陳思思,姜曉丹,金海紅**，宗夢麟,王慧芳,孫詠梅,龔 姍,韓 琨

(1.秦皇島市第一醫(yī)院,秦皇島 066000;2.河北北方學(xué)院,張家口 075000;3.河北醫(yī)科大學(xué),石家莊 050000)

高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papilloma virus,HR-HPV)持續(xù)感染是宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(squamous intraepithelial lesion,SIL)、宮頸癌發(fā)生的明確病因。采取規(guī)范的篩查策略可發(fā)現(xiàn)大部分的SIL,對SIL及時進(jìn)行干預(yù)處理可阻斷其進(jìn)一步發(fā)展為宮頸癌?，F(xiàn)階段廣泛應(yīng)用于臨床的初篩手段包括HR-HPV檢測、細(xì)胞學(xué)檢查或二者聯(lián)合。研究表明,HR-HPV檢測在檢出HSIL及以上病變中有較高的敏感性和陰性預(yù)測值,可能比細(xì)胞學(xué)檢測更適合作為初篩手段[1]。然而值得注意的是,HR-HPV檢測雖然可檢出不少HR-HPV陽性患者,但其中僅有一部分被診斷SIL甚至宮頸癌,這與該方法存在一定的局限性有關(guān)[2]:(1)一次特定HPV基因型檢測不能區(qū)分患者為暫時性感染還是持續(xù)性感染;(2)HR-HPV檢測陽性提示宮頸癌發(fā)生風(fēng)險增加,不提示是否發(fā)生病變。為了減少因HR-HPV檢測方法自身局限性所帶來的過度診療,常需對初篩陽性患者進(jìn)一步分流,國內(nèi)外專家共識首推細(xì)胞學(xué)檢查和HPV16/18分型檢測,其中HPV16/18分型檢測不適用于HR-HPV(除HP16/18分型)陽性患者分流,而細(xì)胞學(xué)檢查敏感性較低且對病理水平要求高、可重復(fù)性差,難以大范圍普及。近年來隨著對HR-HPV感染引起的宮頸癌相關(guān)機(jī)制研究的深入,許多新興分流手段逐漸涌出,如HR-HPV載量檢測、p16/Ki67細(xì)胞學(xué)雙染、DNA甲基化檢測、微小RNA(miRNA)檢測、免疫微環(huán)境評估。其中DNA甲基化檢測具有很好的應(yīng)用前景,可用于宮頸癌初篩異常的分流、治療后隨訪以及遠(yuǎn)期預(yù)后監(jiān)測[3-5]。最近一項(xiàng)納入全基因組甲基化測序的研究發(fā)現(xiàn),ATP10a甲基化水平與宮頸疾病進(jìn)展顯著相關(guān)[6]。本研究旨在評估ATP10a甲基化檢測在HR-HPV感染患者中檢出子宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)及宮頸鱗癌(squamous cell carcinoma,SCC)的效能。

1 資料與方法

1.1 資料來源 收集2022年2月2022年9日于秦皇島市第一醫(yī)院婦科門診行宮頸癌篩查且HR-HPV檢測提示陽性(包括HPV16、18,其他高危型)女性的宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本,并于4℃冰箱內(nèi)儲存直至DNA提取用于甲基化檢測。同時收集患者資料:年齡、TCT結(jié)果、陰道鏡檢查所見及活檢病理結(jié)果。納入標(biāo)準(zhǔn):有性生活,未懷孕;子宮完整且無宮頸疾病治療史;無其他癌癥治療史;有陰道鏡活檢病理結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn):既往或正在接種HPV疫苗;既往患生殖器疣;處于免疫低下或抑制狀態(tài)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn),患者知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取及亞硫酸氫鹽修飾 按DNA提取試劑盒(北京天根生物有限公司產(chǎn))說明書操作提取宮頸脫落細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中的DNA。提取的DNA標(biāo)本使用QuawellQ5000紫外分光光度儀測定其純度、濃度,將合格樣品的純度定于1.8～2.0之間,濃度不小于20ng/μL,置-20℃保存。按EZ DNA Methlation-GoldTMKit(美國Zymo Research公司產(chǎn))試劑盒說明書操作對DNA標(biāo)本進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾,修飾的DNA(BS-DNA)置-20℃保存。

