王介華，睢金凱，崔令軍，石開明

（1.湖北民族大學(xué) 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000；2.河北科技師范學(xué)院 海洋資源與環(huán)境學(xué)院，河北 秦皇島 066000）

鹽脅迫是自然界主要的非生物脅迫之一，鹽脅迫對(duì)植物的影響主要包括植物生長(zhǎng)、礦質(zhì)元素吸收和代謝生理等方面。研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下植株體內(nèi)礦質(zhì)元素含量減少，生物量降低，導(dǎo)致植株減產(chǎn)和質(zhì)量下降[1]。目前應(yīng)用接種叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）來(lái)提高植物對(duì)鹽堿耐受性的方法日益受到農(nóng)林學(xué)家廣泛關(guān)注，AMF 可以與地球上約80%的植物根系建立共生關(guān)系并形成叢枝菌根[2]，能夠促進(jìn)宿主植物對(duì)土壤中大量元素磷、鉀和微量元素鋅、銅等的吸收[3]，從而增加生物量；同時(shí)AMF 可以促進(jìn)植株體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)，提高可溶性蛋白、可溶性糖和Pro 的含量，增加超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶的活性[4-5]，從而能夠減輕植物受到外界環(huán)境脅迫時(shí)的不利影響，提高植物的抗逆能力。

楨楠（PhoebezhennanS.Lee & F.N.Wei）為樟科Rosaceae 楠屬PhoebeNees常綠大喬木，是亞熱帶常綠落葉闊葉林的重要組成樹種，由于氣候變化和自然災(zāi)害等因素的影響，目前楠木資源較為缺乏，現(xiàn)存林分主要生長(zhǎng)在我國(guó)的四川、貴州、湖北、湖南和浙江等省份[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)AMF在高鹽濃度下（300 mmol·L-1）對(duì)楨楠根系具有較高的侵染率（41.25%），且AMF 能夠顯著地促進(jìn)楨楠根系生長(zhǎng)[7]。因此，本試驗(yàn)以楨楠為材料，探討叢枝菌根真菌在改善楨楠耐鹽性方面的作用，旨在促進(jìn)楨楠在鹽堿環(huán)境中的生長(zhǎng)，提高楨楠的抗鹽能力，為拓寬楠木的種植范圍和鹽堿地區(qū)發(fā)展楠木產(chǎn)業(yè)及其他樹種造林提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以楨楠為試驗(yàn)材料，2017 年11 月上旬于湖北省恩施土家族苗族自治州林業(yè)科學(xué)研究院（109°29＇58″E，30°17’51″N）采集種子，室溫下陰干后調(diào)制，置于冰箱中4 ℃下保存。所用AMF 菌種為Funneliformismosseae，購(gòu)于中國(guó)叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫(kù)，并以三葉草Trifoliumrepens為寄主植株進(jìn)行擴(kuò)繁；接種菌劑包含AMF 侵染的三葉草根段及真菌孢子，每個(gè)真菌接種處理接種120 g菌劑（約1 500 個(gè)孢子）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2018 年3 月，將種子取出后用10%的碳酸氫鈉溶液浸泡48 h，然后搓洗去除種子表面包被的油脂，經(jīng)70%的酒精消毒后用蒸餾水清洗干凈，置于滅菌（0.11 MPa，121 ℃，1 h）的河沙中催芽。將催芽的種子置于人工氣候箱內(nèi)，晝夜溫度分別設(shè)置為25 ℃和18 ℃，相對(duì)濕度80%，光照時(shí)間16 h，黑暗時(shí)間8 h。選取高度一致、具有4 片真葉的無(wú)菌楨楠幼苗移栽到塑料盆中（苗高20 cm左右），加入1.5 kg 消毒（0.11 MPa，121 ℃，1 h）基質(zhì)（土壤∶沙=1∶1，V/V）。試驗(yàn)于8 月中旬進(jìn)行，設(shè)AMF 接種（+AMF）處理和未接種（-AMF）2組處理，每個(gè)處理種植10 盆，每盆3 株幼苗。接種菌劑包含AMF 真菌侵染的三葉草根段及AMF真菌孢子，未接種處理在塑料盆中填充相同質(zhì)量的滅菌物質(zhì)以保持微生物區(qū)系一致。NaCl 處理為100、200 和300 mmol·L-1，以蒸餾水為對(duì)照（CK），隔3 d 澆1 次鹽水，每次各澆100 mL，缽下放盤，為保持盆內(nèi)鹽濃度，如有滲漏，將滲出液反倒回去，鹽脅迫30 d 后進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

