王 璇，陳林珍，林瑞超，陳美琳，范琦琦，李芝奇，趙崇軍，李向日

重樓皂苷I對(duì)斑馬魚發(fā)育毒性、抗血管新生活性及其機(jī)制研究

王 璇，陳林珍，林瑞超，陳美琳，范琦琦，李芝奇，趙崇軍*，李向日*

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中藥炮制研究中心，北京 102488

基于模式生物斑馬魚研究重樓皂苷I的發(fā)育毒性、抗血管新生活性，并利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究重樓皂苷I抗血管新生的作用機(jī)制。將受精后6 h（6 h post fertilization，6 hpf）的斑馬魚胚胎暴露于不同濃度的重樓皂苷I中96 h，在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)確認(rèn)重樓皂苷I對(duì)斑馬魚胚胎的致死曲線，計(jì)算20%致死濃度（20% lethal concentration，LC20）。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，以斑馬魚自主抽動(dòng)次數(shù)、96 hpf心率、斑馬魚肝臟面積、靜脈竇-動(dòng)脈球間距、總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）含量等指標(biāo)，結(jié)合吖啶橙、油紅O染色觀察綜合評(píng)價(jià)重樓皂苷I的發(fā)育毒性及其相關(guān)靶器官毒性。安全劑量條件下，以斑馬魚肝臟面積和靜脈竇-動(dòng)脈球間距評(píng)價(jià)重樓皂苷I對(duì)相關(guān)靶器官的影響，同時(shí)以節(jié)間血管數(shù)評(píng)價(jià)重樓皂苷I對(duì)斑馬魚節(jié)間血管生長(zhǎng)的影響?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)重樓皂苷I抗血管新生的作用機(jī)制并通過(guò)qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。重樓皂苷I對(duì)斑馬魚胚胎的致死曲線為＝270－23.62，LC20為0.16 μg/mL；在亞致死濃度暴露條件下的實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，與對(duì)照組比較，0.16 μg/mL重樓皂苷I能夠誘導(dǎo)斑馬魚幼魚出現(xiàn)卵黃囊吸收延遲，脊柱彎曲，尾巴畸變等明顯的毒性特征，且T-CHO、TG、LDL-C含量明顯升高（＜0.05、0.01）；吖啶橙染色及油紅O染色表明0.16 μg/mL重樓皂苷I能引起斑馬魚肝臟細(xì)胞凋亡和脂肪變性。在安全劑量條件下，與對(duì)照組比較，0.06、0.09 μg/mL重樓皂苷I對(duì)主要臟器沒有明顯影響，但可以抑制節(jié)間血管數(shù)（＜0.01）。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)重樓皂苷I可通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、類固醇受體共激活因子（steroid receptor coactivator，SRC）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等關(guān)鍵靶點(diǎn)，調(diào)控EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性等相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)而發(fā)揮抗血管新生的作用，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了以上靶點(diǎn)。重樓皂苷I過(guò)高劑量使用會(huì)造成斑馬魚胚胎發(fā)育毒性，而在安全劑量條件下，重樓皂苷I通過(guò)調(diào)節(jié)EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性等相關(guān)通路發(fā)揮明顯的抗血管新生活性，為重樓皂苷I的臨床用藥安全及開發(fā)利用提供了思路，同時(shí)也為毒性中藥的“有效性-安全性”綜合評(píng)價(jià)提供了參考。

重樓皂苷I；斑馬魚；發(fā)育毒性；抗血管新生；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A；雷帕霉素靶蛋白；類固醇受體共激活因子；表皮生長(zhǎng)因子受體

毒性中藥是中藥臨床使用中的特色，且大多數(shù)毒性中藥在臨床疑難雜癥中發(fā)揮著顯著的治療作用。然而，目前大多數(shù)研究者更多關(guān)注于毒性中藥中活性物質(zhì)基礎(chǔ)篩選以及活性機(jī)制探討，對(duì)毒性中藥的安全性研究相對(duì)缺乏，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用中毒-效之間的聯(lián)系和轉(zhuǎn)化不明確，限制了毒性中藥的廣泛使用。因此，選擇合適的技術(shù)和方法對(duì)毒性中藥的毒-效進(jìn)行同步評(píng)價(jià)，能夠?yàn)殛U釋毒性中藥的內(nèi)涵和本質(zhì)特征、指導(dǎo)臨床安全使用提供參考。重樓皂苷I是中藥重樓中含量最高的甾體皂苷類成分[1]，具有抗炎[2]、抗腫瘤[3]、抗菌[4]和心血管保護(hù)[5]等作用，然而，重樓皂苷I也存在毒性報(bào)道，且多集中于肝毒性[6-7]、溶血作用[8]、生殖毒性[9]等，但目前未見胚胎發(fā)育毒性相關(guān)報(bào)道。同時(shí)，重樓皂苷I活性機(jī)制及毒-效關(guān)系尚不明確，一定程度上限制了其在臨床中的應(yīng)用。

