汪勝勇 陳宇航 陳會(huì)麗 黃鈺杰 張嘯天 丁雙成 王宏偉

水稻減數(shù)分裂期高溫對(duì)苯丙烷類代謝及下游分支代謝途徑的影響

汪勝勇1陳宇航1陳會(huì)麗1黃鈺杰1張嘯天1丁雙成2,*王宏偉1,*

[1農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長(zhǎng)江中游作物綠色高效生產(chǎn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(部省共建)/長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心/長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025；*通信聯(lián)系人，email: shchding@yangtzeu.edu.cn; wanghw@yangtzeu.edu.cn]

【目的】探究水稻減數(shù)分裂期高溫如何影響苯丙烷類代謝，并分析其與水稻耐熱性的關(guān)系?！痉椒ā恳訬22、廣陸矮15、SDWG005、全兩優(yōu)681、Y兩優(yōu)900、Y兩優(yōu)1號(hào)、兩優(yōu)培九和綿恢101(MH101)等8種耐熱和不耐熱水稻品種為試驗(yàn)材料，設(shè)置常溫和高溫處理，分析減數(shù)分裂期高溫脅迫對(duì)水稻的花粉活力與苯丙烷類代謝關(guān)鍵酶活性、木質(zhì)素、總黃酮及總酚等主要代謝產(chǎn)物含量之間的相關(guān)性；并進(jìn)一步選擇極端耐高溫的SDWG005和極端不耐高溫的MH101為材料分析苯丙烷類代謝、碳水化合物代謝和抗氧化系統(tǒng)對(duì)水稻耐熱性的影響?！窘Y(jié)果】1) 與對(duì)照相比，高溫顯著降低水稻花粉活力和穎花受精率，不同的水稻品種受高溫影響后，花粉活力和穎花受精率的降幅不同。2) 高溫顯著增加穎花中肉桂酸-4-羥化酶和4-香豆酸輔酶A連接酶活性以及木質(zhì)素、總黃酮和總酚的含量，且耐熱品種增幅高于敏感品種。3) 高溫下花粉活力與肉桂酸-4-羥化酶活性、木質(zhì)素含量顯著相關(guān)，穎花受精率與木質(zhì)素含量以及木質(zhì)素含量與類黃酮含量極顯著相關(guān)。4) 與MH101相比，SDWG005小穗穎殼中木質(zhì)素受高溫顯著誘導(dǎo)積累，且高溫下能夠維持較高細(xì)胞壁過(guò)氧化物酶活性。5) 與MH101相比，SDWG005穎花在高溫下能夠維持較高過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶和抗壞血酸氧化酶活性，進(jìn)而減少穎花中過(guò)氧化氫和丙二醛的積累。高溫下SDWG005穎花中淀粉含量更高，酸性轉(zhuǎn)化酶、蔗糖合酶及ATPase基因的表達(dá)量顯著增加?！窘Y(jié)論】減數(shù)分裂期高溫促進(jìn)穎花中苯丙烷類代謝關(guān)鍵酶活性的上升和代謝產(chǎn)物含量的增加，耐熱品種高溫下能夠積累較多的木質(zhì)素和類黃酮，具有較高抗氧化酶活性，同時(shí)蔗糖代謝和能量產(chǎn)生效率較高，從而具有較強(qiáng)的耐熱性。

水稻；高溫；穎花；苯丙烷類代謝；木質(zhì)素；總黃酮

水稻是主要糧食作物之一，世界一半人口以稻米為主食。高溫是影響我國(guó)水稻產(chǎn)量潛力發(fā)揮與品質(zhì)穩(wěn)定性的最主要生態(tài)因子之一[1]。據(jù)IPCC第六次評(píng)估報(bào)告，預(yù)計(jì)21世紀(jì)全球氣溫上升將達(dá)到或超過(guò)1.5℃，氣候變暖將導(dǎo)致水稻生長(zhǎng)季溫度升高[2,3]。研究表明，抽穗期和開(kāi)花期是高溫脅迫導(dǎo)致結(jié)實(shí)率降低的敏感時(shí)期[4]，開(kāi)花當(dāng)天的溫度高于35℃，持續(xù)時(shí)間超過(guò)2 h就會(huì)引起穎花育性下降，嚴(yán)重影響結(jié)實(shí)率；水稻生殖期最低溫度每上升1℃，水稻產(chǎn)量將下降10%[5, 6]。而水稻花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期遭遇持續(xù)高溫會(huì)使花藥內(nèi)壁絨氈層提前降解，花粉活力降低，同時(shí)會(huì)降低花粉的附著率和萌發(fā)率，嚴(yán)重影響水稻的結(jié)實(shí)率[7,8]。因此，解析水稻高溫花器官育性傷害機(jī)理及其調(diào)控機(jī)制，對(duì)水稻熱害防御、耐熱栽培及品種改良具有重要意義。