植株高度和地徑用游標(biāo)卡尺測(cè)量。采集正常生長(zhǎng)的完整植株，然后分離每株的地下部分（根）和地上部分（莖葉）并用去離子水清洗，用吸水紙吸干表面水分，記錄鮮質(zhì)量，然后將植株的根、莖、葉放置在烘箱中70 ℃下烘干至恒質(zhì)量后測(cè)定干物質(zhì)質(zhì)量，每個(gè)處理測(cè)定5 次。

1.3.2 礦質(zhì)元素含量測(cè)定

N 元素含量采用AA3 連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定；P 元素含量采用鉬銻抗比色法測(cè)定；Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn、K 和Na 元素含量采用Optimal 2100 DV 電感耦合等離子發(fā)射光譜儀（美國(guó)Pekin-Elmer 公司）測(cè)定[8]，每個(gè)處理測(cè)定5 次。

1.3.3 生理指標(biāo)測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G—250 法測(cè)定可溶性蛋白含量，蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量，酸性茚三酮比色法測(cè)定脯氨酸（Pro）含量，硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（MDA）含量，氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性，愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性，紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，分光光度計(jì)法測(cè)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性[8]，每個(gè)處理測(cè)定5 次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003 和SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，用Two-way ANOVA 與S-N-K 檢驗(yàn)分析各處理間差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下AMF 對(duì)楨楠生長(zhǎng)的影響

由表1 可以看出，在不同濃度NaCl 脅迫下，AMF 顯著提高了楨楠的株高、基徑、地上部干物質(zhì)質(zhì)量和根系干物質(zhì)質(zhì)量，AMF 接種與未接種楨楠的株高、基徑和根系干物質(zhì)質(zhì)量均呈顯著差異（P＜0.05）。在NaCl 濃度為100 mmol·L-1時(shí)，AMF 接種比未接種楨楠的株高增加了20.26%，基徑增加了24.12%，地上部干物質(zhì)質(zhì)量增加了10.11%，根系干物質(zhì)質(zhì)量增加28.81%。雙因素方差分析結(jié)果顯示，AMF 對(duì)株高、基徑和根干物質(zhì)質(zhì)量有顯著影響，鹽脅迫對(duì)地上部干物質(zhì)質(zhì)量有顯著影響。

表1 鹽脅迫和AMF 處理對(duì)楨楠生長(zhǎng)指標(biāo)的影響?Table 1 Combinative effects of AMF and salt stress on the plant growth index of P. zhennan

2.2 鹽脅迫下AMF 對(duì)楨楠大量元素含量的影響

由圖1 可以看出，在NaCl 濃度為100、200 和300 mmol·L-1時(shí)，AMF 接種比未接種楨楠的N 含量分別減少了4.89%、2.34%和7.34%，但差異均不顯著。在NaCl 濃度為100 mmol·L-1時(shí)，AMF接種比未接種楨楠的P 含量增加了2.85%，Mg 含量增加了16.24%。雙因素方差分析結(jié)果顯示，AMF、鹽脅迫對(duì)Ca 含量影響顯著，AMF 與鹽脅迫的交互作用對(duì)Mg 含量的影響均為顯著。

2.3 鹽脅迫下AMF 對(duì)楨楠微量元素含量的影響

由圖2 可以看出，在NaCl 濃度為300 mmol·L-1時(shí)，AMF 接種比未接種楨楠的Fe 含量增加了3.60%，Mn 含量增加了16.39%；在NaCl 濃度為100 mmol·L-1時(shí)，AMF 接種比未接種楨楠的Cu 含量增加了8.12%，Zn 含量增加了19.40%。雙因素方差分析結(jié)果表明，AMF 對(duì)Zn 含量的影響均為顯著，AMF 與鹽脅迫的交互作用對(duì)Cu 和Zn 含量的影響均為顯著。

圖2 鹽脅迫和AMF 處理對(duì)楨楠微量元素含量的影響Fig.2 Combinative effects of AMF and salt stress on the micronutrient concentrations of P. zhennan

2.4 鹽脅迫下AMF 對(duì)楨楠K、Na 含量及K/Na的影響

由圖3 可以看出，在NaCl 濃度為100、200 和300 mmol·L-1時(shí)，AMF 接種比未接種楨楠的K 含量分別增加了22.11%、11.36%和7.19%，Na 含量減少了28.38%、25.13%和49.68%，K/Na 增加了64.82%、41.17%和61.28%，且均呈顯著性差異（P＜0.05）。雙因素方差分析結(jié)果顯示，鹽脅迫對(duì)K 含量的影響顯著，AMF 對(duì)K/Na 的影響顯著，AMF與鹽脅迫的交互作用對(duì)Na 含量的影響顯著。

