玉泉馨 楊宗桃 張 海 程光遠(yuǎn) 周營栓 焦文迪 曾 康 羅廷緒 黃國強(qiáng) 張木清 徐景升,*

甘蔗VAMP相關(guān)蛋白ScPVA12與甘蔗花葉病毒P3N-PIPO的互作研究

玉泉馨1楊宗桃1張 海1程光遠(yuǎn)1周營栓1焦文迪1曾 康1羅廷緒1黃國強(qiáng)1張木清2,*徐景升1,*

1福建農(nóng)林大學(xué) / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 國家甘蔗工程技術(shù)研究中心 / 教育部作物遺傳育種與綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建福州 350002;2廣西大學(xué)廣西甘蔗生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西南寧 530004

植物囊泡膜蛋白相關(guān)蛋白PVA12 (plant vesicle-associated membrane protein (VAMP)-associated proteins homolog 12)屬于VAP27家族蛋白, 在細(xì)胞中介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡運(yùn)輸以及膜融合。甘蔗(spp. hybrid) PVA12應(yīng)答甘蔗花葉病毒(, SCMV)侵染尚未見報(bào)道。本研究從栽培種新臺(tái)糖22號(hào)(ROC22)中克隆了PVA12基因, 命名為。該基因開放讀碼框(open reading frame, ORF)的長(zhǎng)度為735 bp, 其編碼長(zhǎng)度為244 aa的蛋白。生物信息學(xué)分析表明, ScPVA12是一種不穩(wěn)定的親水性脂溶蛋白, C端具有跨膜結(jié)構(gòu)域; 二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占比最高; 進(jìn)化樹分析表明, 該蛋白在單子葉和雙子葉植物中存在明顯分化。酵母雙雜交(yeast two-hybrid, Y2H)和雙分子熒光互補(bǔ)(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)試驗(yàn)表明, ScPVA12與SCMV-P3N-PIPO蛋白互作。亞細(xì)胞定位試驗(yàn)表明ScPVA12定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。共定位試驗(yàn)表明ScPVA12與SCMV-P3N-PIPO共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn),基因在甘蔗各組織中均有表達(dá), 在第8節(jié)間中的表達(dá)量最低, 在正七葉中的表達(dá)量最高; SCMV侵染對(duì)基因表達(dá)影響顯著, 在SCMV脅迫下基因先下調(diào)表達(dá), 后期恢復(fù)正常水平。

PVA12; 甘蔗花葉病毒; P3N-PIPO; 蛋白互作

甘蔗是我國乃至世界上最重要的糖料作物和經(jīng)濟(jì)作物[1-3], 同時(shí)甘蔗產(chǎn)業(yè)也是我國重要的產(chǎn)業(yè)之一[4-5]。甘蔗花葉病在我國各大甘蔗產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生, 對(duì)甘蔗生產(chǎn)危害嚴(yán)重[6-9]。感染甘蔗花葉病的甘蔗植株主要表現(xiàn)為植株矮化、生長(zhǎng)遲緩、糖分降低、分蘗減少等, 嚴(yán)重影響甘蔗的產(chǎn)量和品質(zhì), 發(fā)病嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)高達(dá)50%[10-11], 對(duì)甘蔗生產(chǎn)產(chǎn)生了嚴(yán)重威脅[12-16]。甘蔗花葉病病原的蟲媒主要是蚜蟲, 蚜蟲吸取帶病蔗株的汁液后, 以非持久的方式將病毒傳播到健康植株[17-18]。在生產(chǎn)中, 帶毒甘蔗種莖是甘蔗花葉病在田間傳播和擴(kuò)散的主要途徑。因此, 培育和使用抗病品種是防治甘蔗花葉病的根本手段。甘蔗花葉病的病原主要為甘蔗花葉病毒(, SCMV)、甘蔗條紋花葉病毒(, SCSMV)和高粱花葉病毒(, SrMV)[19-20], 且SCMV依然是全世界各大蔗區(qū)的主要病原[16,21-23]。SCMV屬于馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(), 由正義單鏈RNA組成, 編碼2個(gè)多聚蛋白, 并最終水解成11個(gè)成熟蛋白, 這11個(gè)蛋白從N端到C端分別為P1、HC-Pro、P3、P3N-PIPO、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb和CP[7,17,20,26-27]。其中, P3N-PIPO是在P3順反子GAAAAAA插入1個(gè)A, 移碼編碼產(chǎn)生的融合蛋白, 是potyviruses的運(yùn)動(dòng)蛋白(movement proteins, MP), 定位在質(zhì)膜和胞間連絲(plasmodesmata, PD), 其中主要定位在質(zhì)膜[28]。病毒通過在寄主體內(nèi)組裝病毒復(fù)制復(fù)合體(virus replication complex, VRC)進(jìn)行復(fù)制, 運(yùn)動(dòng)蛋白能夠?qū)RC移動(dòng)至PD[29], 并且能夠修飾PD的結(jié)構(gòu), 擴(kuò)大其分子擴(kuò)散極限(size exclusion limit, SEL), 增加其通透性, 使病毒得以通過細(xì)胞壁侵染相鄰細(xì)胞建立系統(tǒng)性侵染[30-31]。運(yùn)動(dòng)蛋白介導(dǎo)的VRC的胞內(nèi)和胞間運(yùn)動(dòng)對(duì)病毒建立系統(tǒng)性侵染的至關(guān)重要[10,18,32-34]。

植物病毒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單, 必須依賴于與寄主因子的互作才能建立系統(tǒng)性侵染[35]。分離鑒定與病毒互作的寄主因子基因?qū)τ陉U明病毒的侵染機(jī)制、選育抗病品種具有重要意義[36]。本課題組以SCMV-P3N- PIPO為誘餌, 篩選甘蔗cDNA酵母文庫, 獲得了與SCMV-P3N-PIPO互作的植物囊泡膜蛋白相關(guān)蛋白PVA12 (plant vesicle-associated membrane protein (VAMP)-associated proteins homolog 12), 并從甘蔗品種ROC22中克隆了其編碼基因, 命名為。PVA12是動(dòng)物VAP33 (VAMP-associated protein of 33 kD)在植物中的10個(gè)同源物之一[37], 在植物中最早發(fā)現(xiàn)的VAP蛋白分子量為27 kD, 因此將植物VAP蛋白家族命名為VAP27 (VAMP-associated protein 27)[38]。近期有文獻(xiàn)將植物VAP27蛋白家族的10個(gè)成員重新按VAP27-1至VAP27-10編號(hào)命名, 其中VAP27-3與PVA12為同一蛋白的不同命名(TAIR網(wǎng)站登錄號(hào)同為AT2G45140), 2種命名均沿用至今[37,39-43]。

PVA12屬于VAP27蛋白家族, 又名為VAP27-3, 是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)定位蛋白[37]。VAP27蛋白廣泛存在于真核生物中, 在哺乳動(dòng)物、酵母和植物中均有VAP27蛋白的相關(guān)報(bào)道[44-45]。該家族蛋白高度保守的主精子結(jié)構(gòu)域(major sperm domain, MSD)是VAP27蛋白與其他蛋白發(fā)生相互作用的必要功能結(jié)構(gòu)域, 還具有典型的螺旋卷曲結(jié)構(gòu)域(coiled-coil domain, CCD)結(jié)構(gòu)域和C端跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain, TMD), 其氨基酸殘基高度保守。VAP27蛋白在植物體內(nèi)各組織中普遍表達(dá), 在細(xì)胞中介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡運(yùn)輸以及膜融合, 在細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)運(yùn)輸以及液泡的形成中扮演重要

