李小娟 郭思佳 孫增濤 王坤 李曉丹 岳寶柱 欒哲宇

(1天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸科,天津 300250;2天津中醫(yī)藥大學(xué);3鄭州市第三人民醫(yī)院呼吸科)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以氣流受限為主要特征的呼吸系統(tǒng)常見病與高發(fā)病。該病雖可預(yù)防和治療,但由于病程遷延反復(fù),疾病往往呈進(jìn)行性發(fā)展,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和勞動(dòng)能力,為社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)〔1〕。據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)目前COPD患者已達(dá)到約1億人,其中40歲以上人群的患病率高達(dá)13.7%〔2〕。COPD患者的肺血管病變是其特征性病理學(xué)改變之一,也是其發(fā)展成肺心病的重要原因。研究顯示,COPD患者中每年有約6%發(fā)展至肺心病,尸檢資料顯示,COPD患者中約有40%存在右心室肥大〔3〕。因此,認(rèn)識(shí)COPD進(jìn)展中肺血管病變的形成機(jī)制,針對(duì)性進(jìn)行干預(yù),是延緩COPD發(fā)展為肺心病的關(guān)鍵。

低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1是機(jī)體中調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的核心轉(zhuǎn)錄因子,它是由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞基組成的異二聚體。HIF-1α在常氧時(shí)基本不表達(dá),當(dāng)機(jī)體處于缺氧狀態(tài)下則呈現(xiàn)高表達(dá),促使細(xì)胞及組織發(fā)生一系列反應(yīng)以使機(jī)體適應(yīng)缺氧環(huán)境〔4〕。相關(guān)研究〔5,6〕顯示,在COPD患者肺組織中 HIF-1α mRNA及其蛋白質(zhì)的含量均明顯升高,提示HIF-1α與缺氧性肺血管病變可能存在明顯相關(guān)性。HIF-1在缺氧早期即出現(xiàn)表達(dá)上調(diào),其通過調(diào)控多種靶基因的表達(dá),參與機(jī)體缺氧早期最先出現(xiàn)的分子水平適應(yīng)性反應(yīng)。諸多內(nèi)源性細(xì)胞因子失衡都可以由缺氧誘發(fā),如熱休克蛋白(HSP)90、內(nèi)皮素(ET)-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)生成增多,誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)釋放異常等〔7〕,這一系列變化反應(yīng)會(huì)引起肺血管收縮/舒張反應(yīng)失衡,造成肺血管重塑,最終導(dǎo)致COPD肺血管病變的發(fā)生。本研究通過檢測(cè)COPD大鼠建模過程中肺組織HIF-1及其復(fù)合信號(hào)通路的基因表達(dá)情況,分析肺組織HIF-1復(fù)合通路基因表達(dá)改變情況與COPD肺血管病變發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康的雄性SD大鼠30只,體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)自維通利華生物科技股份有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006。于溫度20～22 ℃,濕度50%左右環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2主要試劑及儀器 脂多糖(LPS,Sigma,批號(hào):L2880);10% 甲醛固定液(索萊寶生物科技有限公司);無(wú)水乙醇(索萊寶生物科技有限公司);組織細(xì)胞總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司);cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司);q-聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增試劑盒(天根生化科技有限公司);研究級(jí)倒置熒光顯微鏡(Olympus公司IX2-UCB型);超凈工作臺(tái)(ThermoFisher賽默飛世爾Herasafe KS型);高性能通用臺(tái)式冷凍離心機(jī)(ThermoFisher賽默飛世爾Sorvall ST 16R型);小型臺(tái)式離心機(jī)(ThermoFisher賽默飛世爾);-80 ℃超低溫冰箱(ThermoFisher賽默飛世爾ULT2186-6-V49型);熒光定時(shí)定量 PCR 儀(Bio-Rad伯樂JJQ5型)。

