韓國(guó)秀, 張多英, 張彥龍, 張 軍

曾偉民1,2, 趙丹丹1,2, 雷 虹1,4

(1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心, 哈爾濱 150500; 2.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 哈爾濱 150080; 3.黑龍江大學(xué) 建筑工程學(xué)院, 哈爾濱 150080;4.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 哈爾濱 150080)

0 引 言

假單胞菌(Pseudomonas)是革蘭氏陰性菌中種數(shù)最多的一個(gè)屬,目前該屬有368 個(gè)種[1]。該屬的大多數(shù)成員都有共同的特征,如革蘭氏染色陰性、桿狀、有鞭毛、不形成芽孢、過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性以及氧化酶陽(yáng)性等。假單胞菌可存在于水、土壤、空氣、植物以及人體腸道中,生活環(huán)境范圍廣泛,代謝途徑多樣。由于假單胞菌屬分類非常復(fù)雜,因此在種水平上對(duì)其進(jìn)行鑒定仍然是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株Y39-6從哈爾濱周邊地下水中分離篩選獲得[4]。試驗(yàn)用LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨 10 g·L-1,酵母粉 0.5 g·L-1,NaCl 10 g·L-1,pH調(diào)為6.9～7.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組的DNA提取、測(cè)序與拼接

配制100 mL LB液體培養(yǎng)基,在121 ℃下滅菌30 min,冷卻后,以2%接種量將菌株Y39-6接入100 mL滅菌的LB培養(yǎng)基中,在20 ℃、160 r·min-1條件下過(guò)夜培養(yǎng),獲得新鮮菌液。采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)從菌株Y39-6中提取基因組DNA[7]。

委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司(Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd) 對(duì)提取到的基因組DNA進(jìn)行全基因組序列測(cè)序。通過(guò)SOAPdenovo 2.04[8]軟件對(duì)菌株Y39-6的基因序列進(jìn)行組裝;通過(guò)Glimmer[9]軟件(http://ccb.jhu.edu/software/glimmer/index.shtml)對(duì)基因組中的編碼序列(CDS)進(jìn)行預(yù)測(cè);通過(guò)RNAmmer[10]軟件對(duì)基因組中包含的 rRNA 進(jìn)行預(yù)測(cè),獲得基因組中所有rRNA的種類、位置和序列信息;通過(guò)tRNAscan-SE v2.0[11]軟件(http://trna.ucsc.edu/software/)對(duì)基因組中包含的tRNA 進(jìn)行預(yù)測(cè),獲得基因組中tRNA的核苷酸序列信息、反密碼子信息及二級(jí)結(jié)構(gòu)信息,并通過(guò)CGView[12]軟件繪制菌株Y39-6的基因組圈圖。

1.2.2 基因組注釋

通過(guò)Diamond[13]軟件,將菌株Y39-6的蛋白質(zhì)序列與 eggNOG[14](Evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups, http://eggnog.embl.de/)數(shù)據(jù)庫(kù)中的物種蛋白序列進(jìn)行比對(duì),得到基因COG(Clusters of Orthologous Groups of proteins)注釋。通過(guò)Blast2go[15]軟件,使用Gene ontology (http://www.geneontology.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)菌株Y39-6的基因組進(jìn)行基因GO注釋。

1.2.3 氮代謝基因

菌株Y39-6具有異養(yǎng)反硝化和自養(yǎng)脫氮能力,通過(guò)KEGG基因注釋結(jié)果分析菌株Y39-6的氮代謝相關(guān)基因。

1.2.4 比較基因組學(xué)

利用前期獲得的菌株Y39-6(CP069594)的16S rRNA序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),獲得與菌株Y39-6近緣的模式菌株。將近緣的菌株基因組信息與菌株Y39-6的基因組信息進(jìn)行對(duì)比分析,并通過(guò)在線Venn圖制作軟件(https://orthovenn2.bioinfotoolkits.net/home)繪制菌株Y39-6和近緣模式菌株基因序列間的同源關(guān)系圖。

1.2.5 生理生化特征

通過(guò)Biolog細(xì)菌自動(dòng)鑒定系統(tǒng)[16]分析菌株Y39-6對(duì)不同碳源的利用與代謝情況,并比對(duì)其與近緣模式菌株在碳源利用和代謝方面的差異。利用美國(guó)MIDI公司研發(fā)的SHERLOCK全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定菌株Y39-6,用美國(guó)Agilent公司的6890型氣相色譜儀分析菌株Y39-6,將所得的氣相色譜圖譜與軟件SHERLOCK MIS4.5(Microbial Identification System,美國(guó)MIDI公司)和LGS4.5進(jìn)行分析比對(duì),獲得菌株Y39-6的脂肪酸種類及含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株Y39-6的全基因組信息