角色[37,42,46-47]。VAP27蛋白在細(xì)胞中與多種不同蛋白互作[43,45], 與其他蛋白共同參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的脂質(zhì)運(yùn)輸[37]、液泡的生物合成[46]、維持內(nèi)吞作用的穩(wěn)態(tài)[48-49]以及調(diào)控自噬體的形成[50], 對(duì)植物細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用。此外VAP27蛋白還是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)–質(zhì)膜結(jié)合位點(diǎn)(ER-plasma membrane (PM) contact sites, EPCSs)復(fù)合體的重要組分之一, 參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜之間的物質(zhì)運(yùn)輸[37,43], VAP27蛋白的缺失會(huì)使植物表現(xiàn)出內(nèi)吞作用延遲、影響內(nèi)吞膜的穩(wěn)態(tài), 還會(huì)出現(xiàn)根系表型異常[43,51], 表明VAP27蛋白參與維持植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。近期有研究發(fā)現(xiàn)VAP27蛋白還可能參與了植物病毒在寄主體內(nèi)的侵染[52-53]。

甘蔗中PVA12與SCMV-P3N-PIPO互作尚屬首次發(fā)現(xiàn), 深入研究其互作機(jī)制, 對(duì)于闡明SCMV復(fù)制囊泡形成、胞內(nèi)運(yùn)輸及胞間移動(dòng)分子機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。本研究通過酵母雙雜交(yeast two- hybrid, Y2H)和雙分子熒光互補(bǔ)(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)試驗(yàn)體系驗(yàn)證了ScPVA12與SCMV-P3N-PIPO的互作, 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real Time Quantitative PCR, RT-qPCR)分析了基因在甘蔗不同組織中的表達(dá)情況以及應(yīng)答SCMV侵染的表達(dá)模式。

1 材料與方法

1.1 材料及處理方法

本試驗(yàn)所使用的甘蔗栽培種ROC22組培苗、SCMV-FZ1病毒株系[24]和本氏煙()由福建農(nóng)林大學(xué)國家甘蔗工程技術(shù)研究中心提供。在光周期為16 h光照/8 h暗, 光照強(qiáng)度為200 μmol m–2s–1, 溫度28℃, 空氣濕度60%的條件下, 采用腋芽快繁技術(shù)培養(yǎng)ROC22組培苗。待其出現(xiàn)4～5片完全展開的葉片時(shí), 挑選健壯且長(zhǎng)勢(shì)一致的組培苗在光培養(yǎng)期培養(yǎng)1 h后摩擦接種SCMV, 設(shè)置3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)3株, 使用磷酸緩沖液(pH 7.0)摩擦接種的植株作為對(duì)照, 取接種葉片, 使用基因特異性引物(表1)檢測(cè)接種成功與否。在接種后0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h、5 d、8 d、14 d取樣。從福建農(nóng)林大學(xué)隔離網(wǎng)室中選取處于伸長(zhǎng)期的、株高約1.8 m的健壯且長(zhǎng)勢(shì)一致ROC22植株, 取未成熟葉心葉、形態(tài)建成葉正一葉、漸衰葉正七葉、未成熟節(jié)間第3節(jié)間、形態(tài)建成節(jié)間第8節(jié)間和根用于基因的組織特異性表達(dá)試驗(yàn), 選取3株混合作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù), 設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。取樣后用錫箔紙包好后放入液氮中速凍, 然后置–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取和cDNA合成

在液氮中將采集的樣品充分研磨至粉末狀, 使用TRIzol (Invotrigen, 美國)試劑并按照其說明書提取總RNA, 使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取RNA質(zhì)量。利用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Vazyme, 中國)并按其說明書將提取的不同組織樣品RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3 ScPVA12基因克隆及生物信息學(xué)分析

以篩選酵母文庫獲得的基因序列為參考,通過同源克隆的方法, 在起始密碼子和終止密碼子附近設(shè)計(jì)基因的特異擴(kuò)增引物(表1)。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板, 使用PrimeSTAR GXL DNA polymerase (TaKaRa Bio, 日本)高保真, 克隆基因, 并送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

通過在線網(wǎng)站及分析軟件進(jìn)行生信分析, 包括蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析(https://web.expasy. org/protparam/)、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析(https://npsa- prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4. html)、蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(https://swissmodel. expasy.org/)、蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)(https://services. healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)和蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)(https://services.healthtech.dtu.dk/service. php?TMHMM-2.0)。通過NCBI網(wǎng)站(https://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)與Tair網(wǎng)站(https://www. arabidopsis.org/Blast/index.jsp)進(jìn)行BLAST比對(duì)獲得ScPVA12與其他物種的同源序列, 利用DNAMAN V6軟件對(duì)這些序列進(jìn)行同源性分析, 利用MEGA 7.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。通過NCBI網(wǎng)站的CD-Search工具h(yuǎn)ttps://www. ncbi.nlm.nih.gov/cdd/?term=)和SMART網(wǎng)站(http:// smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析預(yù)測(cè)。

1.4 ScPVA12的亞細(xì)胞定位

參照Cheng等[36]的方法, 利用Gateway方法構(gòu)建ScPVA12的亞細(xì)胞定位載體ScPVA12-YFP和P3N-PIPO的亞細(xì)胞定位載體P3N-PIPO-CFP, 使用農(nóng)桿菌GV3101進(jìn)行侵染。取健康的本氏煙植株, 參照Cheng等[36]農(nóng)桿菌侵染方法, 將帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌注射入健康的本氏煙葉片。48 h后在激光共聚焦顯微鏡(LeicaTCSSP5I)下觀察本氏煙葉片表皮細(xì)胞中ScPVA12蛋白的定位。用HDEL-RFP標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。YFP的激發(fā)光波長(zhǎng)為514 nm, 捕獲波長(zhǎng)為530～590 nm; RFP激發(fā)光波長(zhǎng)為552 nm, 捕獲波長(zhǎng)為590～630 nm; CFP的激發(fā)波長(zhǎng)為442 nm, 采集波長(zhǎng)為450～500 nm。采用數(shù)字采集圖像, 使用LSM 2.6.3軟件進(jìn)行處理。SCMV-P3N-PIPO-CFP載體來自本課題組前期研究工作[36]。

1.5 Y2H驗(yàn)證ScPVA12與SCMV-P3N-PIPO的互作

按照Cheng等[36]的方法構(gòu)建ScPVA12的誘餌載體pPR3-ScPVA12, 利用Y2H技術(shù)驗(yàn)證其與pBT-STE-P3N-PIPO的互作關(guān)系。使用酵母二缺培養(yǎng)基(DDO: 缺少亮氨酸和色氨酸的酵母合成限定基本培養(yǎng)基)和四缺培養(yǎng)基(QDO: 缺少亮氨酸、色氨酸、組氨酸和腺嘌呤的酵母合成限定基本培養(yǎng)基)培養(yǎng)共轉(zhuǎn)酵母菌株NMY51, 在平板培養(yǎng)基上添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)。以pTSU2- APP/pNubG-Fe65組合為陽性對(duì)照, 以pPR3-N/ pNubG-Fe65組合為陰性對(duì)照。pBT-STE-P3N-PIPO載體來自本課題組前期研究工作[36]。