1.2.2 甲基化特異性PCR(MSP)法檢測宮頸脫落細(xì)胞中ATP10a甲基化狀態(tài) 在UCSC網(wǎng)站(http://genome.ucsc.edu/)查找ATP10a基因序列,根據(jù)引物設(shè)計(jì)軟件Methyl Primer Express V1.0設(shè)計(jì)MSP引物,包括甲基化引物(M引物)和非甲基化引物(U引物),引物由上海生工公司合成,序列見表1。MSP總反應(yīng)體系20μL:AmpliTaq Gold 360 Master Mix(美國Zymo Research公司產(chǎn))10μL,360 GC Enhancer 1μL,10μmol/L上下游引物各0.4μL,BS-DNA 2μL,ddH2O 6.2μL。循環(huán)參數(shù):95℃ 10min;95℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 1min,共40個循環(huán);72℃ 7min;4℃保持至使用。MSP產(chǎn)物在2%濃度的瓊脂糖凝膠(1∶10000加入核酸染料)中,以電壓150V電泳30min,用UV凝膠電泳成像及圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。選取ddH2O做為空白對照,EpiTect?PCR Control DNA(德國Qiagen公司產(chǎn))的M標(biāo)準(zhǔn)品(經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的完全甲基化的DNA)、U標(biāo)準(zhǔn)品(經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的完全未甲基化的DNA)分別作為M引物體系及U引物體系的陽性對照。

表1 ATP10a基因的MSP引物序列

1.2.3 甲基化結(jié)果評定標(biāo)準(zhǔn) 結(jié)合MSP產(chǎn)物電泳結(jié)果:(1)完全甲基化:M引物擴(kuò)增出目的條帶,而U引物未擴(kuò)增出目的條帶;(2)非甲基化:U引物擴(kuò)增出目的條帶,而M引物未擴(kuò)增出目的條帶;(3)不完全甲基化:M引物和U引物均擴(kuò)增出目的條帶,統(tǒng)計(jì)時將不完全甲基化歸入甲基化。為進(jìn)行MSP檢測的質(zhì)量控制,隨機(jī)選取10%的標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 陰道鏡檢查及宮頸活檢病理 結(jié)合中國優(yōu)生科學(xué)協(xié)會陰道鏡和宮頸病理學(xué)分會(CSCCP)制定的陰道鏡轉(zhuǎn)診指征,由專門婦科陰道鏡室醫(yī)師進(jìn)行陰道鏡檢查并對可疑病變部位進(jìn)行活檢,活檢病理由2位高年資病理醫(yī)師獨(dú)立閱片。將活檢病理為炎癥、子宮頸低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)統(tǒng)稱為LSIL-組,HSIL、SCC統(tǒng)稱為HSIL+組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用MedCalc、SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將活檢病理HSIL+作為金標(biāo)準(zhǔn),比較TCT、HPV16/18分型、ATP10a基因甲基化檢測的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值(positive predictive value,PPV)、陰性預(yù)測值(negative predictive value,NPV)及受試者工作特征曲線下面積(area under the curve,AUC)。采用ROC曲線分析TCT、ATP10a基因甲基化檢測在HR-HPV(除HPV 16/18)陽性患者中診斷HSIL+的效能。計(jì)數(shù)資料比較使用χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料采用Kruskal-Wallis分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者一般資料 共納入145例患者,SCC 15例,HSIL 52例,LSIL 41例,炎癥37例,其中HSIL+組(HSIL+SCC)67例,LSIL-組(炎癥+LSIL)78例。HPV16/18分型陽性,TCT結(jié)果異常(≥ASCUS)、ATP10a甲基化陽性率分別為40.69%(59/145)、59.31%(86/145)、42.07%(61/145)?？?cè)巳浩骄挲g(44.21±12.72)歲,其中HISL+組(46.60±13.69)歲、LSIL-組(42.15±11.52)歲,HPV16/18分型陽性者(46.07±13.27)歲、HR-HPV(除HPV16/18)陽性者(42.93±12.24)歲,TCT結(jié)果異常者(44.45±12.08)歲、TCT結(jié)果正常者(43.85±13.69)歲,ATP10a甲基化陽性者(46.48±13.70)歲、陰性者(42.56±11.77)歲,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.060、0.165、0.730、0.070)。

