藻液20 mL，平均分成兩份，其中一份加入0.1 mL 魯戈試劑黑暗固定48 h（用于總細(xì)胞數(shù)染色鏡檢），另一份不處理（用于死亡細(xì)胞數(shù)染色鏡檢），死亡細(xì)胞染色鏡檢方法：兩份藻液皆通過4 000 rpm 離心3 min，用磷酸鹽緩沖液清洗3 次，用4 mL 磷酸鹽緩沖液重懸藻細(xì)胞，取重懸后的藻液2.0 mL 加入0.5 mL 碘化丙啶（400 μg/mL）溶液，在室溫下染色5 min，用磷酸鹽緩沖液清洗3 次。 各取20 μL 的藻液于血球計數(shù)板中，在10x 物鏡下進(jìn)行顯微鏡鏡檢，計數(shù)染色成紅色細(xì)胞數(shù)。 魯戈試劑固定后的細(xì)胞全部死亡，PI 將死亡細(xì)胞染成紅色， 依據(jù)此原理分別獲得魯戈試劑固定后染色鏡檢的總細(xì)胞數(shù)減去未經(jīng)魯戈試劑固定直接染色鏡檢的的死亡細(xì)胞數(shù)，即可獲得藍(lán)藻活細(xì)胞數(shù)。 各細(xì)胞計算具體公式如下：

魯戈氏溶液的配置：取6 g 碘化鉀溶于20 mL 蒸餾水中，攪拌至溶解后，加入4 g 碘，等碘充分溶解后，再加入80 mL 蒸餾水，儲存在棕色試劑瓶中。

磷酸鹽緩沖液（pH 7.0，0.2M）配制：甲液：Na2HPO4，29.3 g；乙液：NaH2PO4，24.35 g；各加水至1 L；取甲液61 mL、乙液39 mL，配制100 mL 磷酸鹽緩沖液。

1.4.2 建立藍(lán)藻活細(xì)胞數(shù)-葉綠素a 濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

測定1.4.1 中5 個濃度梯度稀釋藻液的活細(xì)胞葉綠素a 濃度，基于稀釋倍數(shù)和鏡檢的活細(xì)胞數(shù)換算獲得這5 個濃度的藍(lán)藻活細(xì)胞數(shù)，以藍(lán)藻活細(xì)胞數(shù)為X 軸、活藻葉綠素a 濃度為Y 軸建立藍(lán)藻活細(xì)胞數(shù)和藍(lán)藻活細(xì)胞葉綠素a 濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 未知藍(lán)藻活細(xì)胞數(shù)計算

使用葉綠素a 測定儀測定藍(lán)藻活細(xì)胞的葉綠素a 濃度，帶入1.4.2 中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算獲得未知樣品的藍(lán)藻活細(xì)胞數(shù)。

2 實驗結(jié)果

2.1 超聲對氣囊裂解和細(xì)胞活性的影響

為了尋求氣囊破裂細(xì)胞活性不變的超聲條件，將藻液在45 kHz、功率200 W 條件下分別超聲0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 min，超聲后的氣囊去除率和細(xì)胞死亡率如圖1 所示；圖1 顯示，超聲0～1 min 氣囊裂解較少，超聲1～2.5 min 氣囊逐漸裂解，超聲2.5～4 min 氣囊全部裂解，說明超聲2.5 min（45 kHz、功率200 W）即可使氣囊完全裂解。 與此同時，超聲0～3.5 min 細(xì)胞死亡率基本無變化，超聲3.5～4 min 后細(xì)胞死亡率增加，說明超聲3.5 min 以上會使細(xì)胞裂解而死亡。 綜合氣囊去除率和細(xì)胞死亡率的結(jié)果可知， 超聲2.5～3.5 min（45 kHz、功率200 W）可在不影響細(xì)胞活性的前提下使銅綠微囊藻氣囊裂解。

圖1 不同超聲時間下氣囊的去除率和細(xì)胞死亡率

2.2 超聲對死細(xì)胞鏡檢計數(shù)的影響

對超聲0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 min 的銅綠微囊藻分別進(jìn)行魯戈試劑固定和PI 染色，經(jīng)熒光顯微鏡鏡檢計數(shù)獲得死細(xì)胞的占比結(jié)果見圖2；由圖2 可知，在超聲1～2.5 min 時，隨著超聲時間的增加，死細(xì)胞占比逐漸增加；超聲2.5～3.5 min 時死細(xì)胞占比基本保持不變，這與圖1 的結(jié)果一致，說明2.5～3.5 min 對藻細(xì)胞活性無影響；與未經(jīng)超聲（0 min）的藻液相比，超聲2.5～3.5 min（45 kHz、功率200 W）死細(xì)胞占比檢出率增加了10.05%，說明超聲使氣囊裂解細(xì)胞活性不變的預(yù)處理方法有利于提高死細(xì)胞的鏡檢檢出率，進(jìn)而更加準(zhǔn)確獲得藻液的活細(xì)胞數(shù)。