1.6 BiFC驗(yàn)證ScPVA12與SCMV-P3N-PIPO的互作

參照Cheng等[36]的方法構(gòu)建YN-ScPVA12和ScPVA12-YC載體, 利用BiFC技術(shù)驗(yàn)證其與YN- SCMV-P3N-PIPO的互作。取健康的本氏煙植株, 參照Cheng等[36]農(nóng)桿菌侵染方法, 將帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌注射入健康的本氏煙葉片, 48 h后在激光共聚焦顯微鏡(LeicaTCSSP5I)下觀察。YFP的激發(fā)光波長(zhǎng)為514 nm, 捕獲波長(zhǎng)為530～590 nm; 葉綠體的的激發(fā)光波長(zhǎng)為552 nm, 捕獲波長(zhǎng)為650～680 nm。采用數(shù)字采集圖像, 使用LSM 2.6.3軟件進(jìn)行處理。YN-P3N-PIPO和P3N-PIPO-YC載體來自本課題組前期研究工作[36]。

1.7 ScPVA12基因的RT-qPCR表達(dá)分析

根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(表1), 以供試材料的cDNA為模板, 以基因和基因(表1)為內(nèi)參基因, 使用SYBR Green ProHS預(yù)混型qPCR試劑盒(含ROX,艾瑞科, 中國), 按其說明書配制反應(yīng)體系, 在7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI, USA)進(jìn)行RT-qPCR。每個(gè)樣品設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)和生物學(xué)重復(fù), 以DEPC處理的H2O作為對(duì)照, 采用2–ΔΔCt算法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量, 使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20對(duì)基因表達(dá)差異進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ScPVA12基因的克隆與生物信息學(xué)分析

經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序, 本研究從ROC22中克隆了1條開放讀碼框(open reading frame, ORF)長(zhǎng)度為735 bp的PVA12基因, 編碼長(zhǎng)度為244 aa的蛋白。將該基因命名為并提交GenBank, 登錄號(hào)為OP828637。ProtParam分析表明, ScPVA12蛋白分子式為C1178H1924N328O365S9, 分子量為26,810.75 kD; 該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為63.22, 為不穩(wěn)定蛋白; 脂溶指數(shù)為83.48, 且總體平均親水性為負(fù)值, 因此該蛋白可能是一種親水性脂溶蛋白; ScPVA12的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示, 該蛋白無規(guī)則卷曲、α螺旋和延伸鏈占比分別為50%、27.87%和22.13%; 信號(hào)肽預(yù)測(cè)表明, ScPVA12蛋白無信號(hào)肽, 屬于非分泌蛋白; 跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析表明, ScPVA12在C端具有一個(gè)TMD。ScPVA12與擬南芥AtVAP27-3 (Locus: AT2G45140)氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明他們的氨基酸序列長(zhǎng)度相近且序列保守。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明ScPVA12與AtVAP27-3都具有VAP27蛋白家族典型的MSD、CCD, 以及C端TMD, 表明ScPVA12屬于VAP27蛋白家族并且是VAP27-3的同源物(圖1)。

圖1 ScPVA12蛋白結(jié)構(gòu)域分析

A: ScPVA12與AtVAP27-3氨基酸比對(duì)結(jié)果(紅色標(biāo)記為MSD, 黃色標(biāo)記為CCD, 藍(lán)色標(biāo)記為TMD)。B: ScPVA12與AtVAP27-3結(jié)構(gòu)域示意圖(標(biāo)尺為250個(gè)氨基酸殘基)。

A: the amino acid comparison between ScPVA12 and AtVAP27-3 (The red marks indicate MSD, the orange marks indicate CCD, and the green marks indicate TMD. B: the schematic diagram of ScPVA12 and AtVAP27-3 domain (Ruler: 250 amino acids).

2.3 ScPVA12的氨基酸同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

通過NCBI網(wǎng)站的Blastp搜索PVA12的單子葉物種同源序列發(fā)現(xiàn), ScPVA12蛋白與高粱(, XP_002445075.1)、南荻(, CAD6266147.1)、玉米(, NP_ 001130606.1)、黍(, RLN03983.1)、谷子(, XP_004972806.1)、二穗短柄草(, XP_003573476.1)、野生二粒小麥(, XP_037458000.1)中的PVA12蛋白相似度分別為: 96%、97%、95%、93%、91%、86%、86%, 表明PVA12蛋白具有高度保守性(圖2)。

在NCBI網(wǎng)站檢索不同物種的已注釋的PVA12同源序列, 利用MEGA軟件的Neighbor Joining算法構(gòu)建PVA12的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。結(jié)果表明, 單子葉植物南荻()、玉米()、高粱()、彎葉畫眉草()、黍()、沼生菰()、稻()、短花藥野生稻()、二穗短柄草()、野生二粒小麥植物南荻()、玉米()、高粱()、彎葉畫眉草()、黍()、沼生菰()、稻(Group)、短花藥野生稻()、二穗短柄草()、野生二粒小麥()和大麥()組成群I, 雙子葉植物番木瓜()、擬南芥()、大豆()、可可()、溫州蜜柑()和開心果()組成群II。在單子葉植物群中又可以分為2個(gè)亞群, 分別為C4植物亞群(亞群I-1)和C3植物亞群(亞群II-2)。這說明在遺傳進(jìn)化上, PVA12蛋白在單子葉和雙子葉植物之間, 以及C3和C4植物之間存在明顯的分化。

圖2 甘蔗ScPVA12與其他單子葉植物PVA12蛋白的氨基酸序列比對(duì)

高粱: SbPVA12 (XP_002445075.1); 南荻: MlPVA12 (CAD6266147.1); 玉米: ZmPVA12 (NP_001130606.1); 黍: PmPVA12(RLN03983.1); 谷子: SiPVA12 (XP_004972806.1); 二穗短柄草: BdPVA12 (XP_003573476.1); 野生二粒小麥: TdPVA12 (XP_037458000.1)。

: SbPVA12 (XP_002445075.1);: MlPVA12 (CAD6266147.1);: ZmPVA12 (NP_001130606.1);: PmPVA12 (RLN03983.1);: SiPVA12 (XP_004972806.1);: BdPVA12 (XP_003573476.1);: TdPVA12 (XP_037458000.1).

圖3 ScPVA12與其他物種PVA12蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

群I為單子葉植物群, 其中亞群I-1為C4植物, 亞群群I-2為C3植物; 群II為雙子葉植物群。

Group I is monocot, in which I-1 is C4plant subgroup and I-2 is C3plant subgroup. Group II is a dicotyledonous group.