圖3 鹽脅迫和AMF 處理對(duì)楨楠K、Na 元素含量及K/Na 的影響Fig.3 Combinative effects of AMF and salt stress on the concentrations of K and Na as well as K/Na ratios of P. zhennan

2.5 鹽脅迫下AMF 對(duì)楨楠滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由圖4A 可以看出，在NaCl 濃度為100、200和300 mmol·L-1時(shí)，AMF 接種比未接種楨楠的Pro 含量分別增加了28.34%、39.37%和57.82%。雙因素方差分析結(jié)果表明AMF 對(duì)Pro 含量有顯著影響，鹽脅迫對(duì)Pro 含量無(wú)顯著影響（表2）。

圖4 鹽脅迫和AMF 處理對(duì)楨楠滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響Fig.4 Combinative effects of AMF and salt stress on osmotic adjustment substances of P. zhennan

表2 接種AMF、鹽脅迫和二者交互作用對(duì)楨楠生長(zhǎng)及生理指標(biāo)的影響?Table 2 ANOVA for the combinative effects of AMF and salt stress on the growth and physiological indicators of P. zhennan

由圖4B 可以看出，在NaCl 濃度為100、200 和300 mmol·L-1時(shí)，AMF 接種比未接種楨楠的可溶性糖含量分別增加了21.32%、48.82%和55.13%。雙因素方差分析結(jié)果顯示，AMF 和鹽脅迫對(duì)可溶性糖含量有顯著影響（表2）。

由圖4C 可以看出，在NaCl 濃度為100、200和300 mmol·L-1時(shí)，AMF 接種比未接種楨楠的可溶性蛋白含量分別增加了12.02%、16.07%和20.74%。雙因素方差分析結(jié)果表明，AMF 對(duì)可溶性蛋白含量有極顯著影響，鹽脅迫對(duì)可溶性蛋白有顯著影響（表2）。

由圖4D 可以看出，在NaCl 濃度為100、200和300 mmol·L-1時(shí)，AMF 接種比未接種楨楠的MDA 含量分別降低了12.43%、20.23%和3.54%。雙因素方差分析結(jié)果顯示，AMF 對(duì)MDA 含量有極顯著影響，鹽脅迫及對(duì)MDA含量無(wú)顯著影響（表2）。

2.6 鹽脅迫下AMF 對(duì)楨楠抗氧化酶活性的影響

由圖5A 可以看出，在NaCl 濃度為100、200和300 mmol·L-1時(shí)，AMF 接種比未接種楨楠的SOD 活性分別增加了16.03%、16.74%和10.59%。雙因素方差分析結(jié)果顯示，AMF 對(duì)SOD 活性有顯著影響，鹽脅迫SOD 活性無(wú)顯著影響（表2）。

圖5 鹽脅迫和AMF 處理對(duì)楨楠抗氧化酶活性的影響Fig.5 Combinative effects of AMF and salt stress on the antioxidant enzyme activity of P. zhennan

由圖5B 可以看出，在NaCl 濃度為100、200和300 mmol·L-1時(shí)，AMF 接種比未接種楨楠的POD 活性分別增加了44.16%、37.88%和34.41%。雙因素方差分析結(jié)果表明，AMF 對(duì)POD 活性有顯著影響，鹽脅迫對(duì)POD 活性無(wú)顯著影響（表2）。

由圖5C 可以看出，在NaCl 濃度為100、200 和300 mmol·L-1時(shí)，AMF 接種比未接種楨楠的CAT 活性分別增加了40.82%、42.11% 和30.25%。雙因素方差分析結(jié)果顯示，AMF、鹽脅迫對(duì)CAT 活性無(wú)顯著影響（表2）。

由圖5D 可以看出，在NaCl 濃度為100、200和300 mmol·L-1時(shí)，AMF 接種比未接種楨楠的APX 活性分別增加了26.37%、24.11%和1.45%。雙因素方差分析結(jié)果顯示，鹽脅迫對(duì)APX 活性有顯著影響，AMF 對(duì)APX 活性無(wú)顯著影響（表2）。

