曹冰,劉穎,陸晨

糖尿病腎病(DKD)為目前引起終末期腎病的主要原因之一,血糖和血壓的控制可減緩糖尿病腎病的發(fā)生和進(jìn)展。鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運體2(SGLT2)抑制劑是一種新型的降糖藥物,目前被認(rèn)為具有降糖依賴性和非依賴性的腎臟保護(hù)作用。實驗研究表明,在1型糖尿病和2型糖尿病的動物模型中,SGLT2抑制劑均可減輕糖尿病腎病的病變,表明除了降糖外,SGLT2抑制劑還具有潛在的腎臟保護(hù)作用。在隨機對照試驗中,SGLT2抑制劑已經(jīng)被證實對合并高心血管風(fēng)險的糖尿病腎病患者存在腎臟保護(hù)作用。SGLT2抑制劑的這些有利作用可通過幾種潛在的機制來解釋,包括減輕腎小球高濾過、炎癥和氧化應(yīng)激。本實驗建立糖尿病腎病大鼠模型,并給予卡格列凈藥物干預(yù),觀察給藥后大鼠血糖、腎臟系數(shù)、尿蛋白及相關(guān)生化指標(biāo)的變化情況,進(jìn)一步評價SGLT2抑制劑對糖尿病腎病的保護(hù)作用?？偨Y(jié)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物飼養(yǎng)中心提供的SPF級雄性Wistar大鼠30只,8～10周齡,體質(zhì)量200～250 g,于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心進(jìn)行繁育,飼養(yǎng)溫度(23±3)℃,相對濕度40%～70%。該研究通過新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會審批(倫理審批號:IACUC-20210425-14)。

1.2 儀器與試藥

1.2.1 儀器:電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏試驗設(shè)備有限公司DNP-9272);酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad xMarkTM);高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技公司);常規(guī)電泳儀電源(北京百晶生物技術(shù)有限公司BG-Power600i);電泳儀(北京六一生物科技有限公司DYCZ-21);手動單道移液器(德國Eppendorf公司Research plus)等。

1.2.2 試藥:鏈脲佐菌素(STZ,sigma公司生產(chǎn));卡格列凈片(Janssen-Cilag S.p.A.意大利生產(chǎn),規(guī)格:100 mg)。

1.2.3 飼料:45%高脂飼料(日糧型,大鼠)、普通飼料,由江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司提供。

1.3 方法

1.3.1 分組:將30只雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,采用隨機數(shù)字表法分為卡格列凈藥物干預(yù)組(10只)、糖尿病腎病組(10只)及對照組(10只)。

1.3.2 糖尿病腎病大鼠模型造模及干預(yù)方法:大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,卡格列凈藥物干預(yù)組及糖尿病腎病組大鼠繼續(xù)給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周(對照組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)4周),第5周第1天卡格列凈藥物干預(yù)組及糖尿病腎病組大鼠腹腔注射STZ 50 mg/kg(pH 4.45、0.01 mol/L無菌檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液) 1次,對照組大鼠注射等體積溶劑。注射第3天卡格列凈藥物干預(yù)組及糖尿病腎病組大鼠均測隨機血糖1次,隨機血糖<11.1 mmo/L的大鼠,需重新注射1次STZ(50 mg/kg),7 d后,連續(xù)3 d尾靜脈取血,隨機血糖≥16.7 mmo/L,若大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體質(zhì)量下降的癥狀及尿檢白蛋白升高、毛發(fā)枯黃、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象則證明造模成功。次日開始予卡格列凈藥物干預(yù)組卡格列凈10 mg/kg灌胃,對照組及糖尿病腎病組予蒸餾水(等體積)灌胃,持續(xù)灌胃37 d后處死大鼠。

1.3.3 樣本收集

1.3.3.1 血清樣本收集:大鼠處死12 h前禁食,處死后收集腹腔動脈血1～2 ml,分離血清,于-80 ℃下保存待測。

1.3.3.2 組織樣本收集:大鼠處死后,收集腎臟組織,稱重。

1.3.3.3 尿液樣本收集:大鼠處死前1 d內(nèi)收集24 h尿液,于-80 ℃冰箱內(nèi)保存待測。

1.4 觀察指標(biāo)及方法 (1)血糖測定:大鼠飼養(yǎng)5周后,每周使用血糖儀檢測空腹血糖水平。(2)體質(zhì)量測定:大鼠飼養(yǎng)5周后,每周對大鼠體質(zhì)量進(jìn)行稱量,記錄體質(zhì)量變化,并計算腎臟系數(shù)(腎臟重量/體質(zhì)量)。(3)尿蛋白含量:取各組4個時間點采集的尿液,按照尿蛋白指標(biāo)試劑盒說明書操作,記錄測定的吸光度(OD值),通過計算公式得到尿蛋白濃度。(4)生化指標(biāo)檢測:檢測大鼠血清中葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)水平。