血管新生是在原有血管的基礎(chǔ)上構(gòu)建新血管的過(guò)程[10]，腫瘤的增殖、分化依賴于血管新生，抗血管新生可能是治療癌癥的有效方法[11]。目前抗血管新生藥物及與血管新生有關(guān)的靶點(diǎn)識(shí)別已成為腫瘤靶向治療的重要研究方向之一[12]。研究表明，重樓皂苷I在抗腫瘤方面療效顯著[3]，但目前在其抑制血管新生方面研究較少。因此本研究對(duì)重樓皂苷I是否具有抗血管新生作用進(jìn)行考察，并在假設(shè)成立的前提下對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探究，旨在為重樓皂苷I抗腫瘤治療提供新的思路。

斑馬魚與人類具有87%的基因同源性，其胚胎透明且實(shí)驗(yàn)周期短，被廣泛應(yīng)用于藥物研究[13]，既具有細(xì)胞等體外實(shí)驗(yàn)用藥量少、實(shí)驗(yàn)費(fèi)用低、高通量等特點(diǎn)[14]，又具備整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可同步觀察多個(gè)器官、進(jìn)行藥效學(xué)及安全性評(píng)價(jià)等優(yōu)勢(shì)[15-16]。因此，本研究以斑馬魚為模式生物，對(duì)重樓皂苷I的發(fā)育毒性及抗血管新生活性進(jìn)行探究，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)重樓皂苷I抗血管新生的作用機(jī)制并通過(guò)qRT-PCR加以驗(yàn)證，以期為重樓皂苷I的臨床用藥安全及開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

AB系野生型斑馬魚和Tg（fabp10a:dsRed；ela3l:EGFP）、Tg（VHL:cmlc-gfp）熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，由北京中醫(yī)藥大學(xué)斑馬魚實(shí)驗(yàn)平臺(tái)養(yǎng)殖于集中式斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)。斑馬魚的養(yǎng)殖、繁育和實(shí)驗(yàn)所需樣本的收集和處理均按照標(biāo)準(zhǔn)[17]進(jìn)行。

1.2 藥品與試劑

重樓皂苷I（批號(hào)PCB153，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；總蛋白測(cè)定試劑盒（批號(hào)20220322）、總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）試劑盒（批號(hào)20211023）、三酰甘油（triglyceride，TG）試劑盒（批號(hào)20210716）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒（批號(hào)20210719）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；4%多聚甲醛（批號(hào)p1110）購(gòu)自北京生物科技有限公司；20×SSC緩沖液（批號(hào)DE0176）、丙二醇（批號(hào)0575-41）、油紅O染料（批號(hào)S19039）購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；丙三醇（批號(hào)1198677873）購(gòu)自北京虹湖聯(lián)合化工產(chǎn)品有限公司；NaCl、KCl、Na2HPO4、K2HPO4、MgSO4、NaHCO3、CaCl2均為分析純，購(gòu)自北京化工廠；TransZol Up Plus RNA Kit（批號(hào)ER501）、Fast King cDNA第一鏈合成試劑盒（批號(hào)KR116）購(gòu)自蘭博利德生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

Stemi508型體視顯微鏡（卡爾·蔡司股份公司）；TE-2000-S型光學(xué)倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；HPG-280BX型光照培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)公司）；ESEN-AW-S型斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛生生物科技有限公司）；Gene5型酶標(biāo)儀（伯騰儀器有限公司）；CFX96型Real-Time PCR System（美國(guó)Bio-Rad公司）；NanoDrop 2000型微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 給藥溶液的配制

