張永芳，李京城，解 娜，3，陳 艷，陳俊明，黃幼生

（1.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科，海南 ?？?570100；2.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科，海南 海口 570100；3.海南醫(yī)學院口腔組織病理學教研室，海南 ?？?570100）

在2020 年全球癌癥統(tǒng)計中，胃癌居全球癌癥發(fā)病率的第5 位及死亡率的第4 位。當前，中國胃癌新發(fā)病例和致死病例均高于世界平均水平［1］。胃癌的發(fā)展涉及各種遺傳和表觀遺傳學改變，探究胃癌發(fā)展的分子機制有助于為臨床尋找有效治療手段的生物標志物。根據(jù)近年研究結(jié)果，微小RNA（microRNA，miRNA）參與腫瘤的發(fā)生、進展，是癌癥表觀遺傳變化的關(guān)鍵因素［2］，成為有前景的診斷及預后標志物和潛在的治療靶點［3］。

miRNA 屬于非編碼RNA，在RNA 層面行使其生物學功能，不直接編碼蛋白質(zhì)，其發(fā)揮作用主要通過與其靶基因的完全或不完全結(jié)合，介導靶mRNA 降解或抑制靶mRNA 翻譯，從而負調(diào)節(jié)基因表達［4］。miR-29c 和miR-29a、miR-29b 同屬于miR-29 家族，既往研究表明miR-29c 在大部分人類癌癥中表達下調(diào)，包括鼻咽癌［5］、肺癌［6，7］、胃癌［8，9］、宮頸癌［10］、肝細胞癌［11］等。Yoshimasa 等［12］發(fā)現(xiàn)miR-29c 的下調(diào)與胃癌的進展有關(guān)，并且在晚期胃癌中比在胃腺瘤和早期胃癌中更為突出。然而有研究結(jié)果表明miR-29c 表達水平與臨床病理參數(shù)沒有任何相關(guān)性［13］，Han 等［9］對113 例胃癌FFEP 組織進行了分析，認為miR-29c 表達的喪失是胃癌發(fā)生的早期事件。由此可見胃癌miR-29c 表達與臨床病理特征的關(guān)系尚不明晰，在不同的研究中，研究對象和研究方法的不同可能是導致結(jié)果不一致的原因，在以往的相關(guān)研究中，多采用新鮮組織和石蠟組織，但新鮮組織難以獲取，石蠟組織中RNA 降解較快，本研究采用的miRNAscope 技術(shù)則很好地解決了這個問題，其獨特的探針設(shè)計極大提高了在石蠟組織中檢測RNA 的靈敏度和特異性，并可以同時觀察組織形態(tài)和信號表達。

據(jù)此，本研究首先利用TCGA 數(shù)據(jù)庫分析miR-29c 在胃癌和正常組織中的表達情況，其次通過miRNAscope 技術(shù)對生信分析的結(jié)果進行驗證，并進一步分析miR-29c 的表達與胃癌臨床特征間的關(guān)系，為闡明胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制及開發(fā)新的胃癌靶向藥物奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫，獲取胃癌miRNA 表達數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)，得到434 例胃癌miRNA 表達數(shù)據(jù)，其中有41 例有配對正常組織表達數(shù)據(jù)。排除標本重復、非原發(fā)性胃癌、有術(shù)前放化療病史等病例后，總共有372 例胃癌標本納入臨床特征相關(guān)分析，生存分析僅去除生存資料不完整的樣本，共405 例。

收集2020 年1 月～2022 年6 月在海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院外科手術(shù)切除的胃癌標本，包括73 例原發(fā)性胃癌組織及71 例正常組織，其中71 例胃癌組織有配對的正常組織，均經(jīng)中性福爾馬林固定制成石蠟標本。納入的病例在術(shù)前均未進行放、化療，并經(jīng)病理檢查確診，根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC，第8 版）的標準進行TNM 分期。表1 總結(jié)了73 例胃癌患者的臨床因素，包括年齡、性別、組織學分型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。本研究標本使用經(jīng)過海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會討論通過，參加本研究的所有胃癌患者均簽署了書面知情同意書。