2 結(jié) 果

2.1 血糖比較 卡格列凈藥物干預(yù)組及糖尿病腎病組大鼠空腹血糖均明顯高于對照組(P<0.05);卡格列凈藥物干預(yù)組在卡格列凈干預(yù)第18天空腹血糖低于糖尿病腎病組(P<0.05),見圖1。

圖1 3組大鼠空腹血糖水平變化

2.2 腎臟系數(shù)比較 卡格列凈藥物干預(yù)組及糖尿病腎病組大鼠腎臟系數(shù)高于對照組(P<0.05);卡格列凈藥物干預(yù)組經(jīng)卡格列凈藥物干預(yù)后腎臟系數(shù)水平較糖尿病腎病組有所下降,見表1。

表1 3組大鼠腎臟系數(shù)比較

2.3 尿蛋白比較 卡格列凈藥物干預(yù)組及糖尿病腎病組尿蛋白含量均高于對照組(P<0.05);卡格列凈藥物干預(yù)組大鼠處死前尿蛋白含量低于糖尿病腎病組(P<0.05),見表2。

2.4 生化指標(biāo)比較 糖尿病腎病組GLU、BUN、Cr、TC、TG水平均高于對照組(P<0.05);卡格列凈藥物干預(yù)組GLU、BUN、Cr、TC、TG水平均低于糖尿病腎病組(P<0.05),見表3。

3 討 論

糖尿病腎病是糖尿病患者嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,部分患者最終會進(jìn)展為終末期腎病,需腎臟替代治療,糖尿病腎病患者的病死率明顯高于不伴腎病的糖尿病患者。持續(xù)高血糖的存在可導(dǎo)致糖基化中間產(chǎn)物堆積及脂蛋白代謝異常,最終導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生[1]。目前糖尿病腎病的防治重點是積極控制相關(guān)的危險因素,其中包括體質(zhì)量、血糖、血壓、血脂、尿酸及尿蛋白水平等,從而降低腎臟及心血管事件發(fā)生的風(fēng)險。

表2 3組大鼠不同時點尿蛋白含量比較

表3 3組大鼠相關(guān)生化指標(biāo)比較

SGLT2抑制劑是一種新型的降糖藥物,該藥物已被證實在降低血糖的同時,進(jìn)一步降低心血管危險因素,并起到腎臟保護(hù)作用,其主要通過抑制SGLT2的轉(zhuǎn)運作用從而使腎臟對葡萄糖重吸收減少,促進(jìn)尿鈉、尿糖的排出[2],其為降低糖尿病腎病早期高濾過提供了基礎(chǔ)。SGLT2抑制劑的降糖作用與體內(nèi)葡萄糖濃度和腎小球濾過率呈正比,其還可通過改善糖尿病腎病患者的胰島β細(xì)胞功能和胰島素敏感性進(jìn)一步降低血糖[3]。研究顯示SGLT2抑制劑除了降糖作用之外,還有改善血壓及血脂、降低血尿酸、減輕體質(zhì)量、減少尿蛋白、改善動脈硬化和內(nèi)皮功能、改善腎小球超濾、抑制炎性損傷和纖維化等作用,延緩糖尿病腎病的進(jìn)展[4]。本實驗建立了糖尿病腎病大鼠模型,并給予卡格列凈藥物干預(yù),觀察給藥后大鼠血糖、腎臟系數(shù)、尿蛋白及相關(guān)生化指標(biāo)的變化情況,進(jìn)一步評價SGLT2抑制劑對糖尿病腎病的保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示,卡格列凈藥物干預(yù)組及糖尿病腎病組大鼠空腹血糖均高于對照組(P<0.05);卡格列凈藥物干預(yù)組在卡格列凈干預(yù)第18天后空腹血糖低于糖尿病腎病組(P<0.05),提示卡格列凈具有較好的降糖作用。卡格列凈藥物干預(yù)組及糖尿病腎病組大鼠腎臟系數(shù)高于對照組(P<0.05);卡格列凈藥物干預(yù)組經(jīng)卡格列凈藥物干預(yù)后腎臟系數(shù)水平較糖尿病腎病組有所下降。SGLT2抑制劑可促進(jìn)尿糖的排出,進(jìn)而降低血糖水平,同時對代謝因素、胰島素敏感性和β細(xì)胞功能存在一定程度的影響。研究發(fā)現(xiàn),在糖尿病腎病患者中,SGLT2的表達(dá)增加,腎糖閾升高,同時葡萄糖的重吸收增加,進(jìn)一步升高血糖,而SGLT2抑制劑可使病理性升高的腎糖閾降低,降低腎小管對葡萄糖的重吸收,從而發(fā)揮降血糖、降低細(xì)胞糖毒性的作用,同時還可增強β細(xì)胞的功能、改善胰島素抵抗及改善胰島素敏感性。Kutoh等[5]研究發(fā)現(xiàn),在T2DM患者中應(yīng)用SGLT2可降低體質(zhì)指數(shù)和HOMA-R。Tahara等[6]在高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病動物模型中,證明了SGLT2對非酒精性脂肪性肝病的有效治療。在高脂肪和高膽固醇飲食喂養(yǎng)的T2DM小鼠中,SGLT2單獨和與二甲雙胍聯(lián)用通過減輕肝臟炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激來改善脂肪肝。SGLT2改善胰島素敏感性的大多數(shù)假設(shè)機制集中在當(dāng)身體的葡萄糖負(fù)荷減少時減少胰島細(xì)胞的胰島素分泌[7]。隨著胰島素水平的降低,肝臟脂肪酸和膽固醇的合成減少。白色和棕色脂肪組織中的產(chǎn)熱增加了能量消耗,減少了巨噬細(xì)胞和下游的IL-6水平,脂肪細(xì)胞內(nèi)的炎性損傷得到緩解[8]。