經(jīng)測(cè)序,得到菌株Y39-6的基因組完成圖,菌株Y39-6全基因組序列長(zhǎng)度為7 021 566 bp,DNA的G+C含量為60.75%。菌株Y39-6的全基因組序列已上傳至NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),SUBID為SUB8969722,登錄號(hào)為CP069594。CGView基因組圈圖能夠全面展示基因在正、反義鏈上的分布情況、基因的COG功能分類情況、G+C含量和基因組島等信息,使人們更直觀、更全面地認(rèn)識(shí)菌株的基因組特征[17]。由CGView軟件繪制的基因組圈圖如圖1所示。

圖1 菌株Y39-6的基因組圈圖

2.2 菌株Y39-6的基因組注釋

通過(guò)與EggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)中物種的蛋白序列進(jìn)行比對(duì),可以對(duì)菌株Y39-6的預(yù)測(cè)蛋白進(jìn)行基因家族的歸類,并給出該家族相應(yīng)的功能注釋信息。不同數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因功能描述可能存在差異,GO注釋能夠?qū)虻墓δ苓M(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)描述[19],COG是對(duì)同源蛋白簇進(jìn)行注釋,除獲得基本功能、推導(dǎo)代謝途徑外,還可以分析進(jìn)化關(guān)系。COG和GO注釋結(jié)果分別如圖2和圖3所示。

圖2 菌株Y39-6的COG分類統(tǒng)計(jì)直方圖

圖3 菌株Y39-6的GO分類統(tǒng)計(jì)直方圖

COG注釋的基因一共有5 378個(gè),將蛋白分為21個(gè)類型,COG注釋到的功能已知基因占所有基因的84.44%。由圖2可知,功能未知基因占比最高,為1 537個(gè)。在功能已知的基因中,在氨基酸的運(yùn)輸和代謝,轉(zhuǎn)錄,無(wú)機(jī)離子的運(yùn)輸和代謝,能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換,細(xì)胞壁、膜、包膜生物合成,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),碳水化合物的運(yùn)輸和代謝方面的基因較多,基因數(shù)量分別為497、461、369、360、293、290和259個(gè)。菌株Y39-6在進(jìn)行氨基酸運(yùn)輸和代謝方面的基因最多,氨基酸是蛋白質(zhì)組成的基本物質(zhì),因此,菌株Y39-6可能在蛋白質(zhì)合成方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

GO注釋將基因分為細(xì)胞組成、分子功能和生物過(guò)程三大類。菌株Y39-6基因組的GO注釋結(jié)果一共有4 533個(gè),與細(xì)胞組成、分子功能和生物過(guò)程相關(guān)的基因數(shù)量分別為2 025、3 748和2 059個(gè),GO注釋的基因占所有基因的71.17%。由圖3可知,在細(xì)胞組成方面,膜組成相關(guān)基因數(shù)量最多,為1 177個(gè),占GO注釋基因總數(shù)的18.48%;在生物過(guò)程方面,轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA模板相關(guān)基因數(shù)量最多,為146個(gè),占GO注釋基因總數(shù)的2.29%;在分子功能方面,DNA結(jié)合相關(guān)基因數(shù)量最多,為549個(gè),占GO注釋基因總數(shù)的8.62%。

根據(jù)菌株Y39-6的COG和GO注釋結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),該菌株在膜的組成、形成方面的基因數(shù)量均較多,可能是因?yàn)樵摼陱牡蜏氐叵滤蟹蛛x,菌株的生長(zhǎng)容易受到環(huán)境脅迫而發(fā)生變化,生物膜的組成和形成與微生物適應(yīng)不良環(huán)境相關(guān)[20],這可能也是菌株Y39-6適應(yīng)低溫環(huán)境的原因之一。

2.3 氮代謝基因分析

通過(guò)基因注釋結(jié)果分析,得到菌株Y39-6具有Nar、Nir、Nor、Nos和Nap 5種與氮代謝相關(guān)的基因簇。Nar為硝酸鹽還原酶,用于將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽;Nir為亞硝酸鹽還原酶,用于將亞硝酸鹽還原成氧化氮;Nor為氧化氮還原酶,用于將氧化氮還原成氧化亞氮;Nos為氧化亞氮還原酶,用于將氧化亞氮還原成氮?dú)?Nap為周質(zhì)硝酸鹽還原酶,用于將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽?；蚍植记闆r如表1所示,其中norV、norR、norD、norQ、norC、norB、napC、napB、napA、napD、napE、nosR、nosZ、nosD、nosL、narI、narJ、narH、narK、narL和nirS參與異養(yǎng)反硝化過(guò)程,napC、napB、napA、napD、napE、nirD和nirB參與自養(yǎng)脫氮過(guò)程。

