毛立彥 龍凌云 黃秋偉 丁麗瓊 李慧敏 池昭錦 唐毓瑋 蘇群 農(nóng)曉慧 朱天龍

摘要：【目的】對(duì)147份睡蓮屬植物的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行分析，為睡蓮屬種質(zhì)資源保護(hù)、開發(fā)利用及新品種選育的親本選擇提供科學(xué)參考?！痉椒ā亢Y選獲得擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好的SRAP引物，對(duì)112份睡蓮屬植物種質(zhì)和35份雜交后代進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增，基于擴(kuò)增結(jié)果構(gòu)建0/1矩陣，利用Popgene 1.32計(jì)算遺傳多樣性相關(guān)參數(shù)。最后采用NTSYS 2.1的非加權(quán)組平均法（UPGMA）計(jì)算遺傳相似系數(shù)和遺傳距離并構(gòu)建聚類圖?！窘Y(jié)果】利用篩選的10個(gè)引物對(duì)從147份睡蓮屬植物材料中擴(kuò)增出207個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶207條，多態(tài)性比率100%，平均每對(duì)引物擴(kuò)增20.7條。147份睡蓮屬植物的觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）為2.0000，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.1777～1.3339，平均為1.2535，Shannon信息指數(shù)（I）為0.2459～0.3703，平均為0.3155，Neis遺傳多樣性指數(shù)（H'）為0.1345～0.2230，平均為0.1835。在遺傳相似系數(shù)0.65和遺傳距離為1.12時(shí)，均可將147份睡蓮屬植物材料劃分為六大類，并依據(jù)10個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增的0/1矩陣構(gòu)建了147份睡蓮屬植物材料的DNA分子身份證?！窘Y(jié)論】睡蓮屬植物具有豐富的遺傳多樣性。采用SRAP分子標(biāo)記可有效鑒定睡蓮屬植物材料的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，有助于提高親本選擇率和育種進(jìn)程。篩選出的10個(gè)引物對(duì)能有效地鑒定35份雜交后代。

關(guān)鍵詞： 睡蓮；種質(zhì)資源；遺傳多樣性；SRAP分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S682.320.24? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? 文章編號(hào)：2095-1191（2023）02-0454-13

Abstract：【Objective】To analyze genetic diversity and genetic relationships among 147 Nymphaea Linn. plants， and to provide scientific reference for conservation，development and utilization of Nymphaea Linn. germplasm resources and parents selection for new varieties breeding. 【Method】Ten SRAP primer pairs with clear amplification bands，stable structure and abundant polymorphism were screened to perform polymorphic amplification on 112 Nymphaea Linn. germplasm resources and 35 hybrid progenies. Based on amplification results，a 0/1 matrix was established and genetic diversity indexes were calculated using POPGENE 1.32. Genetic similarity coefficient and genetic distance were calculated through unweighted group average （UPGMA） method of NTSYS 2.1 and cluster diagram was constructed. 【Result】Using the 10 screened primer pairs，207 polymorphic bands were detected from the 207 amplified bands， indicating a polymorphic rate of 100% and on average every primer pair produced 20.7 polymorphic loci. For 147 Nymphaea Linn. plants， observed number of alleles （Na） was 2.0000 and effective number of alleles （Ne） was from 1.1777 to 1.3339，with an average of 1.2535； Shannons information index （I） was from 0.2459 to 0.3703，with an average of 0.3155，and the Neis genetic diversity index （H'） was from 0.1345 to 0.2230，with an average of 0.1835. The 147 Nymphaea Linn. plants were divi-ded into 6 groups when similarity coefficient was 0.65 and genetic distance was 1.12. DNA molecular ID of 147 Nymphaea Linn. plants were established according to the 0/1 matrix based on 10 primer pairs. 【Conclusion】Nymphaea Linn. plants enjoy rich genetic diversity. With SRAP molecular markers， genetic relationship can be effectively identified， which is helpful for increasing parental selection rate and improving breeding process. And the 10 screened primer pairs can effectively identify 35 hybrid progenies.