2.4 ScPVA12的亞細(xì)胞定位

前人報(bào)道PVA12為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白[37,53], 因此以HDEL-RFP作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記進(jìn)行亞細(xì)胞定位試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示, ScPVA12-YFP融合蛋白的黃色熒光信號(hào)(綠色偽彩)與HDEL-RFP融合蛋白的紅色熒光信號(hào)重合, 表明ScPVA12定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖4-A), 與文獻(xiàn)報(bào)道的酵母Scs2p和擬南芥AtPVA12的亞細(xì)胞定位結(jié)果相同[37,53]。將SCMV-P3N-PIPO-CFP、ScPVA12-YFP以及HDEL-RFP蛋白在健康的煙草葉片中表達(dá), ScPVA12-YFP與SCMV-P3N-PIPO-CFP融合蛋白的青色熒光蛋白信號(hào)重合, 表明SCMV- P3N-PIPO和ScPVA12具有共同定位。將3種融合蛋白的熒光信號(hào)進(jìn)行兩兩組合并使用偽彩進(jìn)行觀察(圖4-B), ScPVA12-YFP (綠色偽彩)和HDEL-RFP (紅色)組合的熒光信號(hào)重合, 表明ScPVA12定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng); ScPVA12-YFP (紅色偽彩)和P3N-PIPO-CFP (綠色偽彩)組合的熒光信號(hào)重合, 表明ScPVA12與P3N-PIPO具有共同定位; HDEL-RFP (紅色)和P3N-PIPO-CFP (綠色偽彩)組合的熒光信號(hào)重合, 表明在P3N-PIPO與ScPVA12在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上具有共定位。如圖4-B Merge中白色箭頭所示, SCMV-P3N-PIPO- CFP、ScPVA12-YFP和HDEL-RFP存在共定位。部分SCMV-P3N-PIPO可能受ScPVA12的影響改變了其原本在質(zhì)膜[36]上的定位。

圖4 ScPVA12-YFP在本氏煙表皮細(xì)胞中的定位

A: ScPVA12-YFP亞細(xì)胞定位; B: ScPVA12-YFP和SCMV-P3N-PIPO-CFP亞細(xì)胞共定位。將3種熒光蛋白信號(hào)進(jìn)行兩兩組合并使用偽彩進(jìn)行觀察共定位情況, 組合分別為ScPVA12-YFP (綠色偽彩)+HDEL-RFP (紅色)、ScPVA12-YFP (紅色偽彩)+P3N-PIPO-CFP (綠色偽彩)以及HDEL-RFP (紅色)+P3N-PIPO-CFP (綠色偽彩)。標(biāo)尺為25 μm。白色箭頭標(biāo)記共定位位置。

A: the subcellular localization of ScPVA12-YFP; B: the subcellular colocalization of ScPVA12-YFP with SCMV-P3N-PIPO-CFP. Pairwise combination of three fluorescent protein signals and observation of colocalization presented by using pseudo-color, and the combinations were ScPVA12-YFP (green pseudo-color)+HDEL-RFP (red pseudo-color), ScPVA12-YFP (red pseudo-color)+P3N-PIPO-CFP (green pseudo-color) and HDEL-RFP (red)+P3N-PIPO-CFP (green pseudo-color). Bar: 25 μm. The white arrow marks the location of colocalization.

2.5 ScPVA12與SCMV-P3N-PIPO的互作驗(yàn)證

Y2H試驗(yàn)結(jié)果表明, 試驗(yàn)組pPR3-ScPVA12/ pBT3-SET-P3N-PIPO與陽性對(duì)照pTSU2-APP/ pNubG-Fe65結(jié)果相似, 且在滴加X-Gal 8 h后肉眼可見菌落變藍(lán), 表明ScPVA12與SCMV-P3N-PIPO互作(圖5); BiFC試驗(yàn)結(jié)果表明, 共注射的組合ScPVA12-YC與YN-P3N-PIPO、組合YN-ScPVA12與P3N-PIPO-YC都分別產(chǎn)生黃色熒光信號(hào)(圖6), 進(jìn)一步證明了SCMV-P3N-PIPO與ScPVA12互作。此外, 在BiFC試驗(yàn)中, 2種蛋白互作產(chǎn)生的熒光信號(hào)具有明顯的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。

2.6 ScPVA12基因的組織特異性表達(dá)及應(yīng)答SCMV侵染的表達(dá)模式

熒光定量PCR結(jié)果表明,基因在不同組織的表達(dá)量具有差異性?；蛟谌~片中的表達(dá)量高于莖和根, 其中正七葉的表達(dá)量最高; 正一葉和心葉, 第3節(jié)間、第8節(jié)間和根的表達(dá)量較低, 其中第8節(jié)間的表達(dá)量最低(圖7)。

使用基因特異性引物(表1)檢測(cè)SCMV接種甘蔗ROC22組培苗葉片, 擴(kuò)增出目的片段, 表明接種成功。熒光定量PCR結(jié)果表明, SCMV侵染對(duì)基因表達(dá)影響顯著, 與ROC22葉片接種SCMV 0 h的對(duì)照相比,表達(dá)量總體上呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢(shì)。接種SCMV 1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h時(shí),表達(dá)量下調(diào), 在接種1 h時(shí)表達(dá)量顯著下調(diào); 在接種5 d、8 d、14 d時(shí),表達(dá)量逐漸恢復(fù)到SCMV侵染前的表達(dá)水平(圖8)。

圖5 Y2H檢測(cè)ScPVA12與SCMV-P3N-PIPO的互作

pTSU2-APP/pNubG-Fe65為陽性對(duì)照, pPR3-N/pNubG-Fe65為陰性對(duì)照。DDO+X-Gal: 添加了5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的缺少亮氨酸(Leu)和色氨酸(Trp)的酵母合成限定基本培養(yǎng)基; QDO+X-Gal: 添加了X-Gal的缺少亮氨酸(Leu)、色氨酸(Trp)、組氨酸(His)和腺嘌呤(Ade)的酵母合成限定基本培養(yǎng)基。

The positive and negative controls are yeast cotransformants with pNubG-Fe65 plus pTSU2-APP and pNubG-Fe65 plus pPR3-N, respectively. DDO+X-Gal: synthetic defined yeast minimal medium lacking Leu and Trp with the treatment of 5-Bromo-4Chlor-3-Indoly1 β-D-Galactopyranoside; QDO+X-Gal: synthetic defined yeast minimal medium lacking Leu, Trp, His, and Ade but plus the X-Gal.

圖6 BiFC檢測(cè)ScPVA12與SCMV-P3N-PIPO的互作

A: YN融合于ScPVA12的N末端, YC融合于SCMV-P3N-PIPO的C末端; B: YC融合于ScPVA12的C末端, YN融合于SCMV-P3N-PIPO的N末端。將YN-ScPVA12和P3N-PIPO-YC (A)、YN-P3N-PIPO和ScPVA12-YC (B)分別共注射到本氏煙葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá), 48 h后激光共聚焦觀察。標(biāo)尺為25 μm。白色箭頭標(biāo)記呈點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)的熒光信號(hào)。

A: the N-terminal half of YFP was fused to the N-terminal of ScPVA12 to generate YN-ScPVA12, while the C-terminal half of YFP was fused to the C-terminal of SCMV-P3N-PIPO to generate P3N-PIPO-YC; B: the C-terminal half of YFP was fused to the C-terminal of ScPVA12 to generate ScPVA12-YC, while the N-terminal half of YFP was fused to the N-terminal of SCMV-P3N-PIPO to generate YN-P3N-PIPO. Plasmids combination of YN-ScPVA12 plus P3N-PIPO-YC (A), YN-P3N-PIPO plus ScPVA12-YC (B) were individually co-injected into N. benthamiana leaves for transient expression. The fluorescent signal was monitored by confocal microscopy at 48 hours post infiltration. Bar: 25 μm. The white arrow marks the fluorescent signal with a dotted structure.

圖7 ScPVA12基因在甘蔗不同組織中的表達(dá)模式

誤差線為每組處理的標(biāo)準(zhǔn)誤差(= 3)。柱上不同的小寫字母表示在< 0.05差異顯著。

The error bars represent the standard error of each treating group (= 3). Bars super-scripted by different lowercase letters are significantly different at< 0.05.

圖8 ScPVA12基因應(yīng)答SCMV侵染的表達(dá)模式

誤差線為每組處理的標(biāo)準(zhǔn)誤差(= 3)。柱上不同的小寫字母表示在< 0.05差異顯著。

The error bars represent the standard error of each treating group (= 3). Bars super-scripted by different lowercase letters are significantly different at< 0.05.

