史沉魚，吳梁艷

（河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西宜州 546300）

不利的外部條件，如干旱和高鹽度，會對植物的生長產(chǎn)生不利影響。土壤鹽堿化是影響植物生長發(fā)育的主要非生物因素之一。植物生長發(fā)育過程中對外界環(huán)境的變化非常敏感，在不利的環(huán)境下，植物會通過調(diào)控自身生理生化指標(biāo)、體內(nèi)激素水平及脅迫響應(yīng)基因的變化等多種途徑來抵抗逆境[1]。鹽脅迫是土壤中鹽離子特別是Na+和Cl-的過量積累，嚴重影響植物的正常生長發(fā)育[1]。植物的耐鹽機理涉及方面較多，其中生理水平的自我調(diào)節(jié)是植物體表現(xiàn)出耐鹽特性的主要機制[2]。研究發(fā)現(xiàn)，施加外源激素可以降低Na+、Cl-在細胞中的含量。當(dāng)植物遇到緊急脅迫時，最直接有效地緩解脅迫危害的一種方式就是噴施外源物質(zhì)。

黃瓜（Cucumis sativusL.）系葫蘆科黃瓜屬植物，廣泛種植于溫帶和熱帶地區(qū)[3-4]。黃瓜是一種非鹽生植物，根淺，相對脆弱，對鹽脅迫等刺激很敏感[5]。非鹽生植物在脅迫下的生長發(fā)育受到顯著抑制。有研究表明，不同濃度的NaCl處理對黃瓜幼苗生長的影響表現(xiàn)各不相同。低度脅迫對植株的生長和各生理指標(biāo)影響較??；中度脅迫下植株生物量下降表現(xiàn)明顯，1.2%達到植株生長的極限鹽濃度[6]。鹽脅迫能夠嚴重影響黃瓜幼苗的正常生長，如植株的株高、葉片面積、地上部分鮮重、總根長度等都會降低。研究發(fā)現(xiàn)NaCl脅迫對黃瓜幼苗地上部分和根系的影響稍有區(qū)別，鹽脅迫會降低CAT、POD、SOD 等抗氧化酶的活性，細胞膜的透性受到影響，導(dǎo)致細胞的代謝不正常；鹽脅迫程度加重，植物細胞受到的傷害也越大[7]。在鹽脅迫下，氣孔或非氣孔因素是影響作物光合作用的主要因素，其中影響氣孔的因素包括光、CO2、氣孔振動、植物激素及其他[8]；高鹽會導(dǎo)致作物葉片氣孔關(guān)閉，光合速率降低[9]。

獨腳金內(nèi)酯(strigolactones，SLs)是一類萜類小分子化合物，廣泛存在于植物界中[10]。獨腳金內(nèi)酯是一些天然獨腳金醇類化合物及人工合成類似物的總稱，現(xiàn)已被公認為第七大植物激素，可作生長調(diào)節(jié)劑[11]。SLs主要在根中合成，莖、芽等組織中合成量極低[12]?，F(xiàn)已從植物根系分泌物中分離和鑒定出約20 種天然SL，此數(shù)量還會繼續(xù)增加[13]。獨腳金內(nèi)酯合成途徑中的關(guān)鍵基因有D27、D17和D10[14]。目前在獨腳金內(nèi)酯生物學(xué)功能的科學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用的是GR24。如在擬南芥突變實驗中，施加GR24 能明顯改善突變體對干旱和鹽害脅迫的抵抗能力[15]。外施SLs 在一定程度上會增加CAT、POD、SOD 等抗氧化酶的活性，抑制H2O2和MDA 的產(chǎn)生，抗氧化酶活性越高，對鹽脅迫的適應(yīng)性越強[16]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)SLs 在植物干旱、鹽、營養(yǎng)缺乏等非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]，調(diào)節(jié)獨腳金內(nèi)酯代謝相關(guān)基因的表達有助于植物的生長發(fā)育和抗逆性的變化[18]。然而獨腳金內(nèi)酯在植物生長發(fā)育多個方面的調(diào)控作用還不明確，特別是其對鹽脅迫下植物生理特性的影響還有待進一步研究。本試驗以黃瓜幼苗為對象，研究外源獨腳金內(nèi)酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗的種子萌發(fā)、幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和抗氧化酶活性等生理指標(biāo)的影響，分析評價高鹽對植物的影響程度，為鹽脅迫下黃瓜生理生長的緩解效應(yīng)提供理論支持，對蔬菜的安全生產(chǎn)和保障人體健康具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑與儀器

