王韓英,陳 勇,朱雙媚

王韓英,陳勇,朱雙媚,麗水市人民醫(yī)院腫瘤放化療科 浙江省麗水市 323000

王韓英,主治醫(yī)師,主要從事腫瘤方面的基礎(chǔ)與臨床研究.

0 引言

據(jù)國(guó)家癌癥中心2022年發(fā)布的全國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)顯示,胃癌作為常見的消化系統(tǒng)腫瘤,其發(fā)病例數(shù)和死亡率均位居第三[1].臨床上胃癌早期篩出率較低,常見為中晚期胃癌患者,手術(shù)及放化療效果有限[2,3],尋找高效的抗腫瘤藥物及靶點(diǎn)依舊是臨床胃癌輔助治療的重點(diǎn)研究領(lǐng)域.2000年和2011年Weinberg及其研究伙伴[4,5]總結(jié)了包括能量代謝異常、持續(xù)的增殖信號(hào)、逃避生長(zhǎng)抑制以及侵襲轉(zhuǎn)移等在內(nèi)的腫瘤十大特征.能量代謝在腫瘤細(xì)胞的惡性增殖過程中具有重要的作用,研究顯示,胃癌細(xì)胞的糖酵解代謝十分活躍,符合Warburg效應(yīng)的代謝特征[3,6].抑制腫瘤細(xì)胞的糖酵解代謝對(duì)抑制腫瘤的生長(zhǎng)具有重要的意義,也為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了新的方向和思路.中醫(yī)藥在腫瘤的治療上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是中藥川芎的主要活性成分,目前常用于輔助治療心腦血管疾病.但現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示,TMP具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多效作用,且對(duì)機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)均具有調(diào)節(jié)效應(yīng),臨床應(yīng)用前景廣闊[7-9].本研究以胃癌細(xì)胞株為對(duì)象,評(píng)估TMP對(duì)其增殖、遷移的影響,并從葡萄糖代謝的角度初步探討其可能的作用機(jī)制,為TMP的臨床應(yīng)用提供一定理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料 細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國(guó)Invitrogen公司;川芎嗪(TMP,純度＞98%)購自上海源葉生物科技有限公司;胃癌細(xì)胞株AGS和SGC7901購自武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心;蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、p-AKT和β-actin抗體購自美國(guó)Cell Signaling公司;葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glucose transporter-1,GLUT1)、己糖激酶2(hexokinase 2,HK2)及乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)抗體購自美國(guó)Abcam公司;CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購自上海莼試生物技術(shù)有限公司;葡萄糖(glucose,GLU)、乳酸(lactic acid,LD)、己糖激酶(hexokinase,HK)及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)市售分析純.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及CCK-8細(xì)胞活力測(cè)定: 胃癌細(xì)胞株AGS和SGC7901生長(zhǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件: 5%二氧化碳、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱,定期更換培養(yǎng)基并傳代,維持細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài).將消化后的AGS和SGC7901細(xì)胞(5000個(gè)/孔)分別接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿中,同步化處理后加TMP濃度梯度設(shè)置: (0、5、10、20、40、80) μM分別干預(yù)24 h、48 h、72 h.每孔中加入10 μL的CCK-8試劑,孵育2 h后經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度值(OD).每組均設(shè)置三個(gè)復(fù)孔,結(jié)果取其均值,同時(shí)設(shè)不加細(xì)胞的單孔作為空白對(duì)照;繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次(n=3).

1.2.2 細(xì)胞增殖檢測(cè): 采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況.將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿中,貼壁同步化后,依據(jù)實(shí)驗(yàn)分組加藥干預(yù)至實(shí)驗(yàn)預(yù)定的時(shí)間.吸棄培養(yǎng)基,加4%多聚甲醛固定后,結(jié)晶紫染色并于顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù),計(jì)算細(xì)胞克隆形成率.細(xì)胞分組設(shè)置: 對(duì)照組(control,Ctrl)、低劑量TMP組(TMP-L,培養(yǎng)基中TMP濃度為10 μM)、中劑量TMP組(TMP-M,培養(yǎng)基中TMP濃度為20 μM)、高劑量TMP組(TMP-H,培養(yǎng)基中TMP濃度為40 μM).