3 結(jié)論與討論

鹽害對(duì)植物最直接的影響就是降低生物量的積累，因此生長(zhǎng)量是植物耐鹽性評(píng)價(jià)的直接指標(biāo)[9-10]。土壤中高濃度的NaCl 不僅會(huì)引起植物體內(nèi)Na 和Cl 元素的過(guò)量積累，還會(huì)影響土壤中其他營(yíng)養(yǎng)元素的活性，導(dǎo)致植物細(xì)胞處于營(yíng)養(yǎng)虧缺的狀態(tài)中。對(duì)小麥和大麥[10]耐鹽性和柱子草[12]耐鹽生理的研究表明，鹽脅迫可導(dǎo)致葉片變小、干質(zhì)量降低和生長(zhǎng)量減弱等不良影響；而接種菌根真菌可以緩解鹽害對(duì)植物的危害，促進(jìn)鹽脅迫下生物量的積累[13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在同等鹽濃度脅迫下，接種AMF 的生長(zhǎng)與生物量均顯著高于未接種，表明AMF 能夠顯著減緩鹽脅迫對(duì)楨楠生長(zhǎng)的影響，這與對(duì)紅花[14]、核桃[15]、黑松[16]的研究結(jié)果一致。

土壤鹽漬化導(dǎo)致植株細(xì)胞內(nèi)積累了大量的Na+，使植株產(chǎn)生離子毒害并降低對(duì)礦質(zhì)元素的吸收。對(duì)藍(lán)莓[17]、沙棗[18]和西伯利亞白刺[19]耐鹽性的研究結(jié)果表明，鹽脅迫不僅使大量元素的吸收減少，同時(shí)也削弱了對(duì)微量元素的吸收，導(dǎo)致植物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)元素缺乏和細(xì)胞內(nèi)代謝紊亂。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在同等鹽濃度脅迫下，AMF 接種的Cu 和Zn 含量顯著高于未接種，這與對(duì)刺槐[20]的研究結(jié)果一致，鹽脅迫下接種AMF 后礦質(zhì)元素含量升高主要是由于鹽脅迫使生物量下降較多，其余元素含量在較少的生物量中積累升高所導(dǎo)致。鹽脅迫下，植物通過(guò)調(diào)節(jié)有機(jī)物質(zhì)如Pro、可溶性糖等的含量來(lái)提高其耐鹽性[21]，這些物質(zhì)的積累有利于植物在高鹽脅迫下對(duì)水分的吸收，保證細(xì)胞的正常生理功能[22-23]；其中，Pro 能夠降低細(xì)胞的水勢(shì)，調(diào)節(jié)滲透平衡，AMF 可以通過(guò)增加Pro的積累來(lái)提高植物的耐鹽性。本試驗(yàn)中，NaCl 濃度為100、200 和300 mmol·L-1時(shí)，AMF 接種比未接種的楨楠Pro 含量分別增加了28.34%、39.37%和57.82%，表明AMF 接種能夠增加Pro 含量，但隨著鹽濃度增加，AMF 接種的楨楠Pro 含量呈先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)鹽濃度超出一定范圍（在本試驗(yàn)中為200 mmol·L-1）時(shí)Pro 含量便下降。這與沙棗、小麥[24]、麻黃[25]等在鹽脅迫下接種AMF 后Pro 含量的變化規(guī)律一致。

對(duì)鹽脅迫下大麥和小麥[26]等葉片脂質(zhì)過(guò)氧化的研究發(fā)現(xiàn)，鹽分可以增加膜的透性，增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化作用。SOD、POD、CAT 及APX 是植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，通過(guò)相互協(xié)調(diào)來(lái)清除活性氧和丙二醛[27]。本研究中，AMF 接種比未接種的楨楠SOD、POD、CAT 和APX 活性均增加，表明AMF 能夠提高楨楠的抗氧化酶活性；本試驗(yàn)中，NaCl 濃度為200 mmol·L-1時(shí)，SOD、POD、CAT和APX 活性均下降，這與張勇等[28]的研究結(jié)果一致，紅芪在低鹽脅迫下通過(guò)提高SOD、POD 活性來(lái)加強(qiáng)自身的耐鹽性，但當(dāng)鹽濃度超出一定范圍時(shí)，SOD、POD 活性便開始下降，這說(shuō)明雖然植物在受到鹽脅迫時(shí)能夠通過(guò)提高自身酶活性來(lái)清除有害離子，但一旦超過(guò)一定濃度范圍便會(huì)導(dǎo)致保護(hù)酶活性下降，其保護(hù)作用大大降低。