章祖榮，章斯斯，徐蔣來

（1.浙江國旵生態(tài)科技有限公司，浙江臺州 318020；2.臺州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江臺州 317000）

2021 年，浙江省臺州市蔬菜種植面積在6.60 萬hm2左右。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，種植多年蔬菜土壤出現(xiàn)板結(jié)、酸化、養(yǎng)分失衡、團(tuán)粒結(jié)構(gòu)破壞等問題時有發(fā)生，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞。而土壤細(xì)菌是土壤微生物中最活躍的因子，占土壤微生物總數(shù)的70%～90%。因此，研究土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有重要的意義。

化肥對增加土壤肥力和提高作物產(chǎn)量起著重要的作用，但同時也帶來一系列問題，如農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)破壞、環(huán)境污染嚴(yán)重、作物品質(zhì)和土壤質(zhì)量下降等[1-2]。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，驅(qū)使土壤有機(jī)物分解，參與物質(zhì)循環(huán)過程，是最重要的土壤肥力活性因子，其物種多樣性是生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的關(guān)鍵。一般而言，穩(wěn)定性較好的土壤，微生物抵抗環(huán)境惡化的能力較強(qiáng)。微生物菌肥作為綠色環(huán)保的新型肥料，含有大量有機(jī)質(zhì)和有益微生物，如枯草芽孢桿菌等。其中，有益微生物在其生命活動過程中，產(chǎn)生大量次生代謝產(chǎn)物有機(jī)酸，不斷釋放土壤中的遲效態(tài)氮磷鉀[3]。研究發(fā)現(xiàn)，施用微生物肥料增加了土壤速效養(yǎng)分和有機(jī)質(zhì)等含量，提高土壤脲酶、過氧化氫酶、蔗糖酶等活性[4]。因此，微生物菌肥通過改善土壤質(zhì)地、增加土壤養(yǎng)分有效性和調(diào)節(jié)土壤微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)組成來提高土壤生物活性，使土壤向健康方向發(fā)展[5]。

高通量測序以測序數(shù)據(jù)量大、可信度高優(yōu)勢成為研究微生物群落多樣性的主要方法之一。目前主要研究集中在林木、糧食作物為研究對象或不同菌肥類型處理對其的響應(yīng)，而不同菌肥量代替化肥對設(shè)施芹菜土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響鮮有報道[6-11]。因此，本研究以設(shè)施芹菜土壤為研究對象，設(shè)置三個不同菌肥量替代化肥的梯度，通過高通量測序技術(shù)，分析其對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響，探明改良設(shè)施芹菜土壤的最佳微生物菌肥量，為揭示微生物菌肥肥效提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地選擇在浙江省臺州市黃巖區(qū)南城街道藥山村蔬菜大棚（28°60′N，121°28′E）。該地屬亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，溫暖濕潤，四季分明，年平均氣溫16.9 ℃，10 ℃以上的平均年積溫5 316 ℃，無霜期253 d，年均降水量1 391 mm，年均蒸發(fā)量1 231.4 mm。試驗(yàn)地土壤性質(zhì)為粘土，基礎(chǔ)土樣pH 值為5.30，有機(jī)質(zhì)44.4 g·kg-1，有效磷669.5 mg·kg-1，速效鉀125 mg·kg-1，水解性氮185.6 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)材料

微生物菌肥采用北京中耕綠洲生態(tài)科技有限公司的中耕沃土生物有機(jī)肥，其中含有效活菌數(shù)5.0億·g-1，有機(jī)質(zhì)40%，富含枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。化肥為復(fù)合肥，m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=15∶15∶15。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)計(jì)9 個小區(qū)，每小區(qū)面積333.3 m2。試驗(yàn)地前茬作物為小白菜，在2021 年10 月25 日開始試驗(yàn)布置，共設(shè)置3 個處理：1 500 kg·hm-2化肥（CK）、微生物菌肥1 500 kg·hm-2+750 kg·hm-2化肥（T1）、微生物菌肥3 000 kg·hm-2+750 kg·hm-2化肥（T2），每個處理均配施雞糞有機(jī)肥4 500 kg·hm-2，每處理3 次重復(fù)。于2021年10月30日種植芹菜，日常管理同常規(guī)。2022 年1 月5 日采收、測產(chǎn)，并于當(dāng)日采用五點(diǎn)取樣法采集土樣，剔除枯葉等雜質(zhì)后裝入無菌聚乙烯封口袋中，混合均勻，-80 ℃低溫保存，用于高通量測序。