試驗材料為津綠11號黃瓜。試劑有獨腳金內(nèi)酯人工合成類似物（GR24）、NaCl、丙酮、95%乙醇、石英砂、碳酸鈣粉末、氮藍四唑（NBT）、EDTA-Na2、磷酸緩沖液、乙酸乙酯、牛血清蛋白、甲硫氨酸（Met）、考馬斯亮藍G-250、蒽酮、核黃素、愈創(chuàng)木酚。試驗儀器有分光光度計、電子天平、顯微鏡、恒溫水浴鍋、離心機等。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子萌發(fā)及幼苗培養(yǎng)

首先選取籽粒飽滿、大小一致的黃瓜種子，在燒杯中準備適量的水，將種子浸泡進去，保證水能沒過種子，大概5～6 h 后將種子撈出，在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中將種子鋪平整，進行催芽，2 d 后將其種到土里。共設(shè)5 個處理，每個處理6 盆，每盆5 株。在27～30 ℃溫度中培養(yǎng)，待黃瓜幼苗長到兩葉一心時按試驗設(shè)計（見表1）進行處理。NaCl 溶液每2 d 澆1 次，共處理4 次，模擬鹽脅迫環(huán)境。再分別配制濃度為0 nM、5 nM、10 nM、50 nM 的GR24 溶液對鹽脅迫組進行處理，將不同濃度的GR24 分裝到小噴瓶中均勻噴在黃瓜幼苗葉片兩側(cè)，以葉面濕潤不流滴為準；GR24噴施7 d后，分別取樣進行各項生理指標(biāo)的測定，3次重復(fù)。

表1 試驗設(shè)計

1.2.2 生理指標(biāo)測定方法

株高、根長、真葉數(shù)每個處理隨機測量10株。

葉綠素含量用分光光度法，超氧化物歧化酶活性用氮藍四唑（NBT）還原法，過氧化物酶活性用愈瘡木酚法，可溶性蛋白含量用考馬斯亮藍-G250 法，可溶性糖含量用蒽酮比色法[18]測定。氣孔結(jié)構(gòu)用顯微鏡觀察，在上午8:00—12:00，每個處理觀察5 個裝片，每個裝片觀察3個視野。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

各處理組取3 次重復(fù)的平均值，用Excel 和SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源獨腳金內(nèi)酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗外形指標(biāo)的影響

由表2 可知，各處理黃瓜幼苗的真葉數(shù)之間不存在顯著差異；黃瓜幼苗的根長雖有上升趨勢，但未達到顯著水平；采用單一鹽脅迫處理組（CK2）黃瓜幼苗的株高比對照組（CK1）下降16.85%，達到顯著差異，表明鹽脅迫會使黃瓜的株高受到明顯限制。當(dāng)用5 nM、10 nM、50 nM 濃度的GR24 處理后，黃瓜幼苗的株高比鹽脅迫組（CK2）分別上升了7.39%、11.53%、14.07%，可以看出，噴施GR24 可減輕鹽脅迫對黃瓜幼苗株高的抑制作用。

表2 外源獨腳金內(nèi)酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗株高、根長、真葉數(shù)的影響

2.2 外源獨腳金內(nèi)酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗生理指標(biāo)的影響

2.2.1 葉綠素

表3 顯示，在只有鹽脅迫（CK2）條件下，黃瓜幼苗的葉綠素和類胡蘿卜素含量較對照組（CK1）呈減少趨勢，表明鹽脅迫限制了黃瓜幼苗葉綠素的生成。當(dāng)用5 nM、10 nM、50 nM 的GR24 噴施鹽脅迫下的黃瓜幼苗時，黃瓜幼苗的葉綠素和類胡蘿卜素含量都比鹽脅迫下（CK2）有所提高，達顯著差異（p＜0.05）。鹽脅迫（CK2）下黃瓜幼苗的葉綠素a 含量較對照組（CK1）減少34.92%，在5 nM、10 nM、50 nM濃度GR24處理下黃瓜幼苗的葉綠素a含量比鹽脅迫組（CK2）分別增加了33.41%、41.46%、51.49%；鹽脅迫組（CK2）黃瓜幼苗的葉綠素b 含量較對照組（CK1）減少42.82%，5 nM、10 nM、50 nM 處理組黃瓜幼苗的葉綠素b 含量較鹽脅迫組（CK2）分別增加了44.72%、59.68%、64.68%；鹽脅迫組（CK2）黃瓜幼苗的總?cè)~綠素含量比對照組（CK1）減少37.22%，5 nM、10 nM、50 nM 處理組黃瓜幼苗的總?cè)~綠素含量比鹽脅迫組（CK2）分別增加了36.41%、46.29%、54.98%；鹽脅迫組（CK2）黃瓜幼苗的類胡蘿卜素含量比對照組（CK1）減少33.11%，5 nM、10 nM、50 nM 處理組黃瓜幼苗的類胡蘿卜素含量比鹽脅迫組（CK2）分別增加了24.33%、31.42%、41.72%。結(jié)果表明，施加GR24 可以提高鹽脅迫下黃瓜幼苗的葉綠素和類胡蘿卜素含量。