表1 氮代謝基因

2.4 比較基因組學(xué)分析

2.4.1 基因組基本特征

前期研究發(fā)現(xiàn),菌株Y39-6的16S rRNA基因序列與PseudomonasveroniiCIP 104663T、Pseudomonasextremaustralis14-3T、PseudomonasgrimontiiCFML 97-514T和PseudomonasmarginalisATCC 10844T的相似度很高,超過(guò)99%。

菌株Y39-6與上述近緣模式菌株的基因組基本特征進(jìn)行了比對(duì)分析,結(jié)果如表2所示。G+C含量是每個(gè)物種基因組的重要指標(biāo),不同的基因組具有不同的G+C含量,菌株Y39-6的G+C含量為60.75%,與PseudomonasveroniiCIP 104663T的G+C含量(60.70%)最接近,與其他3株菌株的G+C含量相差也不大,屬于假單胞菌屬范圍[21],與16S rRNA分析結(jié)果一致;菌株Y39-6的rRNA數(shù)量為19個(gè),高于以上4株菌株,表明菌株Y39-6在DNA轉(zhuǎn)錄方面的基因數(shù)量可能比這4株菌株多。

表2 菌株Y39-6和近緣模式菌株的基因組基本特征

2.4.2 基因組同源性分析

維恩圖(Venn diagram)是一種非常直觀、易懂,用于描述數(shù)據(jù)集合之間的交集、并集、補(bǔ)集等關(guān)系的圖。菌株Y39-6與近緣模式菌株基因組同源關(guān)系如圖4所示。菌株Y39-6、PseudomonasveroniiCIP 104663T、Pseudomonasextremaustralis14-3T、PseudomonasgrimontiiCFML 97-514T、PseudomonasmarginalisATCC 10844T5株菌株間共有的基因簇有4 021個(gè),占總基因簇的72.06%。菌株Y39-6與PseudomonasveroniiCIP 104663T、Pseudomonasextremaustralis14-3T、PseudomonasgrimontiiCFML 97-514T、PseudomonasmarginalisATCC 10844T的共有基因分別有368、31、13、40個(gè),菌株Y39-6與PseudomonasveroniiCIP 104663T的共有基因最多。菌株Y39-6、PseudomonasveroniiCIP 104663T、Pseudomonasextremaustralis14-3T、PseudomonasgrimontiiCFML 97-514T、PseudomonasmarginalisATCC 10844T的特有基因簇分別有15、7、55、11、41個(gè)。菌株Y39-6特有基因簇的功能主要表現(xiàn)在跨膜運(yùn)輸、DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)換、硫化合物代謝、肽酶活力、抗生素生物合成、脂肪酸分解和烷基磺酸鹽單加氧酶7個(gè)方面。

圖4 菌株Y39-6基因組同源分析Fig.4 Genome homology analysis of strain Y39-6

2.5 生理生化特征分析

2.5.1 碳源利用

由BIOLOG檢測(cè)結(jié)果可知,菌株Y39-6可利用的碳源有β-D-葡萄糖、1%乳酸鈉、甘油、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、四硫酸奎納、D-葡萄糖酸、葡糖醛酰胺、乙酸、β-羥基-D,L-丁酸、γ-氨基丁酸、L-蘋果酸、L-乳酸、α-氧化-谷氨酸、檸檬酸和奎寧酸;微弱利用的碳源有糊精、D-海藻糖、蔗糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、D-巖藻糖、L-巖藻糖、肌苷、D-絲氨酸、D-山梨醇、D-甘露醇、D-阿拉伯糖醇、肌醇、D-果糖-6-磷酸、D-絲氨酸、L-天冬氨酸、L-組氨酸、L-絲氨酸、鹽酸胍、D-半乳糖醛酸、L-半乳糖酸內(nèi)脂、粘液酸、D-糖質(zhì)酸、β-羥基-丙乙酸、甲基丙酮酸、D-蘋果酸、乙酰乙酸和丙酸;不能利用二糖和多糖;對(duì)醋竹桃霉素、利福霉素SV、萬(wàn)古霉素、林肯霉素、四唑藍(lán)、四唑紫具有抗性;氯化鋰、二甲胺四環(huán)素不抑制菌株生長(zhǎng);對(duì)夫西地酸、亞碲酸鉀、溴琥珀酸、萘啶酮酸、氨曲南抗性較弱;不能水解明膠。