表1 miR-29c 表達與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系Tab 1 Relationship between expression of miR-29c and clinicopathological features in gastric cancer patients

1.2 主要試劑

miRNAScopeTM miR-29c 探 針（貨 號 ：1058391），miRNAscope?H2O2and Protease 試劑盒（貨號：322381），miRNAscopeTM HD 檢測試劑盒（紅色，貨號：324510）均購自美國ACD 公司。

1.3 生物信息學分析

1.3.1 miR-29c 差異分析 根據(jù)胃癌組織和正常胃組織的分組，使用“edgeR”包進行差異表達分析，設(shè)置顯著性閾值為差異倍數(shù)的絕對值≥1，且錯誤發(fā)現(xiàn)率＜0.05，對其中配對的胃癌、正常組織進行配對秩和檢驗，P＜0.05 有統(tǒng)計學差異。

1.3.2 miR-29c 臨床特征與預后分析 根據(jù)“survival”包計算miR-29c 的最優(yōu)cutoff 值，將樣本分為miR-29c 高表達和miR-29c 低表達組，并分析各臨床因素（腫瘤部位、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）在此分組間的統(tǒng)計學差異。Kaplan-Meier 法對生存資料進行描述，Log-rank 檢驗評估m(xù)iR-29c 高、低表達組間總生存期的統(tǒng)計學差異。

1.3.3 miR-29c 靶基因預測及富集分析 在mirtarbase［14］在線網(wǎng)站預測miR-29c 的下游基因，下載有至少2 個證據(jù)支持的miR-29c 靶基因。同時，使用TargetScan［15］、PicTar［16］和Starbase［17］在線軟件預測miR-29c 可能調(diào)控的下游基因，并通過TargetScan查找其與miR-29c 的結(jié)合位點，將在線網(wǎng)站（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）篩選的4 重疊的靶標基因作為miR-29c 候選靶標基因。將候選靶標基因輸入DAVID（The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）在線網(wǎng)站進行富集分析，包括GO 功能注釋和KEGG 通路分析，探索miR-29c 可能涉及的生物學功能。

1.4 實驗方法

1.4.1 組織芯片制作 將胃癌及正常FFPE 標本制成HE 切片，顯微鏡下選擇代表性的組織（癌旁正常胃黏膜組織距離癌組織＞5 cm），然后應(yīng)用空芯針制備組織芯片。從每個組織蠟塊的代表性區(qū)域戳出直徑約1.4 mm 的圓柱體，并嵌入已鉆孔的空白蠟塊中，蠟塊置于模具上，表面淋熱蠟封邊，在烤箱（60 ℃）放置1h，使石蠟稍融化以封閉組織塊，室溫放置冷卻，再放入4 ℃冰箱1h后脫模。

1.4.2 miRNAscope 原位雜交法檢測miR-29c 表達 將厚度為3.5 um 的組織芯片在60 °C 下烘烤1.5 h，在新鮮二甲苯中脫蠟，在新鮮乙醇中脫水，然后用12%甲醛室溫下固定2 h，用過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，然后將組織切片在靶標修復液中保持在沸點（98 °C～102 °C）下孵育15 min，用ImmedgeTM疏水筆畫疏水圈，用蛋白酶Ⅲ覆蓋組織，在HybEZ 二代雜交爐中40 °C 處理30 min，用miRNAScopeTMmiR-29c 探針覆蓋組織，雜交2 h。使用miRNAscopeTMHD 檢測試劑盒進行信號檢測，Amp1-Amp6 依次放大雜交信號，將Fast-RED 溶液A 和B（60∶1）混合對組織進行顯色，最后經(jīng)蘇木精復染，在通風櫥干燥后用中性樹膠封片，Hs-RNU6為陽性對照，Sramble 為陰性對照，在標準光學顯微鏡下觀察miRNAscope 結(jié)果。

1.5 結(jié)果判讀

miRNAscope 結(jié)果分為4 個級別：0 分（平均每個細胞染色點為0 或≤1 個點/每10 個細胞，40 倍視野），1 分（2 個～10 個點/細胞，沒有或很少細胞簇，40 倍視野），2 分（11 個～20 個點/細胞和或＜25%的陽性細胞有點狀團簇，20～40 倍視野），3 分（＞20個點/細胞和或＞25%的陽性細胞有點狀團簇，20倍視野），其中0 分和1 分為低表達，2 分和3 分為高表達。