3 討論

植物病毒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單, 必須依賴于與寄主因子的互作才能建立系統(tǒng)性侵染[24,35,54]。本研究的Y2H和BiFC試驗(yàn)表明ScPVA12與SCMV-P3N-PIPO互作, 說明ScPVA12參與了SCMV的侵染進(jìn)程。病毒在寄主體內(nèi)的復(fù)制是其建立系統(tǒng)性侵染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,寄主體內(nèi)的脂質(zhì)和亞細(xì)胞膜對(duì)病毒VRC的組裝和復(fù)制至關(guān)重要[53,55]。病毒VRC的組裝和積累依賴于細(xì)胞器膜上的蛋白質(zhì)和脂類[56-59]。甾醇是重要的膜組分[60], 研究表明, 在酵母中甾醇特異在病毒復(fù)制位點(diǎn)富集, 并能刺激病毒的復(fù)制與積累[53]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)折疊加工和脂質(zhì)合成的場(chǎng)所, 病毒可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上利用脂質(zhì)進(jìn)行VRC的組裝[53], 有文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是侵染玉米的SCMV的重要復(fù)制場(chǎng)所[61]。甾醇的轉(zhuǎn)運(yùn)主要通過氧化甾醇結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白(oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins, ORPs)進(jìn)行[37,56-59,62]。ORP是重要的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(lipid transfer protein, LTP), 通過其特有的ORD結(jié)構(gòu)域招募和結(jié)合甾醇類脂類[37,56-59,62]。ORP3a能夠特異結(jié)合谷甾醇[37,53], 而谷甾醇是質(zhì)膜和PD的主要甾醇組分[60]。VAP27蛋白通過與ORP3a互作將后者定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并招募甾醇, 參與脂類運(yùn)輸和代謝, 阻礙VAP27與ORP3a的互作, ORP3a失去內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位[37]。因此, VAP27蛋白被認(rèn)為是VRC在膜上組裝的錨定蛋白, 通過間接招募甾醇促進(jìn)病毒復(fù)制和侵染[53,63]。為此, 我們推測(cè)SCMV-P3N-PIPO與ScPVA12互作對(duì)SCMV侵染具有重要的生物學(xué)意義, 一方面通過ScPVA12與ORP3a互作間接招募谷甾醇,便于VRC的形成, 促進(jìn)病毒復(fù)制; 另一方面, 將SCMV-P3N-PIPO定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng), 便于其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)進(jìn)一步的正確折疊修飾并通過細(xì)胞質(zhì)被膜復(fù)合體II (coat protein complex II, COPII)途徑進(jìn)行胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。

膜結(jié)合位點(diǎn)(membrane contact site, MCS)是重要的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu), MCS在脂質(zhì)翻轉(zhuǎn)和轉(zhuǎn)運(yùn)中具有重要作用, 除了參與病毒的復(fù)制, 還參與了病毒的胞間移動(dòng)[62,64]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和質(zhì)膜之間可以形成EPCS, VAP27是EPCS的重要組分, Wang等認(rèn)為VAP27與ORP互作形成的復(fù)合體介導(dǎo)了氧化甾醇的轉(zhuǎn)運(yùn)[37,62-64]。病毒的胞間移動(dòng)是以囊泡形式進(jìn)行的[65-66]。SCMV-P3N-PIPO與ScPVA12互作, 很可能通過后者與ORP3a互作賦予囊泡特殊的甾醇組分并使病毒囊泡定位于EPCS或PD。本課題組前期研究表明SCMV-P3N-PIPO定位在質(zhì)膜和PD[36], 本研究的共定位試驗(yàn)表明SCMV-P3N-PIPO、ScPVA12和HDEL-RFP可以共定位(圖4), 且在BiFC試驗(yàn)中SCMV-P3N-PIPO和ScPVA12互作的熒光信號(hào)呈現(xiàn)點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)(圖6), 說明它們可能定位于EPCS。有文獻(xiàn)表明EPCS與PD共定位[43], PD富含鞘脂和甾醇[60], 而攜帶與PD相同的脂類的囊泡則更容易通過PD移動(dòng)到相鄰細(xì)胞。明確SCMV-P3N-PIPO和ScPVA12互作的EPCS定位對(duì)于深入研究其在病毒侵染中的作用具有重要生物學(xué)意義, 因此后續(xù)我們將克隆EPCS的標(biāo)記蛋白NET3C的編碼基因, 驗(yàn)證ScPVA12與SCMV-P3N-PIPO是否互作于在EPCS。

病毒在寄主細(xì)胞中的復(fù)制會(huì)引起植物的防御反應(yīng), 這可能會(huì)影響寄主正常的代謝和激素信號(hào), 并導(dǎo)致發(fā)育和形態(tài)異常, 甚至導(dǎo)致局部和系統(tǒng)性細(xì)胞死亡反應(yīng)[67-68]。前人的試驗(yàn)表明PVA12具有促進(jìn)病毒組裝VRC的作用[53], 但是在本研究的應(yīng)答SCMV侵染的表達(dá)模式分析結(jié)果顯示在病毒侵染初期下調(diào)表達(dá), 推測(cè)可能是植物通過抑制表達(dá)的防御反應(yīng)來減緩病毒在體內(nèi)的復(fù)制, 以達(dá)到自我保護(hù)的目的。在SCMV侵染后期,又逐漸恢復(fù)至未侵染前的表達(dá)水平, 這可能是由于甘蔗是SCMV的天然寄主, SCMV建立系統(tǒng)性侵染之后, SCMV不再依賴或利用ScPVA12。目前有關(guān)植物VAP27蛋白功能及其應(yīng)答病毒侵染機(jī)制的研究非常有限,在病毒脅迫下的表達(dá)水平變化的根本原因仍需進(jìn)一步明確。后繼我們將開展ScPVA12及其蛋白家族的相關(guān)研究, 克隆甘蔗的ORP3a并驗(yàn)證其與PVA12的互作, 進(jìn)一步明確ScPVA12在SCMV侵染甘蔗中的作用。

4 結(jié)論

的ORF長(zhǎng)度為735 bp, 編碼244 aa。亞細(xì)胞定位試驗(yàn)表明, ScPVA12蛋白主要定位在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng); Y2H和BiFC驗(yàn)證表明ScPVA12與SCMV-P3N-PIPO存在互作關(guān)系; 共定位試驗(yàn)表明ScPVA12與SCMV-P3N-PIPO在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在共定位; RT-qPCR分析顯示,基因在各組織中均表達(dá), 其中正七葉表達(dá)量最高, 第8節(jié)間表達(dá)量最低; 在SCMV脅迫下早期下調(diào)表達(dá), 后期逐步恢復(fù)正常表達(dá)水平。

[1] 劉曉雪, 王新超. 2017/18榨季中國食糖生產(chǎn)形勢(shì)分析與2018/19榨季展望. 農(nóng)業(yè)展望, 2018, 14(11): 40–46. Liu X X, Wang X C. Domestic sugar production situation in 2017/18 crushing season and its prospect for 2018/19 crushing season., 2018, 14(11): 40–46 (in Chinese with English abstract).