圖2 不同超聲時間后固定和染色鏡檢計算的死細(xì)胞占比

2.3 藻活細(xì)胞數(shù)與活細(xì)胞葉綠素a 濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將浮游植物熒光儀測定的5 個濃度10 倍梯度稀釋藻液的葉綠素a 濃度（記為Y）與經(jīng)上述超聲預(yù)處理后固定和染色鏡檢計數(shù)獲得的活細(xì)胞數(shù)（記為X）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖3），圖3 中銅綠微囊藻的葉綠素a 濃度Y與活細(xì)胞數(shù)X的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系式為y=7×10-7x+10.643，R2=99.73%＞99%，符合標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性要求[17-18]，說明此種建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法較為準(zhǔn)確、可行。

圖3 銅綠微囊藻活細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞葉綠素a 濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 純藻顯微鏡鏡檢法和快速標(biāo)準(zhǔn)曲線法獲得活細(xì)胞數(shù)的比較

使用浮游植物熒光儀測定三組未知銅綠微囊藻藻液的葉綠素a 濃度，結(jié)果分別為55.79、47.60 和59.01 μg/L， 帶入標(biāo)曲關(guān)系式：y=7×10-7X+10.643， 計算可得未知銅綠微囊藻的活細(xì)胞數(shù)X分別為6.45×107cells/mL、5.28×107cells/mL 和6.91×107cells/mL（見表1）。 與此同時，使用2.5 min、45 kHz、200 W 的條件分別超聲處理該三組未知銅綠微囊藻2.5 min，經(jīng)魯戈試劑固定和PI 染色后鏡檢計數(shù)死細(xì)胞數(shù)、總細(xì)胞數(shù)見表2，將表2 中的總細(xì)胞數(shù)減去死細(xì)胞數(shù)， 獲得三組未知銅綠微囊藻的活細(xì)胞數(shù)C分別為6.32×107cells/mL、5.36×107cells/mL 和6.8×107cells/mL，將表1 和表2 的活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行顯著性差異分析，P值為0.509＞0.05，說明快速標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得純種藍(lán)藻活細(xì)胞的方法與超聲鏡檢的方法結(jié)果無顯著性差異，說明這種快速標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得純種藍(lán)藻活細(xì)胞的方法對預(yù)警藍(lán)藻水華具有較好的適用性。

表1 快速標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定的未知銅綠微囊藻活細(xì)胞數(shù)

表2 固定和染色后顯微鏡鏡檢法測定的未知銅綠微囊藻活細(xì)胞數(shù)

2.5 實際水體顯微鏡鏡檢法和快速標(biāo)準(zhǔn)曲線法獲得活細(xì)胞數(shù)的比較

使用浮游植物熒光儀測定三組未知太湖水樣活性藍(lán)藻的葉綠素a 濃度， 結(jié)果分別為18.56、15.80 和20.52 μg/L，帶入標(biāo)曲關(guān)系式：y= 4×10-7X+ 7.250 5，計算可得未知太湖水樣藍(lán)藻的活細(xì)胞數(shù)分別為2.83×107cells/mL、2.14×107cells/mL 和3.32×107cells/mL（見表3）。與此同時，使用2.5 min、45 kHz、200 W 的條件分別超聲處理該三組未知太湖水樣藍(lán)藻2.5 min，經(jīng)魯戈試劑固定和PI 染色后鏡檢計數(shù)死細(xì)胞數(shù)、總細(xì)胞數(shù)見表4，將表4 中的總細(xì)胞數(shù)減去死細(xì)胞數(shù)，獲得三組未知太湖水樣藍(lán)藻的活細(xì)胞數(shù)分別為2.96×107cells/mL、2.16×107cells/mL 和3.36×107cells/mL， 將表3 和表4 的活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行顯著性差異分析，P值為0.202＞0.05，說明快速標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得實際水樣藍(lán)藻活細(xì)胞的方法與超聲鏡檢的方法結(jié)果無顯著性差異， 實際水樣的R2=98.33%（見表3）略小于以銅綠微囊藻制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2（99.73%）（見圖3），這是由于實際的混合藻液中藍(lán)藻捕光色素對光譜的吸收和其它藻類有輕微重疊， 造成浮游植物熒光儀檢測的活性藍(lán)藻的葉綠素a 濃度存在誤差，其不可避免，所以該方法對于實際水體中水華藍(lán)藻的檢測也具有較好的適用性。