Key words： water lily； germplasm resource； genetic diversity； SRAP molecular marker

Foundation items： Guangxi Key Research and Development Plan Project （Guike AB18221054）； Basic Scientific Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences （Guinongke 2021YT152）

0 引言

【研究意義】睡蓮是睡蓮科（Nymphaeaceae）睡蓮屬（Nymphaea Linn.）多年生宿根浮葉植物的統(tǒng)稱，常用于園林景觀建設(shè)、濕地水體綠化和凈化，還可作為日化產(chǎn)品、食品和醫(yī)藥生產(chǎn)的重要原料用于生產(chǎn)化妝品、香皂等（Agnihotri et al.，2008；趙軍等，2014；宋敏等，2016；黃秋偉等，2020；宋杰等，2021）。全球現(xiàn)有睡蓮屬的種（含變種）和園藝品種1000多個(gè)，主要分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，我國現(xiàn)保存的種（變種）和品種400多個(gè)，在國內(nèi)多數(shù)省份廣泛栽培（黃國振等，2008；李淑娟等，2019；程哲等，2022）。分析睡蓮屬內(nèi)種質(zhì)之間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性，不僅為充分挖掘利用睡蓮種質(zhì)和新品種選育提供參考，還可為研究被子植物系統(tǒng)的起源、進(jìn)化、發(fā)育提供重要數(shù)據(jù)支持，對(duì)睡蓮新品種快速鑒定具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】睡蓮屬種質(zhì)資源傳統(tǒng)分類主要依據(jù)心皮、雄蕊形態(tài)等植物學(xué)特征、生態(tài)學(xué)特征及地理來源劃分為5個(gè)亞屬，分別為白天開花類型的澳大利亞睡蓮亞屬（Anecphya）、廣熱帶睡蓮亞屬（Brachyceras）和廣溫帶睡蓮亞屬（Nymphaea），以及晚上開花類型的古熱帶亞屬（Lotos）和新熱帶亞屬（Hydrocallis）（黃國振等，2008；李淑娟等，2019；潘慶龍等，2021；毛立彥等，2022）。但隨著睡蓮育種研究工作的深入開展，產(chǎn)生了由廣熱帶睡蓮亞屬（Brachyceras）與廣溫帶睡蓮亞屬（Nymphaea）、廣熱帶睡蓮亞屬（Brachyceras）與澳大利亞睡蓮亞屬（Anecphya）雜交而成的跨亞屬（Intersubgeneric）類型（李淑娟等，2019；蘇群等，2019；黃祥等，2022），睡蓮屬傳統(tǒng)分類方式無法準(zhǔn)確有效的劃分新選育種質(zhì)的進(jìn)化歸屬。分子標(biāo)記技術(shù)是研究物種遺傳多樣性的重要手段，其能反映生物個(gè)體或種群間DNA某些特征片段的差異，進(jìn)而快速評(píng)價(jià)物種的遺傳多樣性。SRAP分子標(biāo)記是采用特定引物對(duì)基因的開放閱讀框（ORF）進(jìn)行擴(kuò)增，其上游引物對(duì)外顯子進(jìn)行特異擴(kuò)增，下游引物對(duì)內(nèi)含子區(qū)域和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增，因個(gè)體和物種的不同，內(nèi)含子和啟動(dòng)子的間隔長(zhǎng)度不等而產(chǎn)生多態(tài)性（Li and Quiros，2001）。依據(jù)SRAP分子標(biāo)記擴(kuò)增的多態(tài)性條帶構(gòu)建0/1矩陣，并計(jì)算遺傳相似系數(shù)或者遺傳距離，以此進(jìn)行聚類分析，遺傳相似系數(shù)越大說明親緣關(guān)系越近，反之則親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，遺傳距離越大說明親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，反之則親緣關(guān)系越近（周麗霞和曹紅星，2020；林榕燕等，2021）。與RAPD、ISSR、DNA條形碼等標(biāo)記相比，SRAP分子標(biāo)記具有DNA需要量少、多態(tài)性強(qiáng)、高共顯性、標(biāo)記分布均勻、簡(jiǎn)便且花費(fèi)少等特點(diǎn)（葉興狀等，2021；Danial et al.，2021；李萍萍等，2022）。在玉蘭（張妹等，2019）、國蘭（袁媛等，2020）、菊花（沈瑤等，2020）、百合（王子康等，2022）等花卉，獼猴桃（張坤等，2021）、油梨（甘霖等，2021）、荔枝（胡福初等，2021）等果樹，南瓜（盧麗芳等，2015）、香椿（陳倩倩等，2018）、苦瓜（吳立東等，2019）、黃椒（邱胤暉等，2021）等蔬菜及水稻（林增順等，2019）等糧食作物上得到廣泛應(yīng)用，已成為分析物種親緣關(guān)系和構(gòu)建遺傳圖譜可靠而高效的方法。