1.6 統(tǒng)計學處理

用 R4.0.3 及SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件，分類變量比較使用卡方檢驗，配對的連續(xù)性變量比較使用配對秩和檢驗，生存分析使用Log-rank 檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫中miR-29c 差異分析

結(jié)果顯示，與正常胃黏膜組織相比（中位表達值12.510 54，n=41），miR-29c 在胃癌組織（中位表達值10.879 42，n=434）中的表達顯著下調(diào)（P＜0.001）；在配對的41 例組織中，miR-29c 在胃癌組織的表達同樣顯著下調(diào)（P＜0.001）。見圖1。

圖1 TCGA 數(shù)據(jù)中miR-29c-3p 的表達圖Fig 1 Expression diagram of miR-29c-3p in TCGA data

2.2 TCGA 數(shù)據(jù)庫中miR-29c 表達與臨床病理特征及預后的關(guān)系

miR-29c 的表達與胃癌患者年齡、性別、部位、分級、TNM 分期、T 分期、N 分期無明顯相關(guān)（P＞0.05），對miR-29c 表達與胃癌患者總生存期的分析顯示，miR-29c 高表達組生存率高于低表達組，但差異沒有顯著性（P=0.141）。

2.3 miR-29c 靶基因預測及富集分析

為了進一步探討miR-29c（圖2A）的生物學功能，本項目通過在線數(shù)據(jù)庫預測miR-29c 調(diào)控的下游基因，miRNA 預測閾值設(shè)定如下：Pictar 得分大于2 分，得到449 個候選靶基因；TargetScan 保守性結(jié)合位點數(shù)＞0 且總評分值＜-0.4，得到365 個候選靶基因；Starbase CLIP Data 數(shù)≥3，Pan-Cancer 數(shù)≥10，得到809 個候選靶基因。另外從mirtarbase 網(wǎng)站下載了242 個已被證實的miR-29c 的下游mRNA，其中有2 個及以上證據(jù)支撐的有161 個，使用在線網(wǎng)站對預測結(jié)果取交集，得到18 個候選靶基因（圖2B）。GO 功能注釋結(jié)果顯示（圖2C），18 個潛在的靶基因主要注釋主要包括細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶活性、蛋白結(jié)合等生物學功能；KEGG 通路主要富集在癌癥相關(guān)miRNAs、腫瘤相關(guān)信號途徑、PI3K-AKT、ECM 受體相互作用等信號通路上（圖2D）。

圖2 miR-29c 靶基因預測及富集分析Fig 2 Target genes prediction and enrichment analysis of miR-29c

2.4 胃癌組織中miR-29c 表達及其與患者臨床病理特征關(guān)系的驗證

為了進一步證實TCGA 數(shù)據(jù)分析結(jié)果，本項目應(yīng)用miRNAscope 技術(shù)檢測miR-29c 的表達水平，結(jié)果顯示73 例胃癌組織中miR-29c 高表達組29 例，低表達組44 例，高表達率為39.7%（29/73）；71 例正常組織中miR-29c 高表達組64 例，低表達組7 例，高表達率為90.14%（64/71）。與正常組織相比，miR-29c 在胃癌組織中表達明顯下調(diào)（χ2=39.995，P＜0.001）。見圖3。對73 例胃癌患者miR-29c 的表達及臨床病理特征相關(guān)性進行分析，結(jié)果顯示miR-29c 的表達水平與胃癌患者TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分型有關(guān)（P均＜0.05），與年齡、性別、部位、浸潤深度、脈管侵犯均無關(guān)。見表1。

圖3 miR-29c 在胃癌及正常組織中的表達（200×）Fig 3 Expression of miR-29c in gastric cancer and normal tissues（200×）