花器官受高溫脅迫傷害程度最大，高溫嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量的形成[9,10]。高溫脅迫既能影響絨氈層正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理，阻礙花藥成熟和開(kāi)裂，又能阻礙花粉在柱頭上萌發(fā)、花粉管伸長(zhǎng)，從而影響受精過(guò)程[11-17]。高溫可降低抗氧化酶活性，影響活性氧(ROS)穩(wěn)態(tài)，引起氧化脅迫并干擾小孢子時(shí)期活性氧介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡過(guò)程[18-20]。高溫脅迫能夠引起糖代謝和能量利用紊亂，Parish等[21]還指出，糖積累不足導(dǎo)致花粉育性顯著降低，淀粉的正常積累是決定花粉育性的重要指標(biāo)。蔗糖合酶和蔗糖轉(zhuǎn)化酶是植物體內(nèi)蔗糖分解途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵酶，高溫脅迫下蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性顯著降低，蔗糖降解途徑受阻，可能是導(dǎo)致花粉中淀粉積累量下降的主要原因[22, 23]。

莽草酸途徑是連接初級(jí)代謝和次級(jí)代謝的主要橋梁，其起始物是磷酸戊糖途徑的中間產(chǎn)物4-磷酸赤蘚糖和糖酵解的中間產(chǎn)物磷酸烯醇式丙酮酸。而莽草酸的終產(chǎn)物分支酸可以進(jìn)入苯丙烷代謝途徑形成木質(zhì)素、類黃酮等芳香族化合物，因此苯丙烷代謝與糖代謝密切相關(guān)[24]。一些研究表明，木質(zhì)素生物合成的碳源是由D-葡萄糖提供的[25]，外源可代謝糖類能夠促進(jìn)擬南芥和梨愈傷組織的木質(zhì)素積累[26,27]。比如，柳枝稷中過(guò)量表達(dá)蔗糖合酶PvSUS1，木質(zhì)素含量會(huì)升高[28]，但在逆境條件下，糖代謝和苯丙烷代謝之間的關(guān)系報(bào)道較少。