參照課題組前期研究方法[18]配制斑馬魚胚胎養(yǎng)殖水和給藥溶液，精密稱取0.003 mg重樓皂苷I溶于200 μL的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解液（DMSO體積分?jǐn)?shù)小于0.5%），充分搖勻后待完全溶解即為儲(chǔ)備液。實(shí)驗(yàn)前，用胚胎培養(yǎng)液將儲(chǔ)備液稀釋至所需質(zhì)量濃度即可。

2.2 重樓皂苷I的安全性評(píng)價(jià)

2.2.1 重樓皂苷I的安全性評(píng)價(jià)及安全劑量的確定 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將受精后6 h（6 h post fertilization，6 hpf）的健康胚胎隨機(jī)轉(zhuǎn)入含有不同濃度的重樓皂苷I溶液的12孔板中暴露96 h，以胚胎水為對(duì)照組，于藥物不同處理時(shí)間觀察并記錄胚胎死亡率和健康狀態(tài)。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，利用Graph Pad Prism 9軟件繪制劑量-反應(yīng)曲線，計(jì)算20%致死濃度（20% lethal concentration，LC20）。

2.2.2 重樓皂苷I對(duì)不同發(fā)育階段斑馬魚胚胎主要臟器發(fā)育表型的影響 在安全劑量條件下（＜LC0）暴露給藥，觀察藥物暴露24、48、72、96 hpf后胚胎的發(fā)育情況與形態(tài)變化，并拍照記錄；于倒置顯微鏡下觀察各劑量組斑馬魚幼魚心臟發(fā)育情況，錄像記錄各劑量組24 hpf時(shí)1 min內(nèi)胚胎魚尾的自主抽動(dòng)次數(shù)（＝6）及96 hpf時(shí)斑馬魚幼魚10 s內(nèi)心臟跳動(dòng)次數(shù)（＝6）；每組收集80尾幼魚樣本，于PBS（1∶9）中勻漿，2500 r/min離心10 min，取上清液按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定T-CHO、TG、LDL-C水平；暴露終點(diǎn)時(shí)，使用2.5 μg/mL吖啶橙染色確認(rèn)重樓皂苷對(duì)主要臟器的影響；通過(guò)油紅染色方法確認(rèn)主要臟器脂肪堆積狀態(tài)。

2.3 重樓皂苷I的抗血管新生活性評(píng)價(jià)

在安全劑量條件下（＜LC0）進(jìn)行暴露給藥，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（斑馬魚培養(yǎng)水），在實(shí)驗(yàn)暴露終點(diǎn)，于倒置顯微鏡下觀察各濃度組斑馬魚的節(jié)間血管、肝臟及心臟表型，拍照記錄。觀察完整體節(jié)間血管（intersegmental vessel，ISV）和缺陷ISV的形態(tài)，手動(dòng)統(tǒng)計(jì)各組ISV數(shù)目，以評(píng)估重樓皂苷I的抗血管新生活性；斑馬魚的SV-BA距離即靜脈竇（sinusvenosus，SV）和動(dòng)脈球（bulbus arteriosus, BA）的間距，若斑馬魚心臟受到影響，其心房和心室的位置將發(fā)生改變，SV-BA距離隨之改變，故以此作為本研究心臟毒性評(píng)估指標(biāo)，用Image J軟件測(cè)量各濃度組SV-BA距離及肝面積變化。

2.4 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究重樓皂苷I抗血管新生的作用機(jī)制

2.4.1 活性靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及抗血管新生靶點(diǎn)獲取 通過(guò)PubChem（https: //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www. swisstargetprediction.ch/）中進(jìn)行重樓皂苷I的靶點(diǎn)基因預(yù)測(cè)。以“antiangiogenic”在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）中篩選獲得抗血管新生的靶點(diǎn)基因。取重樓皂苷I靶點(diǎn)基因與抗血管新生靶點(diǎn)基因的交集作為重樓皂苷I發(fā)揮抗血管新生作用的潛在靶點(diǎn)基因，并運(yùn)用Venny2.1（https:// string-db.org/）繪制Venny圖，通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，并利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

2.4.2 基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 將關(guān)鍵靶點(diǎn)基因輸入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)（https://metascape.org/），獲得GO功能注釋及KEGG通路富集分析結(jié)果，并利用微生信平臺(tái)（http://www.bioinformatics.com. cn/login/）進(jìn)行可視化分析。