1.3分組及模型構(gòu)建 將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組10只和模型組20只,模型組后續(xù)分為造模6 w組和造模12 w組。正常組正常飼養(yǎng),呼吸正?？諝?模型組每天在染毒箱內(nèi)被動(dòng)吸煙(大前門牌烤煙型過濾嘴香煙,卷煙條碼:6901028075916,煙氣煙堿量:0.8 mg) 10支,1 d分上下午煙熏2次,每次60 min,每煙熏6 d,休息1 d,共持續(xù)熏煙12 w。在實(shí)驗(yàn)開始的第1天及第29天,使兩組吸入乙醚麻醉,在其氣道內(nèi)分別緩慢滴注200 μl生理鹽水和200 μl LPS水溶液(1 mg/ml),且當(dāng)日不再予被動(dòng)吸煙,通過以上方法構(gòu)建COPD大鼠模型。實(shí)驗(yàn)過程中共有2只大鼠死亡,均來(lái)自模型組。

1.4標(biāo)本采集 于造模前選取10只正常組大鼠,用2%戊巴比妥鈉 100 mg/kg腹腔麻醉后,酒精消毒,打開胸腔,收集肺組織,將右肺組織中葉于-80 ℃冰箱保存,以備后續(xù)檢測(cè),左肺組織置于甲醛溶液中固定,至6 w隨機(jī)選取模型組大鼠10只進(jìn)行上述操作,至12 w造模完成后,將剩余模型組大鼠進(jìn)行上述操作。

1.5q-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá) 各組肺組織進(jìn)行q-PCR檢測(cè),將肺組織在液氮中磨碎,參照組織細(xì)胞總RNA提取試劑盒說明書提取組織總RNA。以總RNA為模板,參照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。使用熒光定時(shí)定量PCR儀以cDNA鏈為模板檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)。循環(huán)溫度為:94 ℃ 4 min、94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,循環(huán)數(shù)為40,以磷酸甘油醛脫氫酶(GADPH)為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法比較分析各基因表達(dá),PCR引物序列(3′-5′):GADPH上游引物:GGCAAGTTCAACGGCACAG,下游:CGCCAGTAGACTCCACGACA;HIF-1α上游引物:CGCAACTGCCACCACTGATGAA,下游:GTGAGGCTGTCCGACTGTGAGTA;HSP-90上游引物:TTTCCAACTCCTCAGACGCTC,下游:AGGGTT-CGGTCTTGCTTGTT;VEGF上游引物:CGACAAGGCAGACTATTCAACG,下游:GGCACGATTTAAG-AGGGGAAT;ET-1上游引物:TTCAGACTGGCAGAGGACCA,下游:TCACTTGCTACCAGCGGATG;iNOS上游引物:TCTGTGCTAATGCGGAAG,下游:TTGGTGTTGAAGGCGTAG。

1.6肺組織病理切片 經(jīng)洗滌、脫水、透明、透蠟、包埋、切片、展片、貼片、脫蠟復(fù)水、染色、水洗、分化、漂洗、脫水、復(fù)染、脫水、透明、封藏等步驟制成病理切片,最終細(xì)胞核被蘇木素染成藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)被伊紅染成粉紅色。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件行單因素方差分析,方差齊時(shí)用LSD法,方差不齊時(shí)用Dunnett法。

2 結(jié) 果

2.1COPD模型造模后不同時(shí)間點(diǎn)肺組織病理學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示,正常組肺組織中支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)完整,黏膜下未出現(xiàn)明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn),而在造模6 w后,相較正常組,支氣管結(jié)構(gòu)仍較為完整,但在黏膜下出現(xiàn)了明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn)(黑色箭頭),與此同時(shí),肺泡出現(xiàn)結(jié)構(gòu)不一,肺泡壁變薄或斷裂引起部分肺泡擴(kuò)大融合形成肺大泡(紅色箭頭),肺血管表現(xiàn)出不同程度增生,管壁增厚或管腔變形,管壁及周圍可見較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn),微血管數(shù)量明顯增多(黃色箭頭);造模12 w后,COPD模型支氣管結(jié)構(gòu)出現(xiàn)一定程度損傷,部分支氣管上皮細(xì)胞脫落(藍(lán)色箭頭),黏膜下出現(xiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(黑色箭頭),肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,并進(jìn)一步擴(kuò)張融合形成大量肺大泡(紅色箭頭),且肺血管持續(xù)增生,其不論是管壁增厚還是管腔變形均較前有所加重,微血管數(shù)量進(jìn)一步增多(黃色箭頭)。見圖1。

圖1 COPD模型造模6、12 w時(shí)肺組織(HE染色,×200)