2.2 ATP10a甲基化狀態(tài)、TCT結(jié)果異常、HPV16/18分型陽性與宮頸病變嚴(yán)重程度關(guān)系 以活檢病理為金標(biāo)準(zhǔn),炎癥組、LSIL組、HSIL組、SCC組的ATP10a甲基化陽性率分別為13.51%(5/37)、24.39%(10/41)、65.38%(34/52)、80%(12/15);LSIL-組(炎癥+LSIL)ATP10a陽性率[19.23%(15/78)]顯著低于HSIL+組(HSIL+SCC)[68.66%(46/67)](P<0.05),見表2、圖1。HPV16/18分型陽性在炎癥組、LSIL組、HSIL組、SCC組的占比分別為29.73%(11/37)、26.83%(11/41)、53.85%(28/52)、60.00%(9/15);LSIL-組(炎癥+LSIL)HPV16/18陽性比例占28.21%(22/78)顯著低于HSIL+組(HSIL+SCC)55.22%(37/67)(P<0.05)。TCT結(jié)果異常在炎癥組、LSIL組、HSIL組、SCC組的占比分別為40.54%(15/37)、51.22%(21/41)、71.15%(37/52)、86.67%(13/15);LSIL-組(炎癥+LSIL)TCT結(jié)果異常比例[46.15%(36/78)]顯著低于HSIL+組(HSIL+SCC)[74.63%(50/67)](P<0.05),見表2。

圖1 典型標(biāo)本的甲基化狀態(tài)示意圖A:M引物體系;B:U引物體系;1:1500bp DNA Marker;2:M標(biāo)準(zhǔn)品;3:U標(biāo)準(zhǔn)品;4:ddH2O;5～7:HSIL+組MSP產(chǎn)物;8～10:LSIL組MSP產(chǎn)物

表2 HPV16/18陽性、TCT結(jié)果異常和ATP10a甲基化陽性率對比

2.3 ATP10a甲基化檢測、TCT在HR-HPV感染患者中診斷HSIL+的比較 HR-HPV感染患者中,42.07%(61/145)ATP10a甲基化陽性,59.31%(86/145)TCT結(jié)果異常。ATP10a甲基化診斷HSIL+的特異性、PPV、AUC(80.77%、75.41%、0.747)均高于TCT(53.85%、58.14%、0.642),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05);敏感性、NPV(68.66%、75.00%)與TCT(74.63%、71.19%)相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),見表3、圖2。對于HR-HPV陽性患者采取ATP10a甲基化檢測代替TCT進(jìn)行分流,陰道鏡轉(zhuǎn)診率降低17.24%,但兩種分流方式均有漏診SCC可能,見表2。

圖2 ATP10a及TCT診斷HSIL+ROC對比

表3 TCT、ATP10a甲基化檢測診斷HSIL+指標(biāo)對比

2.4 ATP10a甲基化檢測、HPV16/18分型在HR-HPV感染患者中診斷HSIL+的比較 HR-HPV感染患者中,40.69%(59/145)HPV16/18分型陽性,42.07%(61/145)ATP10a甲基化陽性。ATP10a甲基化診斷HSIL+的AUC顯著高于HPV16/18分型檢測(0.747、0.635)(P=0.033),見表4、圖3。ATP10a甲基化檢測的敏感性、特異性、PPV、NPV(68.88%、80.77%、75.41%、75.00%)均高于HPV16/18分型檢測(55.22%、71.79%、62.71%、65.12%),但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。對于HR-HPV陽性患者采取ATP10a甲基化、HPV16/18分型進(jìn)行分流,陰道鏡轉(zhuǎn)診率分別為42.76%、41.69%,而HPV16/18分型檢測漏診SCC的概率為40%(6/15)。