將菌株Y39-6和PseudomonasveroniiCIP 104663T[22]、Pseudomonasextremaustralis14-3T[23]、PseudomonasgrimontiiCFML 97-514T[24]和PseudomonasmarginalisATCC 10844T[25]的碳源利用情況進(jìn)行總結(jié),結(jié)果如表3所示。菌株Y39-6的生理生化特征與PseudomonasveroniiCIP 104663T的生理生化特征較為接近,兩菌株的生長(zhǎng)溫度范圍相似,最佳生長(zhǎng)溫度相似,并且均具有硝酸鹽還原能力,更支持了菌株Y39-6與Pseudomonasveronii同源[26]。

表3 菌株Y39-6與近緣模式菌株生理生化特征的差異

2.5.2 脂肪酸含量

將菌株Y39-6的脂肪酸種類和含量與PseudomonasveroniiCIP 104663T、Pseudomonasextremaustralis14-3T、PseudomonasgrimontiiCFML 97-514T、PseudomonasmarginalisATCC 10844T的脂肪酸含量進(jìn)行對(duì)比,如表4所示。由表4可知,菌株Y39-6檢測(cè)到的脂肪酸種類有C10∶0 3OH、C12∶0、C12∶0 2OH 、C12∶0 3OH、C16∶0、C17∶0 cyclo、C18∶1 ω7c和C19∶0 cyclo ω8c 8種,PseudomonasveroniiCIP 104663T、Pseudomonasextremaustralis14-3T、PseudomonasgrimontiiCFML 97-514T和PseudomonasmarginalisATCC 10844T的脂肪酸種類分別為11種、11種、10種和10種,菌株Y39-6的脂肪酸種類比其他4株假單胞菌所含有的脂肪酸種類少,但這5株菌株的C16∶0飽和脂肪酸含量均較高,分別為22.05%、27.96%、29.49%、25.7%和32.4%。菌株Y39-6的主要脂肪酸為C16∶0和C17∶0 cyclo,含量分別為22.05%和21.25%。該菌株的C12∶0 2OH、C12∶0 3OH、C17∶0 cyclo和C19∶0 cyclo ω8c 4種飽和脂肪酸含量均高于其他4株菌株。菌株Y39-6屬于Pseudomonasveronii物種,但兩者在脂肪酸種類與含量方面存在差異,表明種間差異大,菌株Y39-6具有獨(dú)特的特異性。

表4 菌株Y39-6與其近緣模式假單胞菌脂肪酸種類和含量的差異

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)菌株Y39-6的基因組和生理生化特征進(jìn)行分析,得到以下結(jié)論:

(1) 菌株Y39-6全基因組序列長(zhǎng)度為7 021 566 bp,G+C含量為60.75%;COG注釋的基因一共有5 378個(gè),在氨基酸運(yùn)輸和代謝方面的基因數(shù)量最多,為497個(gè);GO注釋的基因一共有4 533個(gè),在膜組成方面的基因數(shù)量最多,占GO注釋基因總數(shù)的18.48%,以上基因組特征可能是菌株Y39-6在蛋白質(zhì)合成、適應(yīng)低溫方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)的主要原因。

(2) 在菌株Y39-6氮代謝基因中,norV、norR、norD、norQ、norC、norB、napC、napB、napA、napD、napE、nosR、nosZ、nosD、nosL、narI、narJ、narH、narK、narL和nirS參與異養(yǎng)反硝化過(guò)程,napC、napB、napA、napD、napE、nirD和nirB參與自養(yǎng)脫氮過(guò)程。

(3) 菌株Y39-6與PseudomonasveroniiCIP 104663T的基因組特征相似,G+C含量接近,共有基因數(shù)量最多,為368個(gè),結(jié)合生理生化特征,證實(shí)菌株Y39-6屬于Pseudomonasveronii菌種。

(4) 菌株Y39-6有15個(gè)特有基因,主要集中在跨膜運(yùn)輸、DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)換、硫化合物代謝、肽酶活力、抗生素生物合成、脂肪酸分解和烷基磺酸鹽單加氧酶方面。

(5) 菌株Y39-6的細(xì)胞膜脂肪酸有C10∶0 3OH、C12∶0、C12∶0 2OH、C12∶0 3OH、C16∶0、C17∶0 cyclo、C18∶1 ω7c和C19∶0 cyclo ω8c 8種,主要脂肪酸為C16∶0和C17∶0 cyclo,含量分別為22.05%和21.25%,與Pseudomonasveronii菌種的其他菌株相比,存在明顯的特異性。