[2] 王明強(qiáng), 李文鳳, 黃應(yīng)昆, 王曉燕, 盧文潔, 羅志明. 我國大陸蔗區(qū)發(fā)生的甘蔗病毒病及防控對(duì)策. 中國糖料, 2010, (4): 55–58. Wang M Q, Li Y P, Huang Y K, Wang X Y, Lu W J, Luo Z M. Occurrence and controlling strategies on sugarcane viral diseases in Chinese mainland., 2010, (4): 55–58 (in Chinese with English abstract).

[3] 劉燕群, 李玉萍, 梁偉紅, 宋啟道, 秦小立, 葉露. 國外甘蔗產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀. 世界農(nóng)業(yè), 2015, (8): 147–152. Liu Y Q, Li Y P, Liang W H, Song Q D, Qin X L, Ye L. Current status and development of the abroad sugarcane industry., 2015, (8): 147–152 (in Chinese with English abstract).

[4] 李明, 田洪春, 黃智剛. 我國甘蔗產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀研究. 中國糖料, 2017, 39(1): 67–70. Li M, Tian H C, Huang Z G. Research on the development status of sugarcane industry in China., 39(1): 67–70 (in Chinese with English abstract).

[5] 翁卓, 黃寒. 中國制糖產(chǎn)業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力對(duì)比與政策建議—基于對(duì)巴西、印度、泰國考察的比較. 甘蔗糖業(yè), 2015, (4): 65–72. Weng Z, Huang H. Comparative analysis on China’s sugar industry competitiveness: based on the comparison of Brazil, India and Thailand sugar industry., 2015, (4): 65–72 (in Chinese with English abstract).

[6] 黃應(yīng)昆, 李文風(fēng), 盧文潔, 羅志明. 云南蔗區(qū)甘蔗花葉病流行原因及控制對(duì)策. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 22: 935–938. Huang Y K, Li W F, Lu W J, Luo Z M. The Causes of sugarcane mosaic disease epidemic in Yunnan sugarcane area and the control strategy., 2007, 22: 935–938 (in Chinese with English abstract).

[7] 顏梅新, 黃偉華, 鄧展云, 韋金菊. 廣西甘蔗花葉病SCMV調(diào)查初報(bào). 中國糖料, 2012, (1): 50–51. Yan M X, Huang W H, Deng Z Y, Wei J J. Investigation ofinfecting sugarcane in Guangxi., 2012, (1): 50–51 (in Chinese with English abstract).

[8] 熊國如, 李增平, 趙婷婷, 蔡文偉, 王俊剛, 王文治, 馮翠蓮, 張雨良, 張樹珍. 海南蔗區(qū)甘蔗病害種類及發(fā)生情況. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2010, 31: 1588–1595. Xiong G R, Li Z P, Zhao T T, Cai W W, Wang J G, Wang W Z, Feng C L, Zhang Y L, Zhang S Z. Primary Investigation to Sugarcane on the Diseases in Hainan Province., 2010, 31: 1588–1595 (in Chinese with English abstract).

[9] 蔣軍喜, 謝艷, 闕海勇. 江西甘蔗花葉病病原的分子鑒定. 植物病理學(xué)報(bào), 2009, 39: 203–206. Jiang J X, Xie Y, Que H Y. Molecular identification of the pathogen of sugarcane mosaic disease in Jiangxi province., 2009, 39: 203–206 (in Chinese with English abstract).

[10] 梁姍姍, 羅群, 陳如凱, 高三基. 引起甘蔗花葉病的病原分子生物學(xué)進(jìn)展. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2017, 44: 363–370. Liang S S, Luo Q, Chen R K, Gao S J. Advances in researches on molecular biology of viruses causing sugarcane mosaic., 2017, 44: 363–370 (in Chinese with English abstract).

[11] 馮小艷, 沈林波, 王文治, 楊本鵬, 王勤南, 周峰, 王俊剛, 熊國如, 張樹珍. 中國甘蔗主要雜交親本病毒性病害的分子鑒定. 分子植物育種, 2018, 16: 6729–6737. Feng X Y, Shen L B, Wang W Z, Yang B P, Wang Q N, Zhou F, Wang J G, Xiong G R, Zhang S Z. Molecular identification of viral diseases in major sugarcane hybrid parents in China., 2018, 16: 6729–6737 (in Chinese with English abstract).

[12] 周國輝, 許東林, 沈萬寬. 甘蔗重要病害研究及防治策略. 甘蔗糖業(yè), 2005, (1): 11–16. Zhou G H, Xu D L, Shen W K. On sugarcane major diseases and their controlling., 2005, (1): 11–16 (in Chinese).

[13] 周豐靜, 黃誠華, 李正文, 商顯坤, 黃偉華, 潘雪紅, 魏吉利, 林善海. 廣西蔗區(qū)甘蔗花葉病病毒種群分析. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 46: 609–613. Zhou F J, Huang C H, Li Z W, Shang X S, Huang W H, Pan X H, Wei J L, Lin S H. Analysis of the virus population causingdisease in sugarcane growing area of Guangxi., 2015, 46: 609–613 (in Chinese with English abstract).

[14] 楊榮仲, 周會(huì), 肖祎, 呂達(dá), 廖紅香, 陳道德, 劉昔輝, 雷敬超,林垠孚. 甘蔗主要親本自然條件下抗甘蔗花葉病測(cè)定. 中國糖料, 2020, 42(2): 47–52.Yang R Z, Zhou H, Xiao Y, Lyu D, Liao H X, Chen D D, Liu X H, Lei J C, Lin Y F. Testing on sugarcane mosaic resistance of sugarcane major parents under field conditions., 2020, 42(2): 47–52 (in Chinese with English abstract).

[15] Ling H, Huang N, Wu Q, Su Y, Peng Q, Ahmed W, Gao S, Su W, Que Y, Xu L. Transcriptional insights into theinteraction., 2018, 11: 163–176.

[16] Akbar S, Yao W, Yu K, Qin L, Ruan M, Powell C A, Chen B, Zhang M. Photosynthetic characterization and expression profiles of sugarcane infected by(SCMV)., 2020, 150: 279–294.

[17] Wu L, Zu X, Wang S, Chen Y. Sugarcane mosaic virus: long history but still a threat to industry., 2012, 42: 74–78.

[18] 王文治, 馬滋蔓, 張樹珍, 楊本鵬, 蔡文偉, 顧麗紅, 李嬌. 甘蔗花葉病的基因工程研究. 生物技術(shù)通報(bào), 2009, (1): 22–26. Wang W Z, Ma Z M, Zhang S Z, Yang B P, Cai W W, Gu L H, Li J. Research on genetic engineering of sugarcane mosaic disease., 2009, (1): 22–26 (in Chinese with English abstract).

[19] 張海, 劉淑嫻, 楊宗桃, 王彤, 程光遠(yuǎn), 商賀陽, 徐景升. 甘蔗PsbS亞基應(yīng)答甘蔗花葉病毒侵染及其與6K2蛋白的互作研究. 作物學(xué)報(bào), 2020, 46: 1534–1545. Zhang H, Liu S X, Yang Z T, Wang T, Cheng G Y, Shang H Y, Xu J S. Sugarcane PsbS subunit response toinfection and its interaction with 6K2 protein., 2020, 46: 1534–1545 (in Chinese with English abstract).

[20] 鄭艷茹, 翟玉山, 鄧宇晴, 成偉, 程光遠(yuǎn), 楊永慶, 徐景升. 甘蔗花葉病毒(SCMV)種群結(jié)構(gòu)分析. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2016, 45(2): 135–140.Zheng Y R, Zhai Y S, Deng Y Q, Cheng W, Cheng G Y, Yang Y Q, Xu J S. The population structure of(SCMV).(Nat Sci Edn), 2016, 45(2): 135–140 (in Chinese with English abstract).