表3 快速標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定的太湖水樣藍(lán)藻活細(xì)胞數(shù)

表4 固定和染色后顯微鏡鏡檢法測定的太湖水樣藍(lán)藻活細(xì)胞數(shù)

2.6 快速標(biāo)準(zhǔn)曲線法與現(xiàn)行技術(shù)的比較

目前常用的藍(lán)藻細(xì)胞計數(shù)方法為 《水質(zhì)浮游植物的測定0.1 mL 計數(shù)框-顯微鏡計數(shù)法》（HJ1216-2021），主要用于計數(shù)藍(lán)藻的總細(xì)胞數(shù)?，F(xiàn)對本研究方法設(shè)定應(yīng)用場景，具體如下：對太湖流域藍(lán)藻監(jiān)測預(yù)警，設(shè)定監(jiān)測點位48 個，太湖藍(lán)藻爆發(fā)時間為6 月份-9 月份，根據(jù)藍(lán)藻爆發(fā)時間設(shè)置監(jiān)測周期4 個月，監(jiān)測頻次為每周2 次，每個樣品取樣500 mL。 在此條件下快速標(biāo)準(zhǔn)曲線法與行標(biāo)《水質(zhì)浮游植物的測定0.1 mL 計數(shù)框-顯微鏡計數(shù)法》（HJ1216-2021）的對比見表5；根據(jù)表5 可知，本研究的快速標(biāo)準(zhǔn)曲線法無需使用甲醛、避免產(chǎn)生危廢等次生污染物、大量節(jié)省魯戈試劑的用量，人力投入少，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低，較現(xiàn)行的行標(biāo)方法綠色高效、準(zhǔn)確。

表5 快速標(biāo)準(zhǔn)曲線法與行標(biāo)方法的比較

3 分析與討論

3.1 快速標(biāo)準(zhǔn)曲線法獲得藍(lán)藻活細(xì)胞綠色、高效、相對準(zhǔn)確

本研究提出的綠色、高效、相對準(zhǔn)確獲得藍(lán)藻活細(xì)胞數(shù)的方法基于以下幾點：（1）《水質(zhì)浮游植物的測定0.1 mL 計數(shù)框-顯微鏡計數(shù)法（HJ1216-2021）》 中計數(shù)藻細(xì)胞是使用魯戈試劑和甲醛固定藻液樣品進(jìn)行鏡檢，甲醛是世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)公布的一類致癌物，本研究中的方法無需使用甲醛，綠色環(huán)保；（2）藍(lán)藻氣囊中含大量氣體，在總細(xì)胞體積中占比較大，具有明顯的折光特征[8]，適宜的加壓和超聲處理可使藍(lán)藻氣囊裂解細(xì)胞活性不變[10]，氣囊裂解后氣體逸出，對顯微成像的折光干擾消失；此外，氣囊裂解后，對藍(lán)藻核物質(zhì)的擠壓和占位影響減小、氣囊下沉，PI 染液與死細(xì)胞接觸充分、染色均勻，有利于在顯微鏡下識別和判讀染成紅色的死細(xì)胞。 在不改變細(xì)胞活性的前提下，與未經(jīng)超聲處理相比，超聲（2.5 min、45 kHz、功率200 W）裂解藍(lán)藻氣囊后進(jìn)行染色鏡檢可提高10.05%的死細(xì)胞檢出率。 （3）浮游植物熒光儀是一款基于不同活性藻類捕光色素對光譜吸收的差異和葉綠素a 熒光檢測技術(shù)，實現(xiàn)對樣品中藍(lán)藻、綠藻、硅/甲藻的分類和葉綠素a 濃度測定，對不同活性藻類葉綠素a 濃度檢測準(zhǔn)確、靈敏、應(yīng)用廣泛[19-21]。 本研究通過超聲裂解氣囊準(zhǔn)確計數(shù)藍(lán)藻活細(xì)胞和浮游植物熒光儀準(zhǔn)確測定藍(lán)藻活細(xì)胞葉綠素a 濃度，建立二者的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2＞99%，符合環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域?qū)?biāo)準(zhǔn)曲線的線性要求[17-18]；只需測定藻華預(yù)警的批量藻液葉綠素a 濃度、無需鏡檢即可基于標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得活細(xì)胞數(shù)，高效、相對準(zhǔn)確。