2.4.3 qRT-PCR驗(yàn)證 取“2.2.1”項(xiàng)下處理的斑馬魚，加入Trizol試劑提取總RNA后，通過(guò)凝膠電泳和紫外分光度計(jì)檢測(cè)RNA的完整性，再用FastKing cDNA合成試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行qRT-PCR分析。、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，）、類固醇受體共激活因子（steroid receptor coactivator，）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，）、、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，）、表皮生長(zhǎng)因子受體2（epidermal growth factor receptor 2，）、趨化因子受體4（chemokine receptor 4，）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（fibroblast growth factor 2，）引物序列見表1。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因序列(5’-3’) β-actinF: GGCTGTGCTGTCCCTGTAT R: GGGCGTAACCCTCGTAGAT VEGFAF: TACATCCCGTCCTGTGTGGTTCTC R: TTGACCCGCAGCACCTCCATAG mTORF: GGGAGAGCGTATGAGAGAGGAGATG R: AAACTGGTGAAGGGCGTGATGTG SRCF: AACCGCAGTCCACCAGTAGAGG R: ACGCCGCCTAATATGCCGATTC EGFRF: CTGGACGAGACGGAAGAGGAGTATC R: GCTGAAGAAGGGCTTTGTGGAGAG JUNF: GAGAGCCAGGAGCGGATTAAAGC R: TGCGACTTCAGGGTCTTGACTTTG CASP3F: CGGAGACTGTGTGGACGCAAAG R: GAAGGCATGGGATTGAGGCTTGG ERBB2F: GAGGCTTATGTGATGGCAGGTGTAG R: CCGTATGGCATGAGCTGAGTAACC CXCR4F: ATGGACTTGTGGTGCTTGTGATGG R: AAATGGCAGGGTGAGGACAAACAG FGF2F: AAGGCATCTGTACCAACCGTTTCC R: AGTCGGGATACTTGCGGGATCTG

3 結(jié)果

3.1 重樓皂苷I的安全性評(píng)價(jià)

3.1.1 劑量-反應(yīng)曲線的繪制 依據(jù)統(tǒng)計(jì)藥物處理后96 hpf胚胎的死亡率，用GraphPad Prism 9軟件曲線擬合繪制劑量-反應(yīng)曲線（圖1-A），擬合所得曲線方程為＝270－23.62，2＝0.997 5可計(jì)算出LC20為0.16 μg/mL。

A-不同質(zhì)量濃度的重樓皂苷I處理24 h后斑馬魚幼魚的量-毒曲線 B-重樓皂苷I對(duì)不同發(fā)育階段斑馬魚胚胎發(fā)育影響的表型觀察 C-重樓皂苷I對(duì)斑馬魚胚胎24 h自主抽動(dòng)次數(shù)及對(duì)幼魚96 h心率的影響 D-重樓皂苷I對(duì)T-CHO、TG及LDL-C含量的影響 E-吖啶橙和油紅O染色（圖E-a中箭頭表示肝細(xì)胞區(qū)域，圖E-b中箭頭表示肝臟脂肪變性區(qū)域） 與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.1.2 重樓皂苷I對(duì)不同發(fā)育階段斑馬魚胚胎主要臟器發(fā)育表型的影響 亞致死濃度暴露條件下，與對(duì)照組比較，各暴露組24、47、72 hpf的胚胎及幼魚未見明顯異常；96 hpf的0.16 μg/mL組幼魚均出現(xiàn)明顯的毒性特征，如卵黃囊吸收延遲，脊柱彎曲，尾巴畸變等（圖1-B）。與對(duì)照組比較，0.09、0.16 μg/mL組斑馬魚在24 hpf的1 min內(nèi)自主抽動(dòng)次數(shù)及96 hpf的10 s內(nèi)心臟跳動(dòng)次數(shù)差別不大，均無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1-C）；此外，0.16 μg/mL組中T-CHO、TG、LDL-C含量均明顯升高（＜0.05、0.01，圖1-D）。吖啶橙染色結(jié)果顯示，0.16 μg/mL組肝臟區(qū)域出現(xiàn)黃綠色熒光小點(diǎn)，表明存在肝細(xì)胞凋亡現(xiàn)象（圖1-E-a），同時(shí)油紅O染色結(jié)果顯示該濃度組斑馬魚肝臟區(qū)域呈現(xiàn)紅色，提示存在肝臟脂肪變性（圖1-E-b）。