[21] Yao W, Ruan M, Qin L, Yang C, Chen R, Chen B, Zhang M. Field performance of transgenic sugarcane lines resistant to., 2017, 8: 104.

[22] Filloux D, Fernandez E, Comstock J C, Mollov D, Roumagnac P, Rott P. Viral metagenomic-based screening of sugarcane from Florida reveals occurrence of six sugarcane-infecting viruses and high prevalence of., 2018, 102: 2317–2323.

[23] Yahaya A, Dangora D B, Kumar P L, Alegbejo M D, Gregg L, Alabi O J. Prevalence and genome characterization of field isolates of(SCMV) in Nigeria., 2019, 103: 818–824.

[24] 鄧宇晴, 楊永慶, 翟玉山, 程光遠(yuǎn), 彭磊, 鄭艷茹, 林彥銓, 徐景升. 甘蔗花葉病毒福州分離物全基因組克隆及種群分析. 植物病理學(xué)報(bào), 2016, 46: 775–782. Deng Y Q, Yang Y Q, Zhai Y S, Cheng G Y, Peng L, Zheng Y R, Lin Y Q, Xu J S. Genome cloning of twoisolates from Fuzhou and phylogenetic analysis of SCMV., 2016, 46: 775–782 (in Chinese with English abstract)

[25] Xu D L, Park J W, Mirkov T E, Zhou G H. Viruses causing mosaic disease in sugarcane and their genetic diversity in southern China., 2008, 153: 1031–1039.

[26] 沈林波, 吳楠楠, 馮小艷, 熊國如, 趙婷婷, 王文治, 王俊剛, 張樹珍. 52個(gè)甘蔗品種在廣西受病毒侵染情況. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2020, 41(1): 116–126. Shen L B, Wu N N, Feng X Y, Xiong G R, Zhao T T, Wang W Z, Wang J G, Zhang S Z. Virus infection situation of fifty-two sugarcane varieties in Guangxi., 2020, 41(1): 116–126 (in Chinese with English abstract).

[27] Olspert A, Chung B Y, Atkins J F, Carr J P, Firth A E. Transcriptional slippage in the positive-sense RNA virus family., 2015, 16: 995–1004.

[28] Wei T, Zhang C, Hong J, Xiong R, Kasschau K D, Zhou X, Carrington J C, Wang A. Formation of complexes at plasmodesmata for potyvirus intercellular movement is mediated by the viral protein P3N-PIPO., 2010, 6: e1000962.

[29] Chai M, Wu X, Liu J, Fang Y, Luan Y, Cui X, Zhou X, Wang A, Cheng X. P3N-PIPO interacts with P3 via the shared N-terminal domain to recruit viral replication vesicles for cell-to-cell movement., 2020, 94: e01898.

[30] Tilsner J, Linnik O, Louveaux M, Roberts I M, Chapman S N, Oparka K J. Replication and trafficking of a plant virus are coupled at the entrances of plasmodesmata., 2013, 201: 981–995.

[31] 胡帆, 雷榮, 廖曉蘭. 植物病毒在細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)理探討. 生物學(xué)雜志, 2013, 30(6): 81–85. Hu F, Lei R, Liao X L. The mechanism of viral intracellular transportation in plant., 2013, 30(6): 81–85 (in Chinese with English abstract).

[32] Hillung J, Elena S F, Cuevas J M. Intra-specific variability and biological relevance of P3N-PIPO protein length in potyviruses., 2013, 13: 249.

[33] Lin W, Feng Z, Prasanth K R, Liu Y, Nagy P D. Dynamic interplay between the co-opted Fis1 mitochondrial fission protein and membrane contact site proteins in supporting tombusvirus replication., 2021, 17: e1009423.

[34] 崔曉艷, 陳新, 顧和平, 張紅梅, 陳華濤, 袁星星. 馬鈴薯Y病毒屬病毒P3和P3-PiPo蛋白功能研究進(jìn)展. 微生物學(xué)通報(bào), 2012, 39(1): 99–105. Cui X Y, Chen X, Gu H P, Zhang H M, Chen H T, Yuan X X. The functional characterization of-encoded P3 and P3-PiPo protein., 2012, 39(1): 99–105 (in Chinese with English abstract).

[35] Wang A. Dissecting the molecular network of virus-plant interactions: the complex roles of host factors., 2015, 53: 45–66.

[36] Cheng G, Dong M, Xu Q, Peng L, Yang Z, Wei T, Xu J. Dissecting the molecular mechanism of the subcellular localization and cell-to-cell movement of theP3N-PIPO., 2017, 7: 9868.

[37] Saravanan R S, Slabaugh E, Singh V R, Lapidus L J, Haas T, Brandizzi F. The targeting of the oxysterol-binding protein ORP3a to the endoplasmic reticulum relies on the plant VAP33 homolog PVA12., 2009, 58: 817–830.

[38] Laurent F, Labesse G, de Wit P. Molecular cloning and partial characterization of a plant VAP33 homologue with a major sperm protein domain., 2000, 270: 286–292.

[39] Pérez-Sancho J, Tilsner J, Samuels A L, Botella M A, Bayer E M, Rosado A. Stitching organelles: organization and function of specialized membrane contact sites in plants., 2016, 26: 705–717.

[40] Taká? T, ?amajová O, Vadovi? P, Pechan T, ?amaj J. Shot-gun proteomic analysis on roots ofmutants suggesting the involvement of PLDα1 in mitochondrial protein import, vesicular trafficking and glucosinolate biosynthesis., 2018, 20: 82.

[41] Sutter J U, Campanoni P, Blatt M R, Paneque M. Setting SNAREs in a different wood., 2006, 7: 627–638.

[42] Ichikawa M, Nakai Y, Arima K, Nishiyama S, Hirano T, Sato M H. A VAMP-associated protein, PVA31 is involved in leaf senescence in., 2015, 10: e990847.

[43] Wang P, Richardson C, Hawkins T J, Sparkes I, Hawes C, Hussey P J. Plant VAP27 proteins: domain characterization, intracellular localization and role in plant development., 2016, 210: 1311–1326.

[44] Loewen C J, Levine T P. A highly conserved binding site in vesicle-associated membrane protein-associated protein (VAP) for the FFAT motif of lipid-binding proteins., 2005, 280: 14097–14104.

[45] Murphy S E, Levine T P. VAP, a versatile access point for the endoplasmic reticulum: review and analysis of FFAT-like motifs in the VAPome., 2016, 1861: 952–961.

[46] D’Ippólito S, Arias L A, Casalongué C A, Pagnussat G C, Fiol D F. The DC1-domain protein VACUOLELESS GAMETOPHYTES is essential for development of female and male gametophytes in., 2017, 90: 261–275.

[47] 金紅敏, 李立新. 擬南芥SNARE因子在膜泡運(yùn)輸中的功能. 植物學(xué)報(bào), 2010, 45: 479–491. Jin H M, Li L X. Role ofSNARE proteins in vesicle trafficking., 2010, 45: 479–491 (in Chinese with English abstract).

[48] Stefano G, Renna L, Wormsbaecher C, Gamble J, Zienkiewicz K, Brandizzi F. Plant endocytosis requires the ER membrane- anchored proteins VAP27-1 and VAP27-3., 2018, 23: 2299–2307.