1.2.3 細(xì)胞遷移檢測(cè): 采用transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移.依據(jù)實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì),將AGS和SGC7901細(xì)胞對(duì)應(yīng)的各自的細(xì)胞懸液加入transwell小室的上室中,下室中加入相應(yīng)的培養(yǎng)基,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h.移除上室表面未遷移的細(xì)胞,遷移細(xì)胞經(jīng)甲醇固定后加結(jié)晶紫染液染色,置于顯微鏡下拍照觀察并計(jì)算細(xì)胞遷移率.

1.2.4 細(xì)胞侵襲檢測(cè): 采用transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力.預(yù)先將Matrigel膠均勻鋪至Transwell小室底部膜的上室面,37 ℃培養(yǎng)箱中孵育,使基質(zhì)膠聚合成薄膜,用以模擬細(xì)胞外基質(zhì);而后將各組處理的AGS和SGC7901細(xì)胞對(duì)應(yīng)的各自的細(xì)胞懸液加入transwell小室的上室中,操作步驟同1.2.3,最后經(jīng)結(jié)晶紫染色,并置于顯微鏡下拍照觀察并計(jì)算細(xì)胞侵襲率.

1.2.5 細(xì)胞葡萄糖代謝指標(biāo)檢測(cè): AGS和SGC7901細(xì)胞分別經(jīng)相應(yīng)的上述分組處理后,均依據(jù)公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行GLU攝取、LD產(chǎn)量、HK及LDH指標(biāo)的檢測(cè)操作.

1.2.6 氧消耗速率(oxygen consumption rate,OCR)及細(xì)胞外酸化率(extra-cellular acidification rate,ECAR)檢測(cè): 采用細(xì)胞能量分析儀(Seahorse XF24,美國(guó)Seahorse Bioscience公司)檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)TMP干預(yù)后OCR以及ECAR.將胃癌細(xì)胞株AGS和SGC7901細(xì)胞分別接種至專用培養(yǎng)板(10000個(gè)/孔).依據(jù)說明書操作如下: 貼壁后更換細(xì)胞培養(yǎng)基為檢測(cè)液,先監(jiān)測(cè)基礎(chǔ)條件下的OCR和ECAR,依次加藥(寡霉素、解偶聯(lián)劑FCCP、抗霉素A)后檢測(cè)并分析OCR和ECAR的結(jié)果.

1.2.7 細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè): 采用western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組胃癌細(xì)胞株AGS和SGC7901經(jīng)TMP干預(yù)后葡萄糖代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)以及AKT/GLUT1信號(hào)通路的活性.RIPA裂解并離心收集細(xì)胞蛋白,BCA蛋白定量法對(duì)細(xì)胞蛋白進(jìn)行定量后,采用SDS-PAGE蛋白凝膠電泳上樣并分離目的蛋白,之后通過電轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上.5%的脫脂牛奶孵育封閉后,按說明書要求依次加入相應(yīng)的一抗和二抗孵育,暗室中利用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影,定影并對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度半定量分析.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所得數(shù)據(jù)錄入GraphPad 8.3軟件中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間的比較采用方差分析,各組均數(shù)間的兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗(yàn),P＜0.05表示有顯著差異.

2 結(jié)果

2.1 TMP對(duì)胃癌細(xì)胞活力的影響 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力的結(jié)果顯示如圖1所示,隨TMP濃度及作用時(shí)間增加,胃癌細(xì)胞AGS和SGC7901的活力均逐步降低.本實(shí)驗(yàn)后續(xù)選取10 μM、20 μM和40 μM的TMP處理胃癌細(xì)胞48 h分別作為低、中、高劑量處理組.

圖1 川芎嗪對(duì)胃癌細(xì)胞增殖活力的影響. A: CCK-8法檢測(cè)的梯度濃度(0 μM、5 μM、10 μM、20 μM、40 μM和80 μM)TMP干預(yù)AGS細(xì)胞不同時(shí)間(24 h、48 h、72 h)后的細(xì)胞活力數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;B: CCK-8法檢測(cè)的梯度濃度(0 μM、5 μM、10 μM、20 μM、40 μM和80 μM)TMP干預(yù)SGC7901細(xì)胞不同時(shí)間(24 h、48 h、72 h)后的細(xì)胞活力數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果.TMP: 川芎嗪.n=3.

2.2 TMP對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和遷移的影響 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞的增殖情況,結(jié)果如圖2A所示,TMP可劑量依賴性抑制AGS和SGC7901細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群落;統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示,中、高劑量組克隆形成數(shù)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05).