苯丙烷類代謝是植物最重要的次生代謝途徑之一，起始反應(yīng)由苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羥化酶和4-香豆酸輔酶A連接酶催化，進(jìn)而產(chǎn)生木質(zhì)素和類黃酮兩類最主要的分支代謝產(chǎn)物[29]。黃酮類化合物作為重要抗氧化物質(zhì)，在植物非生物脅迫響應(yīng)中起著重要作用。研究表明，黃酮醇可通過(guò)調(diào)節(jié)高溫脅迫下ROS穩(wěn)態(tài)來(lái)控制番茄花粉管的生長(zhǎng)和完整性[23]。木質(zhì)素是花藥壁的重要組成成分，參與抵抗非生物脅迫，上調(diào)木質(zhì)素生物合成基因的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致木質(zhì)素沉積，次生細(xì)胞壁增厚，增強(qiáng)植物抗逆性[29-31]，參與木質(zhì)素單體氧化聚合為木質(zhì)素的主要為第Ⅲ類PODs，且分為可溶性及結(jié)合態(tài)。其中NADH-POD以NADH為底物產(chǎn)生過(guò)氧化氫，而G-POD以愈創(chuàng)木酚為底物，通過(guò)消耗過(guò)氧化氫來(lái)催化細(xì)胞壁中木質(zhì)素的合成[32]。Dong等[33]發(fā)現(xiàn)水稻UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶GSA1通過(guò)調(diào)控苯丙烷類代謝途徑，促進(jìn)黃酮類物質(zhì)積累，增強(qiáng)水稻耐熱性。目前，高溫脅迫對(duì)水稻花器官次生代謝的影響相關(guān)研究報(bào)道較少。高溫脅迫如何影響水稻穎花中苯丙烷類代謝通路以及代謝產(chǎn)物木質(zhì)素和類黃酮的形成，這兩種代謝產(chǎn)物如何參與調(diào)控水稻耐熱性的生理基礎(chǔ)也不清楚。為此，本研究以前期篩選的8份耐熱性差異水稻品種為材料，研究高溫對(duì)苯丙烷類代謝關(guān)鍵酶、代謝產(chǎn)物以及其與育性指標(biāo)之間的關(guān)系，并進(jìn)一步選擇極端耐高溫的SDWG005和極端不耐高溫的綿恢101來(lái)分析高溫通過(guò)苯丙烷類代謝調(diào)控耐熱性的生理機(jī)制，以期為豐富水稻耐熱機(jī)理和品種選育提供理論基礎(chǔ)及技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021年和2022年在長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)基地進(jìn)行，供試材料選用廣陸矮15(常規(guī)秈稻)、綿恢101(常規(guī)秈稻，對(duì)高溫極端敏感)、SDWG005(非洲常規(guī)稻，極端耐高溫)、N22(非洲稻)、全兩優(yōu)681(雜交秈稻)、Y兩優(yōu)900(雜交秈稻)、Y兩優(yōu)1號(hào)(雜交秈稻)和兩優(yōu)培九(雜交秈稻)。盆栽實(shí)驗(yàn)用桶為內(nèi)徑30 cm、高32 cm的塑料桶。供試土壤為0－20 cm的稻田表層土，經(jīng)風(fēng)干后過(guò)4 mm篩，12.5 kg/桶，均勻拌入10 g復(fù)合肥(N∶P2O5∶K2O=26∶10∶15)。采用積溫法調(diào)整播種日期以使各水稻品種的抽穗開(kāi)花期基本一致，于大田播種育秧20 d后選取生長(zhǎng)一致且健壯的幼苗移栽，移栽時(shí)植株沿桶壁栽培成圓形，距桶邊緣大約2 cm，每桶20株，每個(gè)品種每處理設(shè)置20盆，在水稻生長(zhǎng)過(guò)程中定期剪除分蘗，只留主莖。

1.2 處理設(shè)置

利用日光型人工氣候室(型號(hào) AGC-MR，浙江求是人工環(huán)境有限公司)模擬大田晝夜溫度變化，設(shè)置常溫(CK)和高溫(HT)兩個(gè)溫度水平，濕度為恒濕模式(75%)，溫度的具體變化過(guò)程見(jiàn)圖 1。CK和HT的日最高氣溫和日平均氣溫分別為26℃和23.5℃、38℃和33.5℃。于各水稻減數(shù)分裂期分別移入人工氣候室中進(jìn)行不同溫度處理。為保證所取水稻的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程和處理?xiàng)l件一致，于CK和HT處理的當(dāng)天對(duì)發(fā)育進(jìn)程基本一致的稻穗(葉枕距約為2 cm)進(jìn)行掛牌標(biāo)記，處理5 d后將水稻植株均放置在適溫條件下繼續(xù)生長(zhǎng)直到成熟。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 水稻花粉活力和穎花受精率統(tǒng)計(jì)

在水稻開(kāi)花期，剝?nèi)∥撮_(kāi)放穎花的花藥，進(jìn)行1% KI/I2染色，隨后于光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)花粉活力。花粉活力(%)=染色花粉數(shù)×100/總花粉粒數(shù)。在水稻成熟期考查穎花受精率，凡有結(jié)實(shí)觸感的飽粒和癟粒均計(jì)為受精粒，其余計(jì)為非受精粒，穎花受精率(%)=受精粒數(shù)×100/總粒數(shù)。