目前關(guān)于睡蓮的遺傳多樣性分析主要采用表型、ISSR分子標(biāo)記和DNA條形碼等手段，如Péter等（2011）采用ISSR分子標(biāo)記分析了6個(gè)原生種睡蓮的進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nymphaea‘Panama Pacific和N. caerulea為雜交起源，并將6份種質(zhì)分別歸入了Brachyceras亞屬、Nymphaea亞屬和Lotos亞屬；Jeremy等（2013）基于花粉顏色和根莖形態(tài)、RAPD分子標(biāo)記和DNA條形碼（ITS、trnK、matK、rbcL）對(duì)分布于印度不同地區(qū)的7個(gè)睡蓮種質(zhì)12份材料進(jìn)行聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分原生種的起源可能是遠(yuǎn)緣雜交而來，并根據(jù)根莖形態(tài)和花粉顏色將其聚為3個(gè)分支；Qian等（2022）采用核基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、葉綠體非編碼區(qū)trnT-trnF和編碼區(qū)rpl16對(duì)非洲大陸7個(gè)國家的158個(gè)野生睡蓮屬植物進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同時(shí)利用ITS、trnT-trnF和rpl16可有效鑒定睡蓮屬植物，通過聚類分析發(fā)現(xiàn)這些種質(zhì)屬于Brachyceras亞屬和Lotos亞屬，但無法更進(jìn)一步分類；蘇群等（2020）采用ISSR分子標(biāo)記分析了睡蓮種質(zhì)的親緣關(guān)系，分析結(jié)果與黃國振等（2009）的睡蓮傳統(tǒng)分類結(jié)果基本一致?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】當(dāng)前我國睡蓮產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，各地涌現(xiàn)了多家睡蓮新品種選育的科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)，但隨著眾多新種質(zhì)投入生產(chǎn)使用，由于原引進(jìn)品種的管理不規(guī)范，導(dǎo)致新種質(zhì)的遺傳背景未能有效辨析清晰，出現(xiàn)了命名混亂、圖片與種苗實(shí)物不對(duì)版等現(xiàn)象，嚴(yán)重制約了睡蓮種質(zhì)資源的創(chuàng)新利用。采用分子標(biāo)記技術(shù)了解睡蓮種質(zhì)資源之間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近是雜交育種的基礎(chǔ)，快速鑒定雜交后代有助于加快種質(zhì)創(chuàng)新進(jìn)程。雖然在睡蓮種質(zhì)資源方面已有表型和分子標(biāo)記的相關(guān)研究，但未見利用SRAP分子標(biāo)記分析睡蓮屬植物遺傳多樣性方面的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)從國內(nèi)外引進(jìn)的112份睡蓮種質(zhì)資源及自主雜交選育的35份雜交后代進(jìn)行遺傳多樣性分析，并對(duì)原生種和自主選育雜交后代進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定，同時(shí)采用10對(duì)SRAP引物構(gòu)建睡蓮指紋圖譜，為后期雜交育種和種質(zhì)創(chuàng)新利用提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試的147份睡蓮屬植物材料采集于廣西亞熱帶作物研究所睡蓮種質(zhì)資源圃和廣西平果華蓮科技研究所，樣品編號(hào)及名稱詳見表1。于2020年8月晴朗天氣下選取無病蟲害、生長(zhǎng)旺盛的植株，取其內(nèi)圈或水下的幼嫩葉片2～3片，用吸水紙擦干葉片表面水分，至于裝有1/3硅膠的樣品袋中，室溫保存3 d，去除硅膠，封好封口，置于干燥器內(nèi)室溫保存。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 DNA提取 采用傳統(tǒng)CTAB法提取睡蓮葉片DNA，采用超微量紫外光度計(jì)NanoDrop 2000檢測(cè)DNA濃度，并逐個(gè)稀釋至25 ng/μL，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 SRAP-PCR擴(kuò)增 采用反應(yīng)體系20.0 μL：10 μL 2×EasyTaq? PCR SuperMix（+dye），10 μmol/L正、反向引物各0.5 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，36 ℃ 50 s，72 ℃ 1.5 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆?。采?%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，電泳液采用1×TAE buffer。