表3 獨腳金內(nèi)酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗葉綠素含量的影響 單位：mg·L-1

2.2.2 過氧化物酶

過氧化物酶（POD）與植物的很多生理活動都相關(guān)，在植物體內(nèi)活性較高。如圖1 所示，采用單一鹽脅迫處理組（CK2）的黃瓜幼苗葉片的POD 活性比對照組（CK1）降低；當(dāng)用5 nM、10 nM、50 nM 濃度的GR24 處理黃瓜幼苗時，葉片中過氧化物酶活性與鹽脅迫組（CK2）相比呈先下降再上升的趨勢。

圖1 獨腳金內(nèi)酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗過氧化物酶活性的影響

2.2.3 超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶（SOD）是一種抗氧化酶，可以保護細胞免受活性氧的傷害或減少損害，在活性氧清除系統(tǒng)中起著重要作用。圖2所示，采用單一鹽脅迫處理組（CK2）黃瓜幼苗葉片中的SOD 活性比對照組（CK1）低；5 nM、10 nM、50 nM 的GR24 處理組的黃瓜幼苗SOD活性呈上升趨勢，且處理間存在顯著差異（p＜0.05）。

圖2 獨腳金內(nèi)酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗超氧化物歧化酶活性的影響

2.2.4 可溶性蛋白

圖3 所示，用單一鹽脅迫組（CK2）的黃瓜幼苗葉片中可溶性蛋白含量較對照組（CK1）下降9.08%，達顯著性差異（p＜0.05）；GR24 處理后，可以看到黃瓜幼苗葉片的可溶性蛋白含量有升高的趨勢，達顯著性差異（p＜0.05）；5 nM、10 nM、50 nM濃度的GR24處理下，黃瓜幼苗的可溶性蛋白含量分別提高了6.34%、10.41%、7.26%。

圖3 獨腳金內(nèi)酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗可溶性蛋白含量的影響

2.2.5 可溶性糖

如圖4 所示，采用單一鹽脅迫組（CK2）黃瓜幼苗葉片中的可溶性糖含量較對照組（CK1）下降42.22%，有顯著性差異（p＜0.05）；與鹽脅迫組（CK2）相比，GR24 處理后，黃瓜幼苗葉片中的可溶性糖含量有所提高，有顯著性差異（p＜0.05）；5 nM、10 nM、50 nM 濃度GR24 處理下，黃瓜幼苗的可溶性糖含量分別提高了39%、66%、44.83%。

圖4 獨腳金內(nèi)酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗可溶性糖含量的影響

2.2.6 氣孔

氣孔是由一對保衛(wèi)細胞包圍的孔隙，作為植物與環(huán)境之間氣體交換的通道。氣孔控制水分蒸騰和CO2吸入[19]，它在植物生長過程中起著重要的作用。鹽脅迫會導(dǎo)致氣孔閉合。如圖5 所示，在光學(xué)顯微鏡40 倍下觀察，黃瓜表皮分布著很多氣孔，氣孔的形態(tài)、長度及開放程度都不相同，5 個處理下黃瓜氣孔特征存在差異。

圖5 獨腳金內(nèi)酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗氣孔結(jié)構(gòu)的影響

表4 顯示，采用單一鹽脅迫處理組（CK2）黃瓜幼苗的氣孔開口長度、氣孔開口寬度比對照組（CK1）下降了18.73%、31.31%，有顯著性差異（p＜0.05）；經(jīng)不同濃度的GR24 處理后，黃瓜幼苗的氣孔開口長度、開口寬度均有所提高，表明黃瓜在遭受鹽脅迫時氣孔開放受到影響，經(jīng)不同濃度的GR24 處理后，氣孔開放程度有所提高；氣孔密度各處理組間雖存在差異，但未達顯著水平。

表4 獨腳金內(nèi)酯對鹽脅迫下黃瓜幼苗氣孔開口長度、寬度及氣孔密度的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

黃瓜幼苗對鹽脅迫很敏感，鹽脅迫下植株生長受到明顯抑制，本試驗中單一鹽脅迫組（CK2）黃瓜幼苗的株高較對照組（CK1）顯著下降，黃瓜的株高明顯受到限制；用GR24 處理鹽脅迫組的黃瓜幼苗株高有所提高，說明噴施GR24 能減輕鹽脅迫對黃瓜幼苗株高的抑制作用。