1.3.2 苯丙烷類代謝途徑中關(guān)鍵酶活性測(cè)定

待HT處理結(jié)束后，剝?nèi)炫茦?biāo)記稻株的幼穗，每個(gè)品種每種處理取樣15穗，3次重復(fù)。用液氮冷凍處理并移至?80℃冰柜中備用。參照Liu等[34]的方法測(cè)定苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonia -lyase, PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(cinnamate 4-hydroxylase, C4H)和4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate：coenzyme A ligase, 4CL)的活性。取冷凍小穗(0.1 g)并研磨成粉末，使用PAL提取液[50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 8.8)，2%(/)聚乙烯吡咯烷酮，5 mmol/L β-巰基乙醇]、C4H提取液[50 mmol/L Tris-HCl，4 mmol/L MgCl2，15 mmol/L β-巰基乙醇，10 μmol/L 亮抑蛋白酶肽，5 mmol/L L-抗壞血酸，1 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)，0.1%(/)PVPP和10%(/)甘油]、4CL提取液[0.2 mol/L Tris-HCl(PH 7.5)，25%甘油，0.1 mol/L 二硫蘇糖醇]進(jìn)行處理。將適量提取液加入分裝樣品中，在4℃的搖床中以250 r/min提取1 h，然后在離心機(jī)中12 000下離心30 min，取上清酶液。

PAL活性測(cè)定：取250 μL 粗酶提取物，加入250 μL含有0.02 mol/L 苯丙氨酸的50 mmol/L硼酸緩沖液(pH 8.8)，用50 mmol/L硼酸緩沖液(pH 8.8)補(bǔ)足至1 mL，對(duì)照組使用滅活酶溶液，將混合物在37℃下孵育1 h，加入50 μL 6 mol/L 鹽酸停止反應(yīng)。測(cè)定PAL在290 nm處的吸光度。

C4H活性測(cè)定：將200 μL 酶提取物加入2 mL 反應(yīng)液(8 μmol/L 反式肉桂酸，3 μmol/L NADPNa2，6 μmol/L G-6-PNa2，50 mmol/L Tris-HCl)，在25℃下孵育30 min，加入100 μL 6 mol/L 鹽酸停止反應(yīng)，在340 nm處測(cè)定吸光值。

4CL活性測(cè)定：將0.5 mL 粗酶提取物加入到0.45 mL 75 mmol/L MgCl2，0.15 mL 1 μmol/L 輔酶A，0.15 mL 0.8 mmol/L ATP和0.15 mL 2 mmol/L對(duì)香豆酸混合的反應(yīng)溶液中，并在333 nm處測(cè)量4CL的活性。

圖1 常溫與高溫人工氣候室的溫度設(shè)置

表1 基因表達(dá)分析使用的引物

1.3.4 木質(zhì)素、總黃酮和總酚含量測(cè)定

參照張水明等[35]的方法采用巰基乙酸法測(cè)定木質(zhì)素含量。采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法[36]，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定總黃酮含量。利用福林-酚法，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定總酚含量。

1.3.5 抗氧化物酶活性、過(guò)氧化氫、丙二醛和ATP含量測(cè)定

過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶的酶活性測(cè)定參照王成章等的方法[37]?？箟难嵫趸傅幕钚詼y(cè)定參照NaKano等的方法[38]。丙二醛含量使用索萊寶丙二醛含量檢測(cè)試劑盒(BC0020)測(cè)定。過(guò)氧化氫含量測(cè)定使用索萊寶的過(guò)氧化氫含量檢測(cè)試劑盒(BC3590)。ATP含量使用索萊寶ATP含量檢測(cè)試劑盒(BC0305)測(cè)定。

1.3.6 碳水化合物含量測(cè)定和蔗糖代謝基因表達(dá)水平分析

參照李光彥[39]的方法，分別取0.5 g 綿恢101和SDWG005冷凍小穗粉末，測(cè)定可溶性糖、可溶性淀粉和非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的含量。稱取1 g 綿恢101和SDWG005的冷凍小穗粉末，Trizol法提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以水稻為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系包括cDNA模板1 μL(約80 ng)、上游引物及下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)、10 μL熒光定量反應(yīng)液(2 × Universal SYBR Green FAST PCR Mix)。采用2法對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，使用引物如表1所示。