Transwell細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞AGS和SGC7901的遷移情況及侵襲情況,結(jié)果如圖2B和C所示,TMP可劑量依賴性抑制AGS和SGC7901細(xì)胞遷移及侵襲;統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,中、高劑量組細(xì)胞遷移率和侵襲率均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05).

2.3 TMP對(duì)胃癌細(xì)胞葡萄糖代謝的影響 檢測(cè)結(jié)果如表1所示,中、高劑量的TMP可顯著抑制胃癌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用,并抑制細(xì)胞內(nèi)乳酸生成;同時(shí)中、高劑量TMP組的OCR和ECAR值較對(duì)照組顯著降低.

表1 川芎嗪對(duì)胃癌細(xì)胞葡萄糖代謝的影響

2.4 TMP對(duì)胃癌細(xì)胞葡萄糖代謝過程中關(guān)鍵酶活性的影響 進(jìn)一步檢測(cè)TMP對(duì)胃癌細(xì)胞葡萄糖代謝過程中關(guān)鍵酶HK、LDH活性的影響,結(jié)果顯示(圖3),高劑量TMP可顯著抑制HK和LDH的活性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).

圖3 川芎嗪對(duì)胃癌細(xì)胞葡萄糖代謝過程中關(guān)鍵酶活性的影響.A: HK活性的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果,n=3,mean±SD,aP＜0.05,bP＜0.01 vs Ctrl組AGS細(xì)胞;cP＜0.01 vs Ctrl組SGC7901細(xì)胞.B: LDH活性的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果;n=3,mean±SD,aP＜0.05 vs Ctrl組AGS細(xì)胞;bP＜0.05 vs Ctrl組SGC7901細(xì)胞.Ctrl: 對(duì)照組;TMP-L: 低劑量川芎嗪組;TMP-M: 中劑量川芎嗪組;TMP-H: 高劑量川芎嗪組;HK: 己糖激酶;LDH: 乳酸脫氫酶.

2.5 TMP對(duì)胃癌細(xì)胞AKT/GLUT1信號(hào)及葡萄糖代謝相關(guān)蛋白的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果如圖4所示,與對(duì)照組相比,TMP孵育可顯著降低胃癌AGS及SGC7901細(xì)胞中磷酸化AKT的水平,總AKT蛋白表達(dá)不變;同時(shí)可抑制AGS及SGC7901細(xì)胞中GLUT1、HK2及LDHA的蛋白表達(dá)水平.

圖4 川芎嗪對(duì)胃癌細(xì)胞AKT/GLUT1信號(hào)及葡萄糖代謝相關(guān)蛋白的影響. A: AGS細(xì)胞,n=3,mean±SD,aP＜0.05,cP＜0.05,eP＜0.05,gP＜0.05,bP＜0.01,dP＜0.01,fP＜0.01,gP＜0.01 vs Ctrl組;B: SGC7901細(xì)胞,aP＜0.05,eP＜0.05,bP＜0.01,cP＜0.05,dP＜0.01,fP＜0.01 vs Ctrl組.Ctrl: 對(duì)照組;TMP-L: 低劑量川芎嗪組;TMP-M: 中劑量川芎嗪組;TMP-H: 高劑量川芎嗪組.

3 討論

TMP具有抗腫瘤活性,在胃癌中的研究顯示,TMP可通過激活ROS/AMPK通路促進(jìn)SGC7901胃癌細(xì)胞經(jīng)線粒體途徑凋亡[9].另一項(xiàng)研究也同樣表明[10],在SGC7901胃癌細(xì)胞中TMP可通過核因子κB及周期調(diào)控因子發(fā)揮抑制增殖及促凋亡的效應(yīng).本研究旨在探討TMP對(duì)AGS及SGC7901胃癌細(xì)胞增殖及遷移能力的影響以及其中涉及的能量代謝異常問題.結(jié)果顯示TMP可濃度依賴性降低AGS及SGC7901胃癌細(xì)胞活力,并抑制其增殖及遷移.