圖3 ATP10a及HPV16/18分型診斷HSIL+ROC對比

表4 HPV16/18分型、ATP10a甲基化檢測診斷HSIL+指標(biāo)對比

2.5 ATP10a甲基化檢測、TCT在HR-HPV(除HPV16/18)感染中診斷HSIL+的比較 在HR-HPV感染患者中,59.31%(86/145)患者存在HR-HPV(除HPV16/18)感染。這類患者中,ATP10a甲基化診斷HSIL+的特異性(80.36%)明顯高于TCT(48.21%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ATP10a甲基化的敏感性、PPV、NPV、AUC分別為63.33%、63.66%、80.36%、0.718,TCT分別為73.33%、43.13%、77.14%、0.608,對比各項(xiàng)指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),見表5及圖4。

圖4 其余HR-HPV感染中ATP10及TCT診斷HSIL+ROC對比

表5 HR-HPV(除HPV16/18)感染中TCT、ATP10a甲基化檢測診斷HSIL+指標(biāo)對比

3 討 論

3.1 DNA甲基化檢測在宮頸癌篩查中的應(yīng)用 HR-HPV持續(xù)感染宿主細(xì)胞會引起遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變,誘導(dǎo)宮頸癌的發(fā)生。表觀遺傳學(xué)因改變多早于基因組學(xué)層面且存在可逆性,已成為腫瘤精準(zhǔn)研究的重要方向之一[7]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的主要修飾方式,甲基化的累加效應(yīng)在由宮頸正常組織到癌前病變到宮頸癌的發(fā)展過程中有著重要的意義。有關(guān)基因甲基化在宮頸癌篩查及管理中應(yīng)用的研究逐年增加。臺灣一項(xiàng)研究[8]納入429例hrHPV+女性,分析PAX1甲基化、細(xì)胞學(xué)檢測、HPV16/18分型檢分流CIN3+的能力,發(fā)現(xiàn)PAX1甲基化檢測的準(zhǔn)確性和特異性(分別為91.6%和92.5%)優(yōu)于HPV16/18(分別為76.9%和76.8%)。多個甲基化指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用在宮頸癌早期篩查中具有良好的應(yīng)用前景,有數(shù)據(jù)表明[9-10],CADM1/MAL甲基化在hrHPV感染女性中鑒別CIN3+的敏感性為68.4%～70%,特異性為71.2%～78%。3個甲基化組(C13ORF18/EBP41L3/JAM3,C13ORF18/ANKRD18CP/JAM3和ZSCAN1/SOX1)在中國HR-HPV陽性女性隊(duì)列中鑒別CIN3+病變的敏感性分別為93%、90%和89%,特異性分別為58%、63%和65%[3]。Mariam等[6]研究發(fā)現(xiàn),ATP10a、HAS1甲基化水平隨著宮頸病變嚴(yán)重程度的增加而升高,其中ATP10a聯(lián)合HAS1雙基因檢出SCC的敏感性及特異性均為100%。ATP10a位于人類染色體15q11-q13,屬于蛋白編碼基因,編碼的蛋白質(zhì)屬于P型陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶家族以及氨基磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶亞家族。雖然此前ATP10a與宮頸癌的關(guān)系沒有被描述過,但已有研究發(fā)現(xiàn)ATP10a與白血病等腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11-12]。