1.4 測定方法

1.4.1 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)測定

土壤基因組DNA 的提?。菏紫葘颖静捎肅TAB方法提取總的DNA，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度，取適量的樣本DNA 于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng·μL-1。

目標(biāo)片段PCR擴(kuò)增：以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode 的特異引物，Buffer 和高效高保真酶進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。

PCR 產(chǎn)物的混樣和純化：PCR 產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測；根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用1×TAE 濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR 產(chǎn)物，剪切回收目標(biāo)條帶。產(chǎn)物純化試劑盒使用的是Thermo Scientific 公司的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

文庫構(gòu)建和上機(jī)測序：使用Thermofisher 公司的建庫試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測合格后，進(jìn)行NovaSeq 上機(jī)測序（北京果殼生物科技有限公司）。

1.4.2 芹菜品質(zhì)測定

每個小區(qū)采集芹菜莖1 kg 用于測定粗纖維和維生素C 含量。其中粗纖維含量的測定方法參照《GB/T 5009.10-2003》；維生素C 含量的測定方法參照《GB 5009.86-2016》。

1.4.3 芹菜產(chǎn)量測定

每個小區(qū)選取3 m2面積，采用人工拔取，去除根部，用精度為0.01 g 的電子秤測產(chǎn)，最后換算成每公頃產(chǎn)量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

測序后對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾、去除嵌合體處理，得到優(yōu)化序列，進(jìn)行Alpha 多樣性分析、物種組成分析及物種差異分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2010 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，SPSS 19.0 進(jìn)行方差和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理對土壤測序結(jié)果和α 多樣性指數(shù)的影響

稀疏曲線用于驗(yàn)證測序數(shù)據(jù)量是否足以反映樣品中的物種多樣性，并間接反映樣品中物種的豐富程度。圖1 反映了持續(xù)抽樣下新物種出現(xiàn)的速率：在0～60 000 條范圍內(nèi)，隨著測序條數(shù)的加大，曲線趨于平緩，表示此環(huán)境中的物種并不會隨測序數(shù)量的增加而顯著增多，說明此次測序可以反映不同肥料處理對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的真實(shí)情況。

圖1 不同肥料處理下土壤細(xì)菌群落的稀疏曲線

由表1 可知，對不同肥料處理土壤進(jìn)行Nova Seq高通量測序，所測數(shù)據(jù)經(jīng)過去除嵌合體序列處理后，每個樣品有效序列總數(shù)在57 468～62 744 個。在97%相似度水平下，每個樣品細(xì)菌OTU總數(shù)在894～1 371，覆蓋度均在99.9%以上，說明即使開展更深的測序也不會產(chǎn)生更多的OTUs數(shù)，即測序文庫已達(dá)到飽和狀態(tài)。

表1 不同施肥處理對土壤測序結(jié)果和α多樣性指數(shù)的影響

Chao1 指數(shù)表示物種豐富度，Shannon 和Simpson指數(shù)表示物種多樣性。由表1可知，在物種豐度方面，T1和T2處理使Chao1 指數(shù)有不同程度的降低，平均值分別較對照降低了33%和14.6%。相對于Shannon 指數(shù)，T1和T2處理同樣使Shannon 指數(shù)有不同程度的降低，平均值分別較對照降低了13.5%和4.8%，表明T1和T2處理導(dǎo)致土壤中細(xì)菌多樣性降低，且T1處理效果更明顯。相對于Simpson 指數(shù)，T1處理最小為0.99，CK和T2處理均為1.00?？傮w而言，T1和T2處理對土壤細(xì)菌豐富度和多樣性具有一定程度的抑制作用，且T1處理更明顯。