3.2 重樓皂苷I的抗血管新生活性評(píng)價(jià)結(jié)果

安全劑量條件下，與對(duì)照組比較，各組斑馬魚肝臟均形態(tài)清晰，呈透明狀，未見明顯肝損傷（圖2-A），同時(shí)各組肝臟面積無(wú)顯著性差異（圖2-C）。斑馬魚的SV-BA距離，即SV和BA的間距，會(huì)在斑馬魚心臟受到影響后，隨心房和心室位置的改變而改變，而在本實(shí)驗(yàn)中，各組SV-BA間距無(wú)顯著性差異（圖2-B、C）。然而，0.06、0.09 μg/mL組的節(jié)間血管新生缺失且雜亂、斷裂（圖2-D），同時(shí)節(jié)間血管數(shù)下降且與對(duì)照組存在顯著性差異（＜0.01，圖2-C）。

3.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)重樓皂苷I抗血管新生的作用機(jī)制

3.3.1 活性靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及抗血管新生靶點(diǎn)獲取 重樓皂苷I在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)中共預(yù)測(cè)得靶點(diǎn)基因208個(gè)，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)抗血管新生相關(guān)靶點(diǎn)共237個(gè)，將二者取交集所得重樓皂苷I發(fā)揮抗血管新生活性的24個(gè)潛在靶點(diǎn)基因（圖3-A）。將篩選基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)，選取置信度＞0.4的蛋白互作關(guān)系數(shù)據(jù)并通過(guò)Cytoscape 3.7.2構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，得到度值前10位的關(guān)鍵靶點(diǎn)VEGFA、mTOR、SRC、EGFR、JUN、CASP3、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、ERBB2、CXCR4、FGF2（圖3-B）。

3.3.2 GO功能與KEGG通路分析 使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并利用微生信平臺(tái)進(jìn)行可視化分析（圖3-C、D）。

3.3.3 qRT-PCR驗(yàn)證 如圖4所示，與對(duì)照組比較，0.06、0.09 μg/mL重樓皂苷I組、、、、、和mRNA表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；0.09 μg/mL組mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）。

A-重樓皂苷I對(duì)斑馬魚肝臟影響的表型觀察 B-重樓皂苷I對(duì)斑馬魚心臟影響的表型觀察 C-重樓皂苷I對(duì)斑馬魚SV-BA間距、肝面積和節(jié)間血管數(shù)的影響 D-重樓皂苷I對(duì)斑馬魚節(jié)間血管的影響

A-重樓皂苷I成分與抗血管新生靶點(diǎn)取交集 B-交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 C-重樓皂苷I抗血管新生關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO分析 D-重樓皂苷I抗血管新生關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG分析

圖4 qRT-PCR驗(yàn)證基因表達(dá)情況

4 討論

近年來(lái)，斑馬魚因其在基因組序列、信號(hào)通路、細(xì)胞分子機(jī)制方面與哺乳動(dòng)物（包括人類）存在較高的一致性的顯著優(yōu)勢(shì)使其廣泛被應(yīng)用于中藥藥效及安全性評(píng)價(jià)中。此外，斑馬魚生命周期的短暫性、胚胎發(fā)育的透明性、發(fā)育階段的明確性等優(yōu)勢(shì)能夠?yàn)閺?fù)雜化學(xué)體系中藥的多生物效應(yīng)提供準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)終點(diǎn)[19-20]?；诖?，本實(shí)驗(yàn)以斑馬魚胚胎為模型，系統(tǒng)評(píng)價(jià)了重樓皂苷I的發(fā)育毒性及抗血管新生活性，以期為重樓的臨床安全使用以及其他毒性中藥的綜合評(píng)價(jià)提供參考。

安全性評(píng)價(jià)結(jié)果表明，在一定條件下（0.16 μg/mL）的重樓皂苷I暴露確實(shí)能夠引起幼魚出現(xiàn)明顯的毒性表型特征，同時(shí)主要能夠引起肝細(xì)胞凋亡、脂肪變性及部分生活功能指標(biāo)顯著異常等，與前期課題組的研究結(jié)果一致。然而，在較低質(zhì)量濃度暴露條件下，重樓皂苷I不會(huì)引起斑馬魚肝臟和心臟表型出現(xiàn)明顯變化，卻能夠顯著抑制斑馬魚節(jié)間血管新生。本研究采用斑馬魚模型成功地對(duì)重樓皂苷I的“安全性-有效性”進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)，證明了斑馬魚在多生物學(xué)事件綜合評(píng)價(jià)中的顯著優(yōu)勢(shì)，也為其他毒性中藥的綜合評(píng)價(jià)提供了思路。