本研究結(jié)果還顯示,卡格列凈藥物干預(yù)組及糖尿病腎病組尿蛋白含量均高于對照組(P<0.05);卡格列凈藥物干預(yù)組大鼠處死前尿蛋白含量低于糖尿病腎病組(P<0.05),提示卡格列凈可降低大鼠的尿蛋白水平,起到一定程度的腎臟保護(hù)作用。糖尿病腎病組GLU、BUN、Cr、TC、TG水平高于對照組(P<0.05);卡格列凈藥物干預(yù)組GLU、BUN、Cr、TC、TG水平低于糖尿病腎病組(P<0.05)。提示卡格列凈保護(hù)腎臟功能同時可降低血脂水平。SGLT2抑制劑可改善胰島素抵抗,還可通過調(diào)節(jié)腎小球前后血管張力降低腎小球內(nèi)高壓,從而起到腎臟保護(hù)作用。在糖尿病腎病早期,近端腎小管重吸收增加會減少遠(yuǎn)端輸注,導(dǎo)致腎小球反饋功能受損,表現(xiàn)為腎小球傳入小動脈擴張和腎小球內(nèi)壓升高。SGLT2抑制劑可增加致密黃斑的溶質(zhì)和液體輸送,從而增加前列腺素的分泌,導(dǎo)致腎小球傳出小動脈擴張。其還輕微增加腺苷水平,這可能會輕微增加傳入小動脈的阻力,以上因素都降低了腎小球內(nèi)的壓力[9]。SGLT2抑制劑阻斷近端腎小管對鈉離子的重吸收,增加輸送到遠(yuǎn)端致密斑的鈉離子,鈉離子通過促進(jìn)三磷酸腺苷的分解,增加了腺苷產(chǎn)生,進(jìn)一步降低腎小球內(nèi)壓及改善腎臟高濾過狀態(tài),從而恢復(fù)受損的球管反饋。DELIGHT試驗中,研究顯示在給藥24周后,達(dá)格列凈組較安慰劑組的平均UACR水平下降了21%。SGLT2抑制劑降低尿蛋白的作用機制可能與恢復(fù)球管反饋、改善腎小球高壓有關(guān)。隨機對照試驗的Meta分析顯示,SGLT2抑制劑可升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C,平均差值1.93 mg/dl)、降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C,平均差值3.5 mg/dl),降低血清TC(平均差值7.8 mg/dl),其中卡格列凈對血脂的影響最大[10]。日本的一項研究報告表明,達(dá)格列凈給藥抑制了致動脈粥樣硬化的小密度LDL-C,同時可以增加HDL-C水平[11]。

綜上所述,SGLT2抑制劑可降低糖尿病腎病大鼠的血糖水平,減輕腎臟系數(shù),降低尿蛋白排泄,改善糖尿病腎病大鼠的血脂及腎功能水平。該研究結(jié)果為糖尿病腎病的防治提供了新的治療靶點,為SGLT2抑制劑的腎臟保護(hù)作用提供了更多的理論依據(jù)。

利益沖突:所有作者聲明無利益沖突。