葉綠素是光合作用所必需的，它是光合生物中的一種綠色色素，有葉綠素a、葉綠素b；類胡蘿卜素在光合作用中也同樣有著重要作用。鹽脅迫（CK2）條件下，黃瓜幼苗的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素、類胡蘿卜素含量較對照組（CK1）都呈減少趨勢，鹽脅迫使黃瓜幼苗葉綠素、類胡蘿卜素的生成受到影響；5 nM、10 nM、50 nM 濃度的GR24 處理后，黃瓜幼苗的葉綠素、類胡蘿卜素含量發(fā)生變化，較CK2 組有所提高。

處于正常生長下的植物可以平衡自身活性氧（ROS）和自由基的生成與清除，兩者很弱時，不會傷害細胞。但是當(dāng)植物暴露在不利的外部條件如高鹽、干旱和洪水等環(huán)境下時，平衡就會受到影響。SOD、POD 和CAT 是植物體內(nèi)重要的清除活性氧的酶，它們的活性可以用來判斷植物的耐鹽性，抗氧化酶的活性高，說明植物對鹽脅迫有較好的適應(yīng)能力。一定程度的鹽脅迫下，抗氧化酶活性在短暫時間內(nèi)會有增加的趨勢；脅迫程度過強時，超出植物的忍受范圍，抗氧化酶的活性則可能會降低[20]。黃瓜光合產(chǎn)物的形成及正常的生長發(fā)育都受到鹽脅迫的影響[21]。本試驗中，施加NaCl 對黃瓜葉片造成脅迫作用，抑制了葉片中SOD、POD 等酶活性，這與楊愛崢、李志磊等人的研究結(jié)果一致[20]。而GR24 提高了鹽脅迫下黃瓜幼苗葉片中的過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性，降低了鹽脅迫對黃瓜幼苗造成的傷害。

研究表明，鹽脅迫能夠誘導(dǎo)植株耐鹽相關(guān)基因的表達，促進蛋白質(zhì)的合成和相關(guān)酶活性發(fā)生一系列的變化，調(diào)節(jié)體內(nèi)相應(yīng)的生理代謝[22]。鹽脅迫會抑制蛋白質(zhì)合成、加速蛋白質(zhì)降解等，使蛋白質(zhì)含量因為受到鹽脅迫而降低。本試驗中，NaCl脅迫下，黃瓜幼苗葉片中的可溶性蛋白含量明顯下降，這與孫彤彤的研究結(jié)果一致[23]。經(jīng)不同濃度的GR24 處理后，黃瓜幼苗葉片中的可溶性蛋白含量有所提高。

可溶性糖是一種能參與滲透調(diào)節(jié)的小分子物質(zhì)，其可以通過降低細胞水勢來抵抗脅迫環(huán)境[23]。本試驗中，采用單一鹽脅迫組（CK2）黃瓜幼苗的可溶性糖含量比對照組（CK1）顯著下降，經(jīng)不同濃度的GR24處理后，黃瓜幼苗的可溶性糖含量都有所提高。

葉片氣孔是植物與外界環(huán)境之間水、氣交換的重要通道。大量研究表明，鹽脅迫和CO2濃度升高都會使氣孔開度迅速縮小，甚至造成氣孔密度降低[24]。當(dāng)植物受到鹽脅迫時，氣孔可能會關(guān)閉。過高的含鹽量會降低土壤中的滲透勢，反之，植物細胞的滲透勢會增加，使植物難以吸收水分和養(yǎng)分，嚴重情況下會導(dǎo)致細胞組織中的水分外滲。為了減少水分流失、防止脫水，植物關(guān)閉氣孔而降低氣孔導(dǎo)度。試驗用單一鹽脅迫處理組（CK2）的黃瓜幼苗氣孔開口長度、氣孔開口寬度比對照組（CK1）顯著下降，經(jīng)不同濃度的GR24 處理后，黃瓜幼苗的氣孔開口長度、開口寬度均有所提高，黃瓜在遭受鹽脅迫時氣孔開放程度受到影響，經(jīng)不同濃度的GR24 處理后，氣孔開放程度有所提高，GR24能減輕鹽脅迫對黃瓜幼苗的傷害。

3.2 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，鹽脅迫下黃瓜幼苗的株高會降低，葉片中抗氧化酶（POD、SOD）活性和可溶性蛋白、可溶性糖含量等降低，葉綠素、類胡蘿卜素含量都呈下降趨勢，氣孔開放程度也受到影響。而采用不同濃度的GR24 分別對鹽脅迫下的黃瓜幼苗進行處理，黃瓜株高顯著升高，氣孔開放程度有所提高，葉綠素和類胡蘿卜素含量增加，葉片中抗氧化酶（POD、SOD）活性及可溶性蛋白、可溶性糖含量均有所提高，表明噴施GR24能有效緩解鹽脅迫對黃瓜幼苗的傷害。