基于此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和qRT-PCR技術(shù)對(duì)重樓皂苷I抗血管新生機(jī)制做進(jìn)一步探討，發(fā)現(xiàn)重樓皂苷I的抗血管生成活性可能與VEGFA、EGFR、FGF2、JUN、CASP3等10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。GO生物功能分析結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖、細(xì)胞信號(hào)調(diào)控、化學(xué)刺激等可能為重樓皂苷I抗血管新生的關(guān)鍵生物過(guò)程，涉及催化活性、受體結(jié)合等階段。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，重樓皂苷I可作用于EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等通路，影響血管新生相關(guān)疾病發(fā)展過(guò)程。EGFR可抑制EGFR酪氨酸激酶活性，阻斷EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]；VEGF能促進(jìn)血管通透性增加，其表達(dá)水平與原發(fā)腫瘤的大小、血管生成、淋巴管轉(zhuǎn)移等多種因素呈正相關(guān)[22]，其中VEGFA在腫瘤新生血管的生成中發(fā)揮主導(dǎo)作用，其與內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管通透性增加等密切相關(guān)[23]；mTOR信號(hào)通路下游為促血管生成性缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α），抑制mTOR表達(dá)有利于下調(diào)HIF-1α，進(jìn)而發(fā)揮抗血管新生作用[24]；SRC信號(hào)傳導(dǎo)的激活通過(guò)上調(diào)各種腫瘤中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)促血管生成分子來(lái)促進(jìn)血管生成[25]；凋亡性的Caspase具有特有的半胱氨酸酶活性，啟動(dòng)者Caspase被激活，其他的執(zhí)行者Caspase，包括CASP3可以降解細(xì)胞成分并產(chǎn)生凋亡[26]；ERBB2為抗EGFR單克隆抗體的的生物標(biāo)志物，研究表明ERBB2抑制劑在不同類型的腫瘤細(xì)胞中下調(diào)血管生成生長(zhǎng)因子的表達(dá)或使抗血管生成因子上調(diào)[27]。CXCR4是一種G蛋白偶聯(lián)受體，在缺氧、應(yīng)激、損傷、損傷血管組織時(shí)表達(dá)上調(diào)[28]。FGF可以促進(jìn)新生血管生成，為腫瘤生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，在FGFR配體中，F(xiàn)GF2已被報(bào)道具有促血管新生作用，能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移[29]。以上說(shuō)明，重樓皂苷I可能是通過(guò)上述通路及作用靶點(diǎn)發(fā)揮抗血管新生作用，從而阻止疾病進(jìn)一步發(fā)展。

綜上，本研究以重樓皂苷I為例，首次利用斑馬魚對(duì)其安全性和抗血管生成活性進(jìn)行統(tǒng)一評(píng)價(jià)，證實(shí)了科學(xué)合理使用藥物，在發(fā)揮藥效的同時(shí)不會(huì)造成明顯的不良反應(yīng)。此外，本研究推測(cè)，重樓皂苷I發(fā)揮抗血管新生活性，其潛在機(jī)制可能與EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性信號(hào)通路等相關(guān)。為重樓皂苷I的臨床用藥安全及開發(fā)利用提供了思路，同時(shí)也為其他毒性中藥的“有效性-安全性”綜合評(píng)價(jià)提供了參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 孫星, 李承祥, 陳揚(yáng)揚(yáng), 等. 重樓皂苷I在大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎中的治療作用 [J]. 醫(yī)藥論壇雜志, 2021, 42(4): 32-35.

[2] Wang Q, Zhou X, Zhao Y,. Polyphyllin I ameliorates collagen-induced arthritis by suppressing the inflammation response in macrophages through the NF-κB pathway [J]., 2018, 9: 2091.

[3] Lai L, Shen Q, Wang Y,. Polyphyllin I reverses the resistance of osimertinib in non-small cell lung cancer cell through regulation of PI3K/Akt signaling [J]., 2021, 419: 115518.

[4] 王奇颯, 孫東杰, 何黎, 等. 重樓總皂苷及不同皂苷成分對(duì)痤瘡相關(guān)病原菌抑菌效果的評(píng)價(jià) [J]. 中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志, 2016, 30(9): 899-901.