3.2 快速標(biāo)準(zhǔn)曲線法的技術(shù)改進(jìn)和標(biāo)準(zhǔn)藻液的選擇

首先，快速標(biāo)準(zhǔn)曲線法獲得藍(lán)藻活細(xì)胞數(shù)依賴于熒光顯微鏡下對于超聲氣囊裂解后染成紅色死細(xì)胞的準(zhǔn)確識別；藍(lán)藻種類繁多、形態(tài)多樣，有單細(xì)胞、簇狀多細(xì)胞和絲狀等[22]，針對這些形態(tài)種類繁多的多細(xì)胞藍(lán)藻，接下來在顯微鏡鏡檢前可加入一定的預(yù)處理方法，以保證細(xì)胞均勻分散為單細(xì)胞便于準(zhǔn)確計數(shù)。 其次，對于絲狀細(xì)胞，有文獻(xiàn)報道將絲狀細(xì)胞的總長度作為代替細(xì)胞數(shù)量的一種統(tǒng)計方法[23]，活性絲狀細(xì)胞的總長度與活細(xì)胞的葉綠素a 濃度是否存在線性關(guān)系需要深入研究。再次，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線所用的標(biāo)準(zhǔn)藻液與待測藻液的雜質(zhì)成分越相似、測定環(huán)境條件越統(tǒng)一、來源特征越接近，標(biāo)準(zhǔn)曲線所反映的線性關(guān)系越適用于待測藻液，計算的結(jié)果也更準(zhǔn)確[24]。 最后，鏡檢時藻細(xì)胞太稀誤差大，太濃細(xì)胞重疊團(tuán)聚不易識別，選擇葉綠素a 濃度在30～100 μg/L 的稀釋藻液作為標(biāo)準(zhǔn)藻液進(jìn)行固定和染色后鏡檢計數(shù)活細(xì)胞， 藻液鏡檢基本不需要進(jìn)行濃縮或稀釋，為鏡檢標(biāo)準(zhǔn)藻液提供選擇依據(jù)。

3.3 快速標(biāo)準(zhǔn)曲線法的應(yīng)用前景

我國生態(tài)環(huán)境部《“十四五”生態(tài)環(huán)境監(jiān)測規(guī)劃》及《江蘇省“十四五”自然生態(tài)保護(hù)規(guī)劃》提出“對藻類水華易發(fā)多發(fā)的敏感湖庫開展藍(lán)藻水華監(jiān)測預(yù)警，提高藍(lán)藻打撈與無害化處置能力”等要求。 藍(lán)藻水華的本質(zhì)是活性藍(lán)藻的過度增殖，不同條件下藍(lán)藻活細(xì)胞的占比差異較大；而藻華預(yù)警采樣點位多、范圍廣、周期長，現(xiàn)有的方法尤其是基于鏡檢的行標(biāo)方法 《水質(zhì)浮游植物的測定0.1 mL 計數(shù)框-顯微鏡計數(shù)法 （HJ1216-2021）》僅限于計數(shù)藍(lán)藻總細(xì)胞數(shù)，未能計數(shù)活細(xì)胞數(shù)；同時使用一類致癌物甲醛進(jìn)行藻華預(yù)警大量樣品的固定后計數(shù)，固定后的藻液產(chǎn)生大量的次生污染物危害環(huán)境。 本研究提出的快速標(biāo)準(zhǔn)曲線法具有無需使用甲醛和鏡檢，僅通過浮游植物熒光儀測定活性藍(lán)藻的葉綠素a 濃度即可獲得活性藍(lán)藻的細(xì)胞數(shù)，綠色高效、準(zhǔn)確；面向政府及相關(guān)管理部門、科研機構(gòu)等進(jìn)行多面積、長周期、大樣品的活性藍(lán)藻實時監(jiān)測，可獲得較為準(zhǔn)確的活性藍(lán)藻細(xì)胞數(shù)，符合國家將湖泊治理向生態(tài)修復(fù)、長效維持進(jìn)行轉(zhuǎn)變的戰(zhàn)略需求，必然具備廣闊的市場應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

（1）超聲處理（2.5～3.5 min、45 kHz、200 W）可使藍(lán)藻氣囊裂解活性不變，進(jìn)而提高魯戈試劑和PI 染色后鏡檢計數(shù)活細(xì)胞的準(zhǔn)確性（死細(xì)胞檢出率增加10.05%）；

（2）浮游植物熒光儀測定的葉綠素a 濃度與超聲裂解氣囊后進(jìn)行固定、染色、鏡檢獲得的活細(xì)胞數(shù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2＞99%；

（3）僅通過測定未知藻液的葉綠素a 濃度，基于上述標(biāo)準(zhǔn)曲線即可獲得未知藻液的活細(xì)胞數(shù)，與經(jīng)超聲裂解氣囊后進(jìn)行固定、染色、鏡檢獲得的活細(xì)胞數(shù)相比無顯著性差異，該方法可應(yīng)用于基于藻華預(yù)警的綠色、高效獲取藍(lán)藻活細(xì)胞數(shù)。