Venn圖可用于統(tǒng)計(jì)多組或多個樣本中所共有和獨(dú)有的物種數(shù)目，比較直觀地表現(xiàn)環(huán)境樣本的物種組成相似性及重疊情況。從圖2 可知，經(jīng)不同施肥處理的土壤共有細(xì)菌OTU 數(shù)為286 個，分別占CK、T1、T2處理組總OTU 數(shù)的17.00%、23.93%、19.18%。CK、T1、T2處理特有的細(xì)菌OTU 數(shù)分別為936、351、715 個，分別占各處理總OTU 數(shù)的55.71%、29.37%、47.95%。說明T1處理對細(xì)菌的影響大于T2處理，T2處理土壤中的細(xì)菌組成與CK處理更接近。

圖2 不同處理下土壤細(xì)菌OTU分布Venn圖

2.2 不同施肥處理對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

利用PCA 分析土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性與差異性，通過主成分分析可以實(shí)現(xiàn)多個樣品的分類，進(jìn)一步展示不同樣品間物種多樣性差異，坐標(biāo)圖上距離越近的樣品，樣品的組成越相似。由圖3 看出，PC1 是造成樣品差異性的最大主坐標(biāo)成分，其次是PC2，分別解釋了28.31% 和25.04% 的貢獻(xiàn)率，兩個主坐標(biāo)軸總貢獻(xiàn)率達(dá)53.35%。T2處于第一象限，CK 處于第二象限，T1處于第四象限，說明不同菌肥處理改變了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。在PC1維度上，將CK 處理和其余2個處理分開，說明CK 處理與T1、T2處理間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異性。

圖3 不同處理下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)PCA圖

土壤樣品中共檢測出細(xì)菌23 門70 綱141 目206 科308屬139種。由圖4可知，在門水平下，排在前10的優(yōu)勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞(Gemmatimonadetes)、髕骨細(xì)菌門(Patescibacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospira)、棒狀桿菌門(Rokubacteria)。變形菌門(Proteobacteria)作為三個處理的優(yōu)勢菌門，相對豐度均占據(jù)50%左右。相比對照CK，T1、T2處理下滋生土壤厚壁菌門(Firmicutes)，這與菌肥中所含菌種為芽孢桿菌屬有關(guān)，系厚壁菌門類，且T1處理占比大于T2處理。相比CK，T1和T2處理降低了酸桿菌(Acidobacteria)含量，且T1效果更明顯。相比對照CK，T1和T2均提高了土壤中放線菌門(Actinobacteria)的含量。

圖4 不同菌肥量處理下細(xì)菌門水平相對豐度

在屬水平上，排在前十的優(yōu)勢菌屬分別為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、馬賽菌屬(Massilia)、Unclassified_f_Spor olactobacillaceae、Unclassified_o_Saccharimonadales、Unclassified_f_SC-I-84、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、Unclassified_f_uncultured、羅河桿菌 屬(Rhodanobacter)、Unclassified_c_ Subgroup_6、芽孢桿菌屬(Bacillus)。由圖5 可知，T1相比對照CK，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)含量明顯降低。本研究發(fā)現(xiàn)，T1處理馬賽菌屬(Massilia)含量明顯高于CK 和T2。研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬T1處理占比高于T2和CK 處理，類芽孢桿菌屬與其類似。

圖5 不同菌肥量處理下細(xì)菌屬水平相對豐度

2.3 不同菌肥量處理對設(shè)施芹菜產(chǎn)量的影響

由表2可知，通過不同肥料處理下設(shè)施芹菜產(chǎn)量表現(xiàn)T1最高，為88.9 t·hm-2，與CK 相比提高了23.3 t·hm-2，且達(dá)到顯著性差異。其次為T2處理，產(chǎn)量96.7 t·hm-2，比CK 處理提高了7.8 t·hm-2。說明不同菌肥量代替部分化肥處理對設(shè)施芹菜產(chǎn)量均有不同程度的提升。芹菜莖的粗纖維和維生素C含量，T1處理分別比CK提高了0.1%和1.3 mg·(100 g)-1。