[5] Huang R Z, Shu J, Dai X Q,. The protective effect of polyphyllin I on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats [J]., 2020, 8(10): 644.

[6] Li Z Q, Fan Q Q, Chen M L,. The interaction between polyphyllin I and SQLE protein induces hepatotoxicity through SREBP-2/HMGCR/SQLE/LSS pathway [J]., 2023, 13(1): 39-54.

[7] 李芝奇, 陳美琳, 郭思敏, 等. 基于斑馬魚模型結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究重樓肝毒性機(jī)制[J]. 世界中醫(yī)藥, 2023, 18(6): 739-747.

[8] 陳清, 閻姝. 重樓的藥理作用及其毒性反應(yīng)的研究進(jìn)展 [J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2012, 31(7): 886-888.

[9] 沈放, 楊黎江, 彭永芳, 等. 重樓皂苷類化合物體外抗生育功效研究 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2010, 27(11): 961-964.

[10] 朱宗萍, 王繼森, 廖婉, 等. 基于模式生物斑馬魚研究姜黃抗血管新生的作用及機(jī)制 [J]. 中草藥, 2021, 52(11): 3257-3268.

[11] Nanda A, St Croix B. Tumor endothelial markers: New targets for cancer therapy [J]., 2004, 16(1): 44-49.

[12] Russo M, Giavazzi R. Anti-angiogenesis for cancer: Current status and prospects [J]., 2018, 164(Suppl 1): S3-S6.

[13] Howe K, Clark M D, Torroja C F,. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome [J]., 2013, 496(7446): 498-503.

[14] 李紅燕, 謝倩, 王成, 等. 斑馬魚在藥物毒理學(xué)評(píng)估中應(yīng)用及機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2021, 52(1): 278-288.

[15] 范琦琦, 李芝奇, 陳美琳, 等. 基于斑馬魚模型的吳茱萸提取物肝毒性評(píng)價(jià) [J]. 中草藥, 2022, 53(6): 1768-1775.

[16] 趙崇軍, 田敬歡, 王金鳳, 等. 斑馬魚在中藥研究中的應(yīng)用進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2015, 46(17): 2635-2648.

[17] Westerf Ield M.[M]. Eugene: University of Oregon Press, 1995.

[18] Li Z, Tang Y, Liu Z,. Hepatotoxicity induced by PPⅥ and PPⅦ in zebrafish were related to the cholesterol disorder [J]., 2022, 95: 153787.

[19] Cao Z, Huang Y, Xiao J,. Exposure to diclofop-methyl induces cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos [J]., 2020, 259: 113926.

[20] 范琦琦, 李芝奇, 陳美琳, 等. 基于斑馬魚模型的中藥安全性評(píng)價(jià)研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2022, 53(1): 278-287.

[21] Losanno T, Rossi A, Maione P,. Anti-EGFR and antiangiogenic monoclonal antibodies in metastatic non-small-cell lung cancer [J]., 2016, 16(6): 747-758.

[22] Maehara Y, Kabashima A, Koga T,. Vascular invasion and potential for tumor angiogenesis and metastasis in gastric carcinoma [J]., 2000, 128(3): 408-416.

[23] Melincovici C S, Bo?ca A B, ?u?man S,. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-key factor in normal and pathological angiogenesis [J]., 2018, 59(2): 455-467.

[24] Li W X, Yan J, Tian H,. A platinum@polymer-catechol nanobraker enables radio-immunotherapy for crippling melanoma tumorigenesis, angiogenesis, and radioresistance [J]., 2022, 22: 34-46.

[25] Tao X, Yin L, Xu L,. Dioscin: A diverse acting natural compound with therapeutic potential in metabolic diseases, cancer, inflammation and infections [J]., 2018, 137: 259-269.

[26] 郭帥, 黃藍(lán)萱, 賀高樂, 等. 兔單側(cè)椎動(dòng)脈結(jié)扎致頸髓急性缺血改變的研究 [J]. 中國(guó)脊柱脊髓雜志, 2018, 28(6): 541-551.

[27] Petit A M, Rak J, Hung M C,. Neutralizing antibodies against epidermal growth factor and ErbB-2/neu receptor tyrosine kinases down-regulate vascular endothelial growth factor production by tumor cellsand: Angiogenic implications for signal transduction therapy of solid tumors [J]., 1997, 151(6): 1523-1530.