1. 2. 3 SRAP引物篩選 以植物形態(tài)學(xué)分類為依據(jù)，分別從5個(gè)亞屬各選1個(gè)原生種DNA為模板DNA，5個(gè)原生種分別為粉巨睡蓮（Nymphaea gigantea）、雪白睡蓮（Nymphaea candida）、埃及白睡蓮（Nymphaea lotus var. pubescens）、小雪夜（Nymphaea potamophila）、美洲白睡蓮（Nymphaea ampla）。根據(jù)文獻(xiàn)查閱大蒜（周靜，2011）、荷花（孫祖霞，2014）、野生皂莢（田紅紅，2022）等其他作物SRAP引物序列，分別從25條上游引物和15條下游引物中隨機(jī)選取5條正向引物（Me1～Me5）和5條反向引物（Em1～Em5），兩兩組合共獲得25個(gè)引物對(duì)，從中篩選出10個(gè)擴(kuò)增條帶清晰可辨、多態(tài)性高的引物（表2），用于后續(xù)147份睡蓮屬植物材料的遺傳多樣性分析。

1. 2. 4 遺傳多樣性和聚類分析 以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在相同遷移率位置上的條帶有無進(jìn)行計(jì)數(shù)，有條帶的記為1，無條帶的記為0，制作成0/1矩陣。采用Excel 2010對(duì)總位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)及多態(tài)性比率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并利用Popgene 1.32計(jì)算觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Neis遺傳多樣性指數(shù)（H′）和Shannon信息指數(shù)（I）等4個(gè)遺傳多樣性參數(shù)。利用0/1矩陣，采用NTSYS 2.1計(jì)算遺傳相似系數(shù)（GS）和遺傳距離（GD），進(jìn)一步采用非加權(quán)組平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建聚類圖。

1. 2. 5 DNA分子身份證構(gòu)建 基于10對(duì)引物對(duì)147份睡蓮屬植物材料的擴(kuò)增結(jié)果，獲得每個(gè)睡蓮樣品擴(kuò)增的條帶數(shù)據(jù)，將條帶數(shù)據(jù)按照統(tǒng)一的擴(kuò)增引物順序進(jìn)行串聯(lián)排列，即可得到每個(gè)睡蓮樣品的以0/1擴(kuò)增條帶表示的字符串DNA分子身份證（白曉倩等，2022）。結(jié)合種質(zhì)的基本信息，利用二維碼生成技術(shù)（http：//cli.im/）將對(duì)應(yīng)字符串生成直觀的可掃描的二維碼分子身份證。

2 結(jié)果與分析

2. 1 SRAP引物篩選及多態(tài)性擴(kuò)增結(jié)果

采用CTAB法提取的147份睡蓮屬植物材料葉片DNA，部分材料的葉片DNA電泳結(jié)果如圖1所示。DNA條帶清晰完整。NanoDrop 2000檢測(cè)結(jié)果顯示，DNA濃度均在50 ng/μL以上；OD260/OD230值為1.8～2.0，OD260/OD280值為1.80～1.95，DNA的完整性、濃度和純度均符合后續(xù)試驗(yàn)要求。

篩選獲得10個(gè)擴(kuò)增條帶數(shù)目多、條帶清晰的引物對(duì)。10個(gè)引物對(duì)共擴(kuò)增出207條條帶，均具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為100%（表3）。每個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增的清晰條帶數(shù)為18～26，其中引物對(duì)Me1-Em3擴(kuò)增出的條帶最多，達(dá)26條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為20.7條，其中引物對(duì)Me1-Em4對(duì)部分樣品的擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。

由表4可知，147個(gè)份睡蓮屬植物材料的Na為2.0000，Ne為1.1777～1.3339，平均為1.2535，H'為0.1345～0.2230，平均為0.1835，I為0.2459～0.3703，平均為0.3155。整體來說，引物對(duì)Me1-Em1擴(kuò)增獲得的遺傳多樣性參數(shù)最低，引物對(duì)Me1-Em4擴(kuò)增獲得的遺傳多樣性參數(shù)最高。

2. 2 147份睡蓮種質(zhì)的SRAP聚類分析

基于10個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果計(jì)算供試147份睡蓮屬植物材料的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，結(jié)果顯示，147份睡蓮屬植物材料的遺傳相似系數(shù)為0.52～0.94，平均為0.70，其中87號(hào)材料（瑪麗安）與88號(hào)材料（黑美人）的遺傳相似系數(shù)最大，為0.94，說明二者的親緣關(guān)系最近，132號(hào)材料（變色澳洲）與105號(hào)材料（山莓）的遺傳相似系數(shù)最小0.52，二者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。147份睡蓮樣品遺傳距離為0.15～3.52，平均為1.17，其中94號(hào)材料（紅IM）與95號(hào)材料（紫IM）的遺傳距離最小為0.15，說明二者的親緣關(guān)系最近，140號(hào)材料（藍(lán)星睡蓮）與11號(hào)材料（晝開型雜交后代9）的遺傳距離最大為3.52，說明二者的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