2.2造模后不同時(shí)間點(diǎn)肺組織基因表達(dá)水平 與正常組相比,造模6、12 w后肺組織中HIF-1α、HSP90、VEGF、ET-1 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05,P<0.01),且造模12 w后肺組織中HIF-1α、VEGF、iNOS mRNA表達(dá)與造模6 w時(shí)相比顯著上調(diào)(P<0.05)。與造模6 w時(shí)相比,造模12 w后肺組織中HSP90、ET-1 mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。與正常組相比,iNOS mRNA表達(dá)在造模6 w時(shí)無(wú)顯著差異(P>0.05),造模12 w后肺組織中iNOS mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。見表1。

表1 造模后不同時(shí)間點(diǎn)肺組織中HIF1-α、HSP90、VEGF、ET-1及iNOS mRNA表達(dá)水平

2.3COPD模型造模后不同時(shí)間點(diǎn)肺組織中HIF-1復(fù)合通路相關(guān)基因表達(dá)水平 分別收集正常組、造模6、12 w組肺組織,q-PCR法檢測(cè)COPD模型造模后不同時(shí)間點(diǎn)HIF-1復(fù)合通路關(guān)鍵基因HIF-1α、HSP90、VEGF、iNOS及ET-1 mRNA表達(dá),GAPDH被選取作為內(nèi)參。各基因擴(kuò)增曲線見圖2?？梢姼骰蛞飻U(kuò)增曲線重復(fù)性良好,溶解曲線呈單峰,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

3 討 論

HIF-1是廣泛分布于人體內(nèi)的一種異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子,由120 kU的HIF-1α 和91～94 kU的HIF-1β兩個(gè)亞單位組成〔8〕。HIF-1蛋白只有機(jī)體處于缺氧狀態(tài)下才具有活性,常氧下HIF-1蛋白很快失去活性。HIF-1的調(diào)控活性取決于它的α亞基,激活的HIF-1α通過增加與下游基因缺氧反應(yīng)元素的結(jié)合,對(duì)多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和翻譯起到調(diào)控作用〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)〔10〕隨著COPD病程進(jìn)展,血液及肺組織中HIF-1α的表達(dá)均進(jìn)一步升高,平均肺動(dòng)脈壓也隨之增加,體現(xiàn)血管重構(gòu)的指標(biāo)血管壁厚度/血管外徑(WT)%及血管壁橫斷面積/血管橫斷面積(WA)%也明顯升高,提示HIF-1α與肺血管病變存在顯著的相關(guān)性。與本研究結(jié)果一致,進(jìn)一步證明HIF-1復(fù)合信號(hào)通路參與了COPD肺血管病變的發(fā)生發(fā)展。

當(dāng)機(jī)體輕度缺氧時(shí),HIF-1α的表達(dá)即開始上調(diào),伴隨著機(jī)體持續(xù)缺氧的加重,當(dāng)機(jī)體細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含氧量低于5%處于重度缺氧狀態(tài)時(shí),HSP90表達(dá)開始上調(diào)。HSP90作為HIF-1α的增強(qiáng)子,對(duì)HIF-1α也同樣起著調(diào)節(jié)作用,其可以與HIF-1α的PAS區(qū)特異結(jié)合,使HIF-1α結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,從而干預(yù)HIF-1α的泛素化降解〔11〕。故如果低氧持續(xù)得不到改善,將導(dǎo)致HIF-1α生成增多,而降解減少,形成惡性循環(huán)。HSP90活性被破壞可導(dǎo)致蛋白酶體降解HIF-1α,研究發(fā)現(xiàn)〔12〕HSP90的抑制劑17-AAG和17-DMAG能夠促進(jìn)HIF-1α蛋白的降解,進(jìn)而抑制血管的生成。作為HIF-1的下游基因,現(xiàn)已有研究證實(shí),HSP90同樣具有促進(jìn)血管生成的作用,是血管生成的關(guān)鍵分子之一〔13〕。在HSP90低氧時(shí)的增強(qiáng)作用下,HIF-1α結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,HIF-1復(fù)合通路在低氧時(shí)得以進(jìn)一步過量表達(dá)。