表2 不同菌肥量處理對設(shè)施芹菜產(chǎn)量及部分品質(zhì)的影響

3 討論與結(jié)論

大量研究表明，不同肥料類型或用量與土壤微生物數(shù)量、組成及結(jié)構(gòu)多樣性差異之間緊密相關(guān)[12-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在門水平上，T1、T2處理下滋生土壤厚壁菌門。厚壁菌門表現(xiàn)為球狀或者桿狀，很多厚壁菌可以產(chǎn)生芽孢，可以抵抗脫水和極端環(huán)境。有一類厚壁菌，太陽桿菌科可以通過光合作用產(chǎn)生能量。研究發(fā)現(xiàn)，T1和T2處理降低了酸桿菌(Acidobacteria)含量。有研究表明，酸桿菌為貧營養(yǎng)細(xì)菌，多存在于營養(yǎng)貧瘠的土壤環(huán)境中，其豐富度與土壤質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)，且酸桿菌具有嗜酸性，其豐度增加土壤呈酸化[16-18]。放線菌的代謝活動能促進(jìn)動植物等有機(jī)物質(zhì)的分解，細(xì)化成作物可以直接吸收利用的有效磷、有效氮、有效鉀等成分。研究發(fā)現(xiàn)，T1和T2均提高了土壤中放線菌門(Actinobacteria) 的含量。鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)作為一種解磷菌，能夠提高土壤中有效磷含量，增加土壤肥力，促進(jìn)植物生長，緩解作物連作障礙。有研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的鞘氨醇單胞菌液處理更能有效促進(jìn)連作西瓜幼苗的生長，此現(xiàn)象可能由于菌株投加密度過大，導(dǎo)致生存空間不足，致使其菌內(nèi)競爭加大，影響了根際微生物的群體效應(yīng)[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)T1相比對照CK，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)含量明顯降低。馬賽菌屬(Massilia)具有參與碳氮循環(huán)、分泌生長素和酶、溶磷、降解多環(huán)芳烴菲、抗多種重金屬等功能，在防治土傳病害、修復(fù)土壤方面具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，T1處理馬賽菌屬(Massilia)濃度明顯高于CK和T2。芽孢桿菌具有激活土壤、提高有機(jī)質(zhì)分解能力、提高抗逆性、凈化環(huán)境、抑制有害菌等功能。本研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬（Bacillus）和類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)濃度表現(xiàn)為T1處理最高，其次為T2處理，可能是因?yàn)榫手兴N為芽孢桿菌屬，而施用量過高導(dǎo)致土壤孔隙度降低，土壤透氣性差，反而不利于其繁殖。

微生物菌肥中有多種有益微生物，加速動植物殘體的腐化和纖維素的降解，增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，分泌的膠性物質(zhì)促進(jìn)土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的形成，使土壤疏松。同時，微生物代謝產(chǎn)生的酸類物質(zhì)促進(jìn)土壤養(yǎng)分的分解，從而提高土壤肥力，提升作物品質(zhì)，增加產(chǎn)量。本研究發(fā)現(xiàn)，T1和T2處理均不同程度地提升了芹菜的產(chǎn)量及粗纖維、維生素C含量。

通過研究不同微生物菌肥量替代部分化肥對設(shè)施芹菜土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性和產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明，從Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)看出，T1和T2處理對土壤細(xì)菌豐度和多樣性具有一定程度的抑制作用，且T1處理更明顯；從PCA 分析可知，T1、T2處理與CK 處理間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異性；從門和屬水平分析土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)T1處理提高土壤芽孢桿菌等有益菌的濃度，且增加程度高于T2處理，這對修復(fù)土壤生態(tài)環(huán)境具有良好的效果；T1和T2處理提高了芹菜的產(chǎn)量和粗纖維、維生素C 含量，且T1效果更明顯。綜合考慮，T1處理對設(shè)施芹菜土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和產(chǎn)量的效果最佳。