在遺傳相似系數(shù)為0.65將147份睡蓮屬植物材料聚為六大類群（圖3-A）。第Ⅰ大類群由111份園藝雜交種和18份原生種組成，且在遺傳相似系數(shù)為0.69時(shí)進(jìn)一步聚為5個(gè)亞群，其中第ⅰ亞群由Nymphaea亞屬的2個(gè)雜交種克羅拉多、霍蘭迪亞和1個(gè)原生種小白子午蓮，Anecphya亞屬的2個(gè)原生種白巨和卡奔，Lotos亞屬1個(gè)原生種喀麥隆，跨亞屬（Nymphaea亞屬×Brachyceras亞屬）的1個(gè)雜交種暹羅紫1和Brachyceras亞屬的全部雜交種和雜交后代組成，第ii亞群由Nymphaea亞屬的9個(gè)雜交種（100～107號(hào)材料、111號(hào)材料）和跨亞屬的2個(gè)（Nymphaea亞屬×Brachyceras亞屬）雜交種詩麗吉皇后和暹羅粉1組成，第ⅲ亞群由除喀麥隆以外的夜開型Lotos亞屬的3個(gè)原生種（印度紅、泰國粉、埃及白）、3個(gè)雜交種（英國紅、紅色閃耀、安塔利亞）和6個(gè)雜交后代組成；第ⅳ亞群由Anecphya亞屬2個(gè)原生種（紫IM、白IM）、2個(gè)雜交種（流蘇、紅IM）和跨亞屬（Anecphya亞屬×Brachyceras）的2個(gè)雜交種（Tuonta、凱斯隆）組成；第ⅴ類由Nymphaea亞屬2個(gè)原生種（白睡蓮、雪白睡蓮）和1個(gè)雜交種（佛琴娜莉斯）組成。第ⅰ類在遺傳相似系數(shù)0.75時(shí)又分為5個(gè)分支，其中a分支由Brachyceras亞屬的83個(gè)雜交種和雜交后代及6個(gè)原生種（卵葉睡蓮、藍(lán)蟹爪、米努它、粉色好望角、藍(lán)色好望角、仲克尼、小花）組成；b分支由Anecphya亞屬的2個(gè)原生種（白巨、卡奔）、Nymphaea亞屬的1個(gè)雜交種霍蘭迪亞、跨亞屬（Nymphaea亞屬×Brachy-ceras）的1個(gè)雜交種暹羅紫1和Lotos亞屬的1個(gè)原生種喀麥隆組成；93號(hào)材料（雜交后代27）、67號(hào)材料（科羅拉多）和109號(hào)材料（小白子午蓮）分別單獨(dú)聚在c、d和e分支。第Ⅱ類群僅由Brachyceras亞屬的134號(hào)材料（越南延藥）組成，第Ⅲ類群由Nymphaea亞屬的2個(gè)雜交種（黃喬伊、科曼契）和1個(gè)原生種（墨西哥黃睡蓮）組成，第Ⅳ類群由Anecphya亞屬的2個(gè)原生種（變色澳洲、粉巨）組成，第Ⅴ類群主要由Brachyceras亞屬的9個(gè)原生種組成，第Ⅵ類群主要由夜開型Hydrocallis亞屬的3個(gè)原生種（小雪夜、秘魯睡蓮、增殖睡蓮）組成。在遺傳相似系數(shù)0.80時(shí)，多數(shù)睡蓮單獨(dú)聚為一支，且多以原生種為主。