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步從能量代謝的角度研究了TMP抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)可能涉及的作用機(jī)制.依據(jù)Warburg效應(yīng),AGS和SGC7901胃癌細(xì)胞與其他腫瘤細(xì)胞類似,以有氧糖酵解代謝為主要的能量來源;為維持自身無限增殖的信號(hào),胃癌細(xì)胞對(duì)一方面培養(yǎng)環(huán)境中葡萄糖的需求量較大,另一方面有氧糖酵解代謝會(huì)生成大量的乳酸,維持其生存所需的酸性微環(huán)境[11,12].故而本研究首先檢測(cè)了胃癌細(xì)胞及培養(yǎng)體系中葡萄糖的消耗量和乳酸的生成量,結(jié)果顯示經(jīng)TMP干預(yù)后,AGS細(xì)胞及SGC7901細(xì)胞消耗的葡萄糖量及乳酸的生成量顯著降低.OCR測(cè)量細(xì)胞的耗氧量可以反應(yīng)線粒體的氧化磷酸化作用,ECAR測(cè)定的培養(yǎng)基酸化速率也是一種檢測(cè)葡萄糖代謝的方法.檢測(cè)結(jié)果表明TMP可降低胃癌細(xì)胞的耗氧量和培養(yǎng)基酸化速率;這些結(jié)果均提示TMP可抑制AGS及SGC7901胃癌細(xì)胞利用葡萄糖進(jìn)行有氧糖酵解代謝,能量代謝異?？赡苁菍?dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖及遷移能力下降的原因之一.

腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解代謝過程中同樣需要己糖激酶、乳酸脫氫酶等關(guān)鍵酶的催化.胃癌細(xì)胞中HK2表達(dá)上調(diào)與細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[13];HK2水平降低可阻礙細(xì)胞利用葡萄糖,抑制糖酵解的順利進(jìn)行.作為乳酸生成的關(guān)鍵酶之一,LDHA在胃癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁正常對(duì)照組織,且LDHA的高表達(dá)與胃癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[14,15].故而本研究進(jìn)一步檢測(cè)了胃癌細(xì)胞中,HK2和LDH的表達(dá)以及活性.結(jié)果顯示,TMP可顯著抑胃癌細(xì)胞中HK2和LDH的活性,同時(shí)抑制HK2和LDHA的蛋白表達(dá).AKT信號(hào)已被證實(shí)參與調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)代謝,磷酸化激活A(yù)KT之后可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞膜上葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)以及轉(zhuǎn)位,進(jìn)而增加細(xì)胞攝取葡萄糖的速度,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解代謝和腫瘤的生長(zhǎng)[16,17].本研究的檢測(cè)結(jié)果顯示,TMP可顯著抑制胃癌細(xì)胞中AKT的磷酸化和GLUT1的蛋白表達(dá)水平.以上結(jié)果提示TMP可抑制AKT/GLUT1信號(hào)軸,下調(diào)糖酵解代謝關(guān)鍵酶HK2和LDHA的表達(dá),進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的有氧糖酵解代謝;然而該信號(hào)軸是否會(huì)對(duì)胃癌細(xì)胞其他相關(guān)的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響,所涉及的具體機(jī)制如何,還需進(jìn)一步的研究.

4 結(jié)論

綜上所述,TMP可抑制AGS及SGC7901胃癌細(xì)胞增殖及遷移,并通過AKT/GULT1信號(hào)軸抑制胃癌細(xì)胞有氧糖酵解代謝.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

川芎嗪具有多種抗癌作用,而其對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響和潛在的細(xì)胞學(xué)機(jī)制尚不完全清楚.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

糖酵解在胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)以及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮巨大作用,川芎嗪抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲的過程中是否涉及抑制糖酵解并不清楚.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

評(píng)估川芎嗪對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,并以糖酵解的角度初步探討其涉及的細(xì)胞學(xué)機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)方法

用10 μM、20 μM和40 μM川芎嗪處理胃癌細(xì)胞后,檢測(cè)細(xì)胞活性、遷移與侵襲、葡萄糖代謝指標(biāo)、葡萄糖代謝關(guān)鍵酶活性的變化;并用Western blot分析糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)和蛋白激酶B/葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1信號(hào)活性.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

川芎嗪抑制胃癌細(xì)胞糖酵解、增殖、遷移、侵襲和蛋白激酶B/葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1信號(hào)活性.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

川芎嗪抑制胃癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的作用可能涉及到抑制蛋白激酶B/葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1信號(hào)軸介導(dǎo)的糖酵解.

展望前景

川芎嗪可能是潛在的抗胃癌藥劑.