[49] Wang P, Pleskot R, Zang J, Winkler J, Wang J, Yperman K, Zhang T, Wang K, Gong J, Guan Y, Richardson C, Duckney P, Vandorpe M, Mylle E, Fiserova J, Van Damme D, Hussey P J. Plant AtEH/Pan1 proteins drive autophagosome formation at ER-PM contact sites with actin and endocytic machinery., 2019, 10: 5132.

[50] Wang P, Hawkins T J, Richardson C, Cummins I, Deeks M J, Sparkes I, Hawes C, Hussey P J. The plant cytoskeleton, NET3C, and VAP27 mediate the link between the plasma membrane and endoplasmic reticulum., 2014, 24: 1397–1405.

[51] Zhang Z, Thomma B P. Structure-function aspects of extracellular leucine-rich repeat-containing cell surface receptors in plants., 2013, 55: 1212–1223.

[52] Carette J E, Verver J, Martens J, van Kampen T, Wellink J, van Kammen A. Characterization of plant proteins that interact with‘60K’ protein in the yeast two-hybrid system., 2002, 83: 885–893.

[53] Barajas D, Xu K, de Castro Martín I F, Sasvari Z, Brandizzi F, Risco C, Nagy P D. Co-opted oxysterol-binding ORP and VAP proteins channel sterols to RNA virus replication sites via membrane contact sites., 2014, 10: e1004388.

[54] Lin L, Luo Z, Yan F, Lu Y, Zheng H, Chen J. Interaction between potyvirus P3 and ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RubisCO) of host plants., 2011, 43: 90–92.

[55] 王倩. 調(diào)控黃瓜花葉病毒復(fù)制的寄主脂質(zhì)因子的研究. 浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文, 浙江杭州, 2019. Wang Q. Study on the Regulation of Host Lipid Factors in CMV Replication. MS Thesis of Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou, Zhejiang, China, 2019 (in Chinese with English abstract).

[56] Xu K, Nagy P D. Enrichment of phosphatidylethanolamine in viral replication compartments via co-opting the endosomal Rab5 small GTPase by a positive-strand RNA virus., 2016, 14: e2000128.

[57] Chuang C, Barajas D, Qin J, Nagy P D. Inactivation of the host lipin gene accelerates RNA virus replication through viral exploitation of the expanded endoplasmic reticulum membrane., 2014, 10: e1003944.

[58] Sharma M, Sasvari Z, Nagy P D. Inhibition of sterol biosynthesis reduces tombusvirus replication in yeast and plants., 2010, 84: 2270–2281.

[59] Xu K, Nagy P D. RNA virus replication depends on enrichment of phosphatidylethanolamine at replication sites in subcellular membranes., 2015, 112: E1782–E1791.

[60] Grison M S, Brocard L, Fouillen L, Nicolas W, Wewer V, D?rmann P, Nacir H, Benitez-Alfonso Y, Claverol S, Germain V, Boutté Y, Mongrand S, Bayer E M. Specific membrane lipid composition is important for plasmodesmata function in., 2015, 27: 1228–1250.

[61] Xie J, Jiang T, Li Z, Li X, Fan Z, Zhou T.remodels multiple intracellular organelles to form genomic RNA replication sites., 2021, 166: 1921–1930.

[62] 鄒文嬌, 葛磊, 予茜. 氧化甾醇結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白家族的研究進(jìn)展. 植物學(xué)報(bào), 2021, 56: 627–640. Zou W J, Ge L, Yu Q. Research advances in oxysterol-binding protein-related proteins., 2021, 56: 627–640 (in Chinese with English abstract).

[63] Wang P, Hawes C, Hussey P J. Plant endoplasmic reticulum- plasma membrane contact sites., 2017, 22: 289–297.

[64] Levy A, Tilsner J. Creating contacts between replication and movement at plasmodesmata: a role for membrane contact sites in plant virus infections?, 2020, 11: 862.

[65] Zhang H, Cheng G, Yang Z, Wang T, Xu J. Identification of sugarcane host factors interacting with the 6K2 protein of the., 2019, 20: 3867.

[66] Cheng G, Yang Z, Zhang H, Zhang J, Xu J. Remorin interacting with PCaP1 impairsintercellular movement but is antagonised by VPg., 2020, 225: 2122–2139.

[67] Hyodo K, Okuno T. Pathogenesis mediated by proviral host factors involved in translation and replication of plant positive-strand RNA viruses., 2016, 17: 11–18.

[68] Addy H S, Nurmalasari, Wahyudi A H S, Sholeh A, Anugrah C, Iriyanto F E S, Darmanto W, Sugiharto B. Detection and response of sugarcane against the infection of(SCMV) in Indonesia., 2017, 7: 50.

Interaction of sugarcane VAMP associated protein ScPVA12 with SCMV P3N-PIPO

YU Quan-Xin1, YANG Zong-Tao1, ZHANG Hai1, CHENG Guang-Yuan1, ZHOU Ying-Shuan1, JIAO Wen-Di1, ZENG Kang1, LUO Ting-Xu1, HUANG Guo-Qiang1, ZHANG Mu-Qing2,*, and XU Jing-Sheng1,*

1Fujian Agriculture and Forestry University / Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / National Engineering Research Center for Sugarcane / Key Laboratory of Ministry of Education for Genetics, Breeding and Multiple Utilization of Crops, Fuzhou 350002, Fujian, China;2Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Biology, Guangxi University, Nanning 530004, Guangxi, China

PVA12 (plant vesicle-associated membrane protein (VAMP)-associated proteins homolog 12) is a member of the VAP27 family of proteins that mediate endoplasmic reticulum (ER) vesicle transport and membrane fusion in cells. Sugarcane (spp. hybrid) PVA12 responding to(SCMV) infection has not been reported. In the present study, the coding gene of PVA12 was cloned from sugarcane cultivar ROC22 and designated as. The open reading frame (ORF) ofwas 735 bp in length, which encoded a protein with 244 amino acids. Bioinformatics analysis showed that ScPVA12 was an unstable hydrophilic liposoluble protein with a transmembrane at the C-terminal domain. The ratio of the random coil ranked the highest in the secondary structure. Phylogenetic tree analysis revealed that the ScPVA12 was differentiated in monocotyledons and dicotyledons. Yeast two-hybrid (Y2H) and bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays showed that ScPVA12 interacted with SCMV-P3N-PIPO. Subcellular localization experiments indicated that ScPVA12 was localized in the ER. Co-localization experiments demonstrated that ScPVA12 and SCMV-P3N-PIPO co-localized in the ER. Real-time quantitative PCR analysis showed thatgene was expressed in all sugarcane tissues, with the lowest expression level in the eighth internode and the highest expression level in the 7th leaves. The relative expression level ofgene was significantly affected under the stress of SCMV.was down-regulated upon SCMV infection and then recovered to the regular level compared with the control.

PVA12;; P3N-PIPO; protein interaction

2022-10-28;

2023-02-10;

2023-02-28.

10.3724/SP.J.1006.2023.24244

通信作者(Corresponding authors):徐景升, E-mail: xujingsheng@126.com; 張木清, E-mail: zmuqing@163.com

E-mail: YuQuanxin_YQX@outlook.com

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31971991), 福建農(nóng)林大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(CXZX2019132G)和廣西甘蔗生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(GXKLSCB-202003)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31971991), the Science and Technology Innovation Project of Fujian Agriculture and Forestry University (CXZX2019132G), and the Open Project Program of Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Biology (GXKLSCB-202003).

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail//11.1809.S.20230227.1407.006.html

This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).