[28] Marchese A, Benovic J L. Agonist-promoted ubiquitination of the G protein-coupled receptor CXCR4 mediates lysosomal sorting [J]., 2001, 276(49): 45509-45512.

[29] Giacomini A, Chiodelli P, Matarazzo S,. Blocking the FGF/FGFR system as a?“two-compartment” antiangiogenic/ antitumor approach in cancer therapy [J]., 2016, 107: 172-185.

Developmental toxicity, anti-angiogenesis activity and mechanism of polyphyllin I on zebrafish

WANG Xuan, CHEN Lin-zhen, LIN Rui-chao, CHEN Mei-lin, FAN Qi-qi, LI Zhi-qi, ZHAO Chong-jun, LI Xiang-ri

Beijing Key Laboratory for Quality Evaluation of Chinese Materia Medica/Chinese Medicine Processing Research Center, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

To study the developmental toxicity and anti-angiogenesis of polyphyllin I based on the model organism zebrafish, and explore the anti-angiogenesis mechanism of polyphyllin I by network pharmacology.The zebrafish embryos 6 h post fertilization (6 hpf) were exposed to different concentrations of polyphyllin I for 96 h. The lethal curve of polyphyllin I on zebrafish embryos was confirmed at the end of the experiment, and 20% lethal concentration (LC20) was calculated. At the end point of the experiment, the developmental toxicity of polyphyllin I and its related target organ toxicity were comprehensively evaluated by the number of spontaneous twitches of zebrafish, the heart rate of 96 hpf, the liver area of zebrafish, the distance between venous sinus and arterial bulb, the contents of total cholesterol (T-CHO), triglyceride (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), and the observation of acridine orange and oil red O staining. Under the safe dose condition, effect of polyphyllin I on related target organs was evaluated by the liver area of zebrafish and the distance between venous sinus and arterial bulb, and effect of polyphyllin I on growth of zebrafish internode vessels was evaluated by the number of internode vessels. The mechanism of polyphyllin I against angiogenesis was predicted based on network pharmacology and verified by qRT-PCR technology.The lethal curve of polyphyllin I on zebrafish embryos was= 270－23.62, LC20was 0.16 μg/mL. The end point of the experiment under the sublethal concentration exposure, 0.16 μg/mL polyphyllin I showed obvious toxic characteristics such as delayed absorption of yolk sac, curvature of spine and tail distortion in larvae zebrafish, and the contents of T-CHO, TG and LDL-C were significantly increased (< 0.05, 0.01). Acridine orange and oil red O staining showed that 0.16 μg/mL polyphyllin I could induce liver cell apoptosis and steatosis. Compared with control group at safe dose, 0.06, 0.09 μg/mL polyphyllin I had no significant effects on main organs, but could inhibit the number of internode vessels (< 0.01). Network pharmacology prediction found that polyphyllin I could regulate the resistance of epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitors and other related signaling pathways by regulating vascular endothelial growth factor A (VEGFA), mammalian target of rapamycin (mTOR), steroid receptor coactivator (SRC), EGFR and other key targets, so as to play the role of anti-angiogenesis. The results of qRT-PCR experiment confirmed the above targets.Excessive dosage of polyphyllin I can cause developmental toxicity of zebrafish embryos. Under safe dose conditions, polyphyllin I exerts significant anti-angiogenesis activity by regulating EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance and other related pathways. This study provided a way of thinking for the safety and development of clinical drug use of polyphyllin I, and also provided a reference for the comprehensive evaluation of “efficacy-safety” of toxic traditional Chinese medicine.

polyphyllin I; zebrafish; developmental toxicity; anti-angiogenesis; vascular endothelial growth factor A; mammalian target of rapamycin; steroid receptor coactivator; epidermal growth factor receptor

R285.5

A

0253 - 2670(2023)14 - 4548 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.015

2023-02-01

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82204753）；國(guó)家中藥標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目（ZYBZH-Y-YN-44）

王 璇（2000—），碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幇踩栽u(píng)價(jià)及主要活性/毒性物質(zhì)基礎(chǔ)篩選。E-mail: wangxuan9962@163.com

趙崇軍（1988—），博士，助理研究員，研究方向?yàn)橹兴幇踩栽u(píng)價(jià)及主要活性/毒性物質(zhì)基礎(chǔ)篩選。E-mail: 1014256537@qq.com

李向日（1972—），博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幣谥啤①|(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。E-mail: lixiangri@sina.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]