在遺傳距離為1.12時(shí)將147份睡蓮屬植物材料聚為六大類群（圖3-B），其中Brachyceras亞屬的81個(gè)雜交種和雜交后代及6個(gè)原生種（卵葉睡蓮、黃蟹爪、藍(lán)蟹爪、米努它、粉色好望角、藍(lán)色好望角）聚為第Ⅰ類群，雜交種熱帶風(fēng)情和Brachyceras亞屬的雜交后代9分別單獨(dú)聚為第Ⅱ和Ⅵ類群；Nymphaea亞屬的雜交種科羅拉多原生種小白子午蓮聚為第Ⅲ類群；Anecphya亞屬、Lotos亞屬、Hydrocallis亞屬的全部原生種（小雪夜睡蓮、秘魯睡蓮、增殖睡蓮）、Nymphaea亞屬的3個(gè)原生種（雪白睡蓮、白睡蓮、墨西哥黃睡蓮）和4個(gè)雜交種（佛琴娜莉斯、霍蘭迪亞、科曼契、黃喬伊）、跨亞屬（Anecphya亞屬×Brachyceras亞屬）的2個(gè)雜交種（Tuonta、凱斯隆）、Brachyceras亞屬的10個(gè)原生種（白藍(lán)星、藍(lán)星、越南延藥、印度延藥、海南延藥、非洲延藥、優(yōu)雅睡蓮、埃及藍(lán)、美洲白睡蓮、美洲白睡蓮紅葉）聚為第Ⅳ類群；剩余Nymphaea亞屬的1個(gè)原生種（小白子午蓮）、10個(gè)雜交種和跨亞屬（Nymphaea亞屬×Brachyceras亞屬）的3個(gè)雜交種聚為第Ⅴ類。其中第Ⅴ類群的進(jìn)一步分類將Nymphaea亞屬的1個(gè)原生種（小白子午蓮）、10個(gè)雜交種聚在一起，跨亞屬（Nymphaea亞屬×Brachyceras亞屬）的3個(gè)雜交種聚在一起，與實(shí)際形態(tài)學(xué)分類一致。比較復(fù)雜的第Ⅳ類群進(jìn)一步在遺傳距離0.85聚為5個(gè)亞群：第ⅰ亞群除93號(hào)以外的91～99號(hào)材料組成，包含Anecphya亞屬的4個(gè)原生種（白巨、卡奔、紫IM、白IM）、2個(gè)雜交種（紅IM、流蘇）以及跨亞屬（Anecphya亞屬×Brachyceras亞屬）的2個(gè)雜交種（Tuonta、凱斯?。?；第ⅱ亞群由Nymphaea亞屬的2個(gè)原生種（白睡蓮、雪白睡蓮）和2個(gè)雜交種（佛琴娜莉斯、霍蘭迪亞）組成；第ⅲ亞群由130～147號(hào)材料組成，包含了Hydrocallis亞屬的3個(gè)原生種（小雪夜睡蓮、秘魯睡蓮、增殖睡蓮）、Brachyceras亞屬的10個(gè)原生種（白藍(lán)星、藍(lán)星、越南延藥、印度延藥、海南延藥、非洲延藥、優(yōu)雅睡蓮、埃及藍(lán)、美洲白睡蓮、美洲白睡蓮紅葉）、Anecphya亞屬的2個(gè)原生種（變色澳洲、粉巨）、Nymphaea亞屬的1個(gè)原生種（墨西哥黃）共計(jì)16份原生種和Nymphaea亞屬的2個(gè)雜交種（科曼契、黃喬伊）；Lotos亞屬的原生種（喀麥?。﹩为?dú)聚為第ⅳ亞群，第ⅴ亞群由除喀麥隆以外的Lotos亞屬的材料（117～129號(hào)）組成，包含3個(gè)原生種（印度紅、泰國粉、埃及白）、3個(gè)雜交種（英國紅、紅色閃耀、安塔利亞）及6個(gè)雜交后代。材料數(shù)量最多的第Ⅰ類群在遺傳距離0.97時(shí)聚為4個(gè)分支，均為Brachyceras亞屬睡蓮種質(zhì)材料，其中a分支由除11號(hào)雜交后代9以外的1～24號(hào)雜交種和雜交后代組成，b分支由除34號(hào)卵葉睡蓮和84號(hào)泰王以外的25～89號(hào)雜交種組成，34號(hào)材料（卵葉睡蓮）和84號(hào)材料（泰王）分別單獨(dú)聚為在c和d分支。

2. 3 34份原生種和35份雜交后代的聚類分析結(jié)果

利用篩選出的10個(gè)引物對(duì)對(duì)34份原生種進(jìn)行聚類分析，其中引物對(duì)Me5-Em2和Me1-Em3能夠?qū)?4份原生種質(zhì)完全分開。分別采用4種引物組合方式（Me5-Em2、Me1-Em3、Me5-Em2+Me1-Em3、10個(gè)引物對(duì)組合）對(duì)34個(gè)原生種進(jìn)行聚類分析結(jié)果如圖4所示，4種引物組合方式得到的遺傳相似系數(shù)分別為0.20～0.91、0.35～0.97、0.35～0.91和0.51～0.90，分別在遺傳相似系數(shù)0.59、0.62、0.58、0.64將34份原生種聚為五大類，其中4種引物組合聚類結(jié)果中均被聚為一類的材料為34號(hào)（卵葉睡蓮）、48號(hào)（藍(lán)蟹爪）、55號(hào)（米努它）、65號(hào)（粉色好望角）、77號(hào)（仲克尼）、78號(hào)（小花）、91號(hào)（卡本）、92號(hào)（白巨）、95號(hào)（紫IM）、98號(hào)（白IM）、110號(hào)（雪白睡蓮）、112號(hào)（白睡蓮）、119號(hào)（印度紅）、120號(hào)（泰國粉）、121號(hào)（喀麥?。?、135號(hào)（印度延藥）、136號(hào)（優(yōu)雅睡蓮）、132號(hào)（變色澳洲）、144號(hào)（粉巨）。4種引物組合方式聚類分析結(jié)果均與形態(tài)學(xué)分類具有較大的差異，如119號(hào)（印度紅）、120號(hào)（泰國粉）、121號(hào)（喀麥?。?、122號(hào)（埃及白）材料在形態(tài)學(xué)上均屬于熱帶夜開型熱帶睡蓮，91號(hào)（卡奔）、92號(hào)（白巨）、95號(hào)（紫IM）、98號(hào)（白IM）、132號(hào)（變色澳洲）、144號(hào)（粉巨）在形態(tài)學(xué)上均屬于澳洲睡蓮亞屬，109號(hào)（小白子午蓮）、110號(hào)（雪白睡蓮）、112號(hào)（白睡蓮）在形態(tài)學(xué)上均屬于廣溫帶睡蓮，實(shí)際的分子標(biāo)記并沒有將其很理想地聚在一支。