3.2 ATP10a甲基化對HR-HPV感染患者分流的作用 本研究采用MSP技術(shù)對HR-HPV感染的不同級別宮頸上皮內(nèi)病變的宮頸脫落細(xì)胞中ATP10a甲基化狀態(tài)進(jìn)行定性檢測,數(shù)據(jù)顯示炎性組、LISL組、HSIL組、SCC組中ATP10a甲基化陽性率分別為13.51%、24.39%、65.38%、80%,其中LSIL-組(炎癥+LSIL)陽性率19.23%,顯著低于HSIL+組(HSIL+SCC)(68.66%),ATP10a甲基化陽性率隨著宮頸上皮內(nèi)病變嚴(yán)重程度的加重而逐步升高,這與Mariam等[6]研究結(jié)果一致,提示ATP10a甲基化狀態(tài)可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。通過ROC曲線評估ATP10a甲基化在HR-HPV感染患者中診斷HISL+的效價,分別與TCT及HPV16/18分型進(jìn)行對比,發(fā)現(xiàn)ATP10a甲基化檢測的特異性、PPV、AUC(80.77%、75.41%、0.747)均高于TCT(53.85%、58.14%、0.642),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ATP10a甲基化檢測敏感性稍低于TCT(68.66%、74.63%),NPV高于TCT(75.00%,71.19%),但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ATP10a甲基化診斷HSIL+的AUC顯著高于HPV16/18分型檢測(0.747、0.635,P=0.033)。ATP10a甲基化檢測的敏感性、特異性、PPV、NPV(68.88%、80.77%、75.41%、75.00%)均高于HPV16/18分型檢測(55.22%、71.79%、62.71%、65.12%),但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。分析ATP10a甲基化檢測HSIL+的AUC高于TCT、HPV16/18分型可能原因如下:(1)因受取材方式、人工閱片等主觀性影響TCT檢測結(jié)果容易出現(xiàn)偏差;(2)HR-HPV感染常為一過性感染,并不能直接反映宮頸上皮細(xì)胞的分子狀態(tài),而由此產(chǎn)生的表觀遺傳效應(yīng)差異是導(dǎo)致不同程度宮頸病變發(fā)生的直接原因[13]。推測ATP10a甲基化參與了表觀遺傳學(xué)變化的進(jìn)程,某種程度上介導(dǎo)了宮頸疾病的發(fā)生與發(fā)展,因此檢測HSIL+病變的效能高于TCT、HPV16/18分型檢測,但有關(guān)ATP10a影響宮頸病變發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制還需更深入研究。

本研究比較了ATP10a甲基化、TCT在HR-HPV(除HPV16/18)陽性患者中的分流價值。結(jié)果顯示,ATP10a甲基化鑒別HSIL+的特異性(80.36%)顯著高于TCT(48.21%),而敏感性、PPV、NPV、AUC(63.33%、63.66%、80.36%、0.718)與TCT(73.33%、43.13%、77.14%、0.608)無明顯差異。以上分析結(jié)果與總體人群并不完全一致,可能與樣本量少有關(guān),后續(xù)需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證,但結(jié)合目前數(shù)據(jù),ATP10a甲基化在HR-HPV感染患者分流效能并不劣于TCT、HPV16/18分型檢測。與TCT相比,采取ATP10a甲基化對HR-HPV陽性患者進(jìn)行分流時,陰道鏡轉(zhuǎn)診率減少17.24%。Mariam等[6]研究報道的ATP10a聯(lián)合HAS1雙基因檢出SCC的敏感性及特異性均為100%。本研究顯示TCT、ATP10a甲基化檢出SCC的概率分別為86.67%、80.00%,二者均有漏診SCC的可能,這可能與本研究既未聯(lián)合HAS1甲基化,又采取精準(zhǔn)度低于高通量測序的MSP定性檢測甲基化水平有關(guān)。細(xì)胞學(xué)檢查對細(xì)胞病理水平要求高且主觀性強(qiáng),即使是高質(zhì)量的細(xì)胞學(xué)檢查仍會漏診30%以上的HSIL+病變[14]。而HPV16/18分型檢測不適合用于HR-HPV(除HPV16/18)陽性患者的分流。與細(xì)胞學(xué)及HPV16/18分型檢測相比,甲基化檢測操作方便、自動化、重復(fù)性高、準(zhǔn)確性高,還可自采樣獲取,具有廣闊的應(yīng)用前景[3]。

本研究初步驗(yàn)證了ATP10a甲基化檢測在HR-HPV感染患者中分流的價值,但仍有幾點(diǎn)不足之處:(1)選擇MSP方法對ATP10a甲基化狀態(tài)進(jìn)行定性檢測,如后續(xù)能對ATP10a甲基化進(jìn)行更為精確的定量檢測,可能會提高該指標(biāo)的診斷效能;(2)研究中所有宮頸組織病理結(jié)果均基于宮頸活檢,可能與最終病理結(jié)果存在差異,可能影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性;(3)納入樣本量少且并未涵蓋除SCC以外的其余類型宮頸癌以及HIV等免疫力低下人群。

綜上,ATP10a甲基化檢測對HR-HPV感染患者的分流有一定應(yīng)用價值,其診斷HSIL+的效能不劣于TCT、HPV16/18分型檢測。但ATP10a甲基化檢測能否作為早期診斷宮頸癌的手段,還需大規(guī)模、前瞻性、全面且更為精準(zhǔn)的臨床研究進(jìn)一步評估。