3 討論

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，內(nèi)鏡切除已成為早期胃癌有效的治療策略，但由于常常發(fā)現(xiàn)較晚，缺乏有效的治療方案，導致其生存率普遍較低，給人類生命健康造成了嚴重的威脅及巨大的經(jīng)濟負擔。近年來，腫瘤靶向治療得到快速發(fā)展，例如，靶向HER2基因的赫賽丁治療能提高乳腺癌及胃癌患者生存率［18，19］。然而，靶向藥物仍有適用人群窄、容易耐藥等缺陷，因而探索新的、更精確的生物標記物是當前研究重點。

miRNAs 作為表觀遺傳學變化的關(guān)鍵因素，是多種靶基因的內(nèi)源性沉默子，在多種惡性腫瘤中存在異常表達［20］。前期研究顯示，多種miRNA 包括miR-29c 在胃癌組織中異常表達，參與調(diào)控癌細胞黏附、遷移、基因表達等功能活動，與AKT、MAPK、p53 等信號通路活化相關(guān)［21］。有研究證明miR-29c通過RhoA/ROCK 信號通路參與調(diào)控胃癌細胞的遷移和凋亡［22］，Li 等［23］對60 例胃癌患者的新鮮組織樣本分析結(jié)果顯示，miR-29c 在不同腫瘤分期組間差異有統(tǒng)計學意義（P=0.049），Han 等［9］發(fā)現(xiàn)miR-29c 在胃癌組織中的表達下調(diào)，但未發(fā)現(xiàn)與胃癌臨床病理特征有直接關(guān)系，其結(jié)果是提取石蠟組織RNA 進行qPCR 分析而得出，然而石蠟組織中的RNA 降解嚴重，且miR-29c 在癌組織中的豐度非常低，因而采取這種方法得出的結(jié)論可能欠準確。本項目也采取過提取石蠟組織RNA 分析miR-29c 表達，僅有部分組織能檢測出miR-29c 表達，且CT 值均在32 以上，熔解曲線不理想（資料未發(fā)表）。

為了提高miR-29c 在胃癌組織中表達的檢出率，本項目采用了ACD 公司推出的miRNAscope 技術(shù)。MiRNAscope 技術(shù)是一種專門為石蠟組織開發(fā)的原位雜交技術(shù)，與其他RNA 原位雜交方法相比，由于其獨特的雙Z 探針設(shè)計，信號放大倍數(shù)可達400 倍，并且同時進行背景噪聲抑制［24］。應(yīng)用這種方法使miR-29c 檢出率顯著提高，特異性更強，可以同時觀察組織形態(tài)和信號表達。

本項目通過miRNAscope 技術(shù)對胃癌患者miR-29c 的檢測及與臨床因素的關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)miR-29c 在胃癌組織中的表達顯著低于正常組織（P＜0.001），與TCGA 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果相同，其表達的降低與胃癌患者病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分型顯著相關(guān)（P值均＜0.001），與其他研究者的結(jié)論一致［25］，這些研究結(jié)果表明miR-29c 有可能成為胃癌的診斷、預后生物標志物及治療靶點。本研究通過對miR-29c 的潛在靶基因進行富集分析，發(fā)現(xiàn)miR-29c 可能具有DNA 甲基化活化、干擾相關(guān)蛋白合成等生物學功能，參與PI3K-AKT 等信號通路的激活。miR-29c 參與的這些細胞功能及信號通路已有許多得到了文獻證實［6，26-28］，但是本研究仍有部分局限性，僅從組織學層面證明miR-29c 表達與臨床病理特征的密切關(guān)系，未能從細胞層面進一步探討其作用機制。

總之，miRNAscope 技術(shù)能更靈敏地檢測石蠟組織中的微量miRNA 的表達，miR-29c 在胃癌組織中低表達，與患者TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分型顯著相關(guān)，miR-29c 可能參與胃癌發(fā)生發(fā)展，進一步的深入研究或能證實miR-29c 可成為胃癌患者診斷、預后的標記物及潛在的分子治療靶點。

作者貢獻度說明：

黃幼生：設(shè)計研究思路，張永芳：完成實驗，撰寫論文，李京城：分析數(shù)據(jù)，解娜：參與研究思路和稿件撰寫，黃幼生、陳艷、陳俊明：幫助修改文章。

所有作者不存在利益沖突。