采用10個(gè)引物對(duì)對(duì)35份雜交后代進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示單獨(dú)的每個(gè)引物對(duì)均不能將35份雜交后代進(jìn)行完全分開。進(jìn)一步將10個(gè)引物對(duì)進(jìn)行兩兩組合，得到13個(gè)引物組合，可完全將35個(gè)雜交后代完全分開，遺傳相似系數(shù)為0.35～0.98（表5），單獨(dú)的13個(gè)引物組合與10個(gè)引物對(duì)組合共同聚類的結(jié)果（圖5）相似，整體上除Me1-Em2+Me3-Em5組合外，所有的夜開型Lotos亞屬聚在一起，其他白天開花類型聚在一起，93號(hào)材料是以Anecphya亞屬為父本，Brachyceras亞屬為母本進(jìn)行雜交，在所有的聚類分析結(jié)果中，最終均單獨(dú)列為一支，與實(shí)際情況符合。而在Me1-Em2+Me3-Em5組合的聚類分析結(jié)果中，93號(hào)材料在遺傳相似系數(shù)0.59時(shí)與夜開型的材料聚為一支，隨后在遺傳相似系數(shù)0.61時(shí)，單獨(dú)聚為一支（圖5）。

2. 4 睡蓮屬植物材料的DNA分子身份證構(gòu)建

將147份睡蓮的擴(kuò)增條帶結(jié)果按照P1～P10先后順序進(jìn)行串聯(lián)排列，獲得每個(gè)種質(zhì)唯

一的237位字符串，即每個(gè)樣品的字符串分子身份證，以原生種藍(lán)星睡蓮為例，生成的碼如下：P1-01000010000010010000，P2-00001000100100000 1000，P3-00110100101001001000，P4-0000011100110 1011001101000，P5-01011001101000010000，P6-101 010001000000000，P7-11011010101001100010，P8-0 100110001100000100100，P9-0000001010001010000， P10-001100010101010000000；生成的二維碼和掃碼結(jié)果如圖6。

3 討論

SRAP分子標(biāo)記最早應(yīng)用于蕓薹屬種質(zhì)資源的鑒定與評(píng)價(jià)，與ISSR和SSR等分子標(biāo)記相比，具有多態(tài)性豐富、高共顯性、操作簡(jiǎn)便和費(fèi)用低，可省去了引物開發(fā)過程等優(yōu)點(diǎn)（蘇群等，2019；李萍萍等，2022），是植物遺傳育種研究中鑒定種質(zhì)親緣關(guān)系的高效手段之一。本研究基于前人已發(fā)表的25個(gè)SRAP引物對(duì)，篩選出10個(gè)引物對(duì)即可從147份睡蓮屬植物中擴(kuò)增出207條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率達(dá)100%。同類物種遺傳多樣性研究中，蘇群等（2020）利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)46份睡蓮種質(zhì)的親緣關(guān)系進(jìn)行鑒定，從100條ISSR引物中篩選的10條引物共擴(kuò)增出281個(gè)多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率達(dá)100%。Parveen等（2022）基于睡蓮基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，開發(fā)了217對(duì)SSR引物并從中篩選出57對(duì)SSR引物用于97份睡蓮種質(zhì)的鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性比率79.79%。從以上研究結(jié)果可知，相較于ISSR和SSR分子標(biāo)記，將SRAP分子標(biāo)記應(yīng)用于睡蓮種質(zhì)資源遺傳多樣性分析可簡(jiǎn)化了引物開發(fā)步驟，提高睡蓮種質(zhì)鑒定效率。