有研究發(fā)現(xiàn)〔14〕,在合并肺動(dòng)脈高壓的COPD患者中,呼出氣冷凝液及循環(huán)血液中的ET-1水平均較常人明顯上升,并且其濃度與肺動(dòng)脈的收縮壓或平均壓表現(xiàn)出明顯的關(guān)聯(lián)性。ET-1作為一種由21個(gè)氨基酸構(gòu)成的生物活性多肽,是至今所發(fā)現(xiàn)的功效最強(qiáng)的縮血管生物因子,廣泛分布于肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中〔15〕。低氧狀態(tài)時(shí),HIF-1α能夠與ET-1啟動(dòng)子區(qū)域的 HIF-1結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合,激活內(nèi)皮細(xì)胞ET-1表達(dá)〔16〕。ET-1的過量表達(dá)會(huì)引起肺動(dòng)脈強(qiáng)烈收縮,促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、血管外膜成纖維母細(xì)胞及膠原纖維的增殖,并可通過激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Rho)減少血管和肺泡的生長(zhǎng),進(jìn)而引起肺血管病變〔17〕。

相關(guān)研究顯示〔18〕,VEGF在COPD患者血及痰液中的含量明顯高于健康人群,且其升高水平與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生密切相關(guān),提示VEGF參與肺血管病變的發(fā)展。VEGF的增強(qiáng)子中含有可與HIF-1α結(jié)合的低氧反應(yīng)元件,當(dāng)與增強(qiáng)子結(jié)合后可增強(qiáng)其蛋白水平的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄,此外,HIF-1可在缺氧情況下有效增強(qiáng)VEGF mRNA穩(wěn)定性,促使其缺氧時(shí)大量表達(dá)。VEGF是一種具有多種功能效應(yīng)的細(xì)胞因子,其主要在人體血管豐富的器官及組織中分布,可以介導(dǎo)血管生成與血管重塑的發(fā)生〔19〕。有研究表明〔20〕,VEGF能夠通過上調(diào)ET-1的表達(dá),增強(qiáng)血管基質(zhì)金屬蛋白酶活性,以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖,參與血管重塑。作為已發(fā)現(xiàn)的功效最強(qiáng)的血管通透劑,它不但可以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移,還能誘導(dǎo)體內(nèi)血管形成,在肺血管病變過程中扮演著重要角色〔21〕。

機(jī)體正常狀態(tài)下僅合成少量的NO,其作為重要的細(xì)胞信使,少量?jī)?nèi)源性NO能夠舒張血管,改善組織微循環(huán),發(fā)揮調(diào)節(jié)肺血流及免疫防御的功效。而當(dāng)機(jī)體處于缺氧狀態(tài)時(shí),HIF-1α的大量表達(dá)可以激活NOS的轉(zhuǎn)錄,使其表達(dá)量顯著增加,釋放大量NO,產(chǎn)生自由基,損傷內(nèi)皮細(xì)胞,造成血管活性物質(zhì)的異常改變及血管收縮-舒張功能失調(diào),使肺血管發(fā)生痙攣,引起肺動(dòng)脈壓升高〔22〕。NO也是一種致炎因子,在炎癥反應(yīng)中,NO可以激活白細(xì)胞并促進(jìn)其遷移,高濃度NO的毒性作用會(huì)增加血管內(nèi)壁的通透性,誘發(fā)血管炎癥,致使血管擴(kuò)張、內(nèi)膜增厚,最終引發(fā)肺泡-肺毛細(xì)血管功能的異常改變〔23,24〕。

綜上,COPD肺血管病變的發(fā)生、發(fā)展與HIF-1復(fù)合信號(hào)通路的表達(dá)相關(guān),且隨著COPD肺血管病變時(shí)間的延長(zhǎng),HIF-1復(fù)合信號(hào)通路的表達(dá)也逐漸升高,說明HIF-1及其下游靶基因在缺氧性肺血管病變形成中起重要作用,對(duì)研究相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制有重要意義,可將HIF-1作為靶點(diǎn),通過抑制其復(fù)合通路的表達(dá),以改善或阻止肺血管的重構(gòu),從而起到治療肺心病等肺血管疾病的作用。而HIF-1復(fù)合通路復(fù)雜,下游靶基因眾多,是否還存在其他下游基因參與介導(dǎo)了缺氧性肺血管病變過程仍值得深入研究。