Na、Ne、H和I是衡量植物物種間種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富度的常用指標(biāo)（周麗霞和曹紅星，2020）。本研究中147份睡蓮屬種質(zhì)材料的I平均值為0.3155；Ne平均值為1.2535；H′平均值為0.1835，Na平均值為2.0000，遺傳相似系數(shù)為0.52～0.94，遺傳距離為0.15～3.52，說明供試的147份睡蓮種質(zhì)的遺傳多樣性豐富，具有高度廣泛的遺傳變異。這與油棕（周麗霞和曹紅星，2020）、棕櫚（毛躍雄等，2020）、黃椒（邱胤暉等，2021）、百合（王子康等，2022）等研究結(jié)果相似。研究發(fā)現(xiàn)，睡蓮屬植物普遍存在雌蕊先熟，外圈雄蕊與雌蕊同步成熟的特點(diǎn)（黃國振等，2009），雌蕊和雄蕊性成熟時(shí)間不同步的習(xí)性，可促進(jìn)了該屬植物的自身繁衍，并通過外界介質(zhì)加強(qiáng)了種間的基因交流。這可能是造成睡蓮屬植物遺傳多樣性水平較高的重要原因。

本研究對(duì)147份睡蓮屬植物材料進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示在遺傳相似系數(shù)為0.65和遺傳距離1.12，可將這些材料聚為六大類群，其中大部分的Brachyceras亞屬雜交種聚在一起，在進(jìn)一步的細(xì)化聚類種，大部分依據(jù)形態(tài)學(xué)的不同亞屬能較好的聚在一起。不論是依據(jù)遺傳相似系數(shù)還是依據(jù)遺傳距離，跨亞屬的3個(gè)Nymphaea亞屬×Brachyceras亞屬和2個(gè)Anecphya亞屬×Brachyceras亞屬雜交種均與母本所在亞屬種質(zhì)聚類在一起，形態(tài)學(xué)特征也與母本所在亞屬種質(zhì)相近，雜交新種質(zhì)在遺傳上更偏向于母本；而廣溫帶睡蓮許多經(jīng)典品種如科羅拉多、佛琴娜莉斯等均為早期雜交種，遺傳背景相對(duì)后期的雜交種更為復(fù)雜，因此兩種依據(jù)的聚類方式均未將所有Nymphaea亞屬完全聚在一起。本研究中多數(shù)原生種的遺傳距離較遠(yuǎn)，遺傳系數(shù)較小，依據(jù)遠(yuǎn)緣雜交優(yōu)勢(shì)，同屬物種親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，雜交后代更易獲得比母系和父系親本更優(yōu)良的性狀，研究中選擇的原生種可作為睡蓮屬種質(zhì)創(chuàng)新中優(yōu)良的育種材料，在今后的研究中應(yīng)加強(qiáng)原生種質(zhì)的收集保存，并將其應(yīng)用于雜交育種中。

本研究篩選到10個(gè)引物對(duì)組合才能將147份種質(zhì)有效區(qū)分，2個(gè)SRAP引物對(duì)（Me5-Em2和Me1-Em3）均能獨(dú)立地將34份原生種區(qū)分，且采用單一引物對(duì)、Me5-Em2和Me1-Em3雙引物對(duì)組合以及10個(gè)引物對(duì)組合的聚類結(jié)果均可將34份原生種劃分為五大類群，但部分原生種聚類結(jié)果的類群歸屬劃分有差別，且與形態(tài)學(xué)分類存在差異。這些現(xiàn)象可能是由于單一分子標(biāo)記局限性和引物豐富度不夠、覆蓋面不足，或原生種之間在早期進(jìn)化過程中存在著基因交流導(dǎo)致。因此，在今后的研究中應(yīng)結(jié)合形態(tài)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行多種分子標(biāo)記聯(lián)合分析。

本研究35份雜交后代的鑒定結(jié)果顯示，至少需要2個(gè)以上的SRAP引物對(duì)組合才能將35份雜交后代完全區(qū)分，且不同引物對(duì)組合的聚類結(jié)果均存在差異，故在雜交后代鑒定過程中需利用多對(duì)引物組合的互補(bǔ)作用，提高雜交后代鑒定結(jié)果的可靠性。DNA分子身份證將不同睡蓮屬植物DNA水平上的差異轉(zhuǎn)變?yōu)樽址投S碼，可更加快捷直觀地反映樣品的相關(guān)信息，對(duì)于睡蓮屬植物的快速識(shí)別和推廣具有重要意義。本研究采用多對(duì)引物組合的方式鑒定了34份原生種質(zhì)和35份雜交后代，有效地克服了單一引物擴(kuò)增存在的特征條帶少、鑒定效率低的問題。因此，應(yīng)用篩選得到的10個(gè)引物對(duì)構(gòu)建的DNA指紋圖譜，可為睡蓮屬原生種和雜交種的分子鑒定提供參考。

4 結(jié)論

147份睡蓮屬植物的遺傳多樣性豐富，原生種之間的遺傳距離較大，具有極大的育種潛力。SRAP分子標(biāo)記可輔助睡蓮新品種選育，用于親本的選擇和雜交后代的快速鑒定。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）