1.3.7 細(xì)胞壁氧化酶活性測(cè)定

細(xì)胞壁游離態(tài)和結(jié)合態(tài)愈創(chuàng)木酚過(guò)氧化物酶的活性測(cè)定參照劉清泉[40]的方法進(jìn)行，略有修改。取0.1 g冷凍小穗粉末，加入2 mL蛋白質(zhì)提取液(25 mmol/L MOPS，pH 7.0，200 mmol/L CaCl2)研磨，12000×下低溫離心15 min，上清液為粗蛋白提取液，用于測(cè)定細(xì)胞壁游離態(tài)愈創(chuàng)木酚過(guò)氧化物酶。離心得到的沉淀用蛋白質(zhì)提取液洗滌3次，棄上清液，加入10倍沉淀體積的含1%纖維素酶、0.1%果膠酶的0.1 mol/L乙酸緩沖液(pH 5.6)水解過(guò)夜，12000×下低溫離心取上清液，用于測(cè)定細(xì)胞壁結(jié)合態(tài)愈創(chuàng)木酚過(guò)氧化物酶的酶活性。漆酶的活性測(cè)定使用索萊寶的漆酶活性檢測(cè)試劑盒(BC1630)進(jìn)行。

1.3.8 間苯三酚染色

取CK和HT處理5 d水稻幼穗中部的穎殼進(jìn)行木質(zhì)素間苯三酚染色，按照上海源葉木質(zhì)素間苯三酚染色液(R30443)使用說(shuō)明進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010整理數(shù)據(jù)，SAS 9.2統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，Microsoft Excel 2010繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 減數(shù)分裂期高溫脅迫對(duì)水稻花粉活力和穎花受精率的影響

圖2-A顯示，HT顯著降低了8個(gè)水稻品種的花粉活力，其中降幅最小的品種為N22，降幅3.9個(gè)百分點(diǎn)；其次是全兩優(yōu)681，降幅為5.0個(gè)百分點(diǎn)；綿恢101降幅最大，高達(dá)39.4個(gè)百分點(diǎn)。圖2-B顯示，除N22以外，HT顯著降低了其余7個(gè)水稻品種的穎花受精率，其中，廣陸矮15、SDWG005、N22和全兩優(yōu)681的穎花受精率降幅小于其他品種，分別為25.6、17.7、8.8和23.1個(gè)百分點(diǎn)，綿恢101、兩優(yōu)培九、Y兩優(yōu)900和Y兩優(yōu)1號(hào)的穎花受精率降幅均超過(guò)30個(gè)百分點(diǎn)，其中綿恢101降幅最大，高達(dá)60.7個(gè)百分點(diǎn)。結(jié)合穎花受精率和花粉活力數(shù)據(jù)比較基因型間的差異，可以認(rèn)定N22、廣陸矮15、sDWG005和全兩優(yōu)681為耐熱品種，兩優(yōu)培九、Y兩優(yōu)900、Y兩優(yōu)1號(hào)和綿恢101是熱敏感品種。

2.2 減數(shù)分裂期高溫脅迫對(duì)穎花中苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羥化酶和4-香豆酸輔酶A連接酶活性的影響

圖3-A顯示，在CK處理下，N22的苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活性最高，其次是廣陸矮15；高溫處理后，N22和全兩優(yōu)681的PAL活性顯著降低，SDWG005的PAL酶活性大幅度增加，相比于CK處理增加了45.48%。敏感品種的PAL酶活性在高溫前后無(wú)變化或變化幅度較小。由圖3-B和3-C可知，在HT處理下，肉桂酸-4-羥化酶(C4H)和4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)活性在不同水稻品種間均有不同幅度上升，耐性品種的C4H和4CL酶活性增幅總體上高于敏感品種，其中敏感品種綿恢101的C4H和4CL酶活性在CK和HT下均顯著低于耐性品種。以上說(shuō)明，減數(shù)分裂期高溫脅迫主要影響肉桂酸-4-羥化酶和4-香豆酸輔酶A連接酶的活性，且耐性品種和敏感品種間存在顯著差異。

GLA15－廣陸矮15；QLY681－全兩優(yōu)681；LYP9－兩優(yōu)培九；YLY900－Y兩優(yōu)900；YLY1－Y兩優(yōu)1號(hào)；MH101－綿恢101。平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n = 3，柱狀圖上不同小寫(xiě)字母表示不同品種及處理間差異達(dá)5%顯著水平。下同。

圖3 不同水稻品種減數(shù)分裂期高溫處理下苯丙烷類代謝途徑關(guān)鍵酶活性比較

2.3 減數(shù)分裂期高溫脅迫對(duì)穎花木質(zhì)素、總黃酮和總酚含量的影響

如圖4-A所示，高溫處理下8個(gè)水稻品種的木質(zhì)素含量均顯著增加，相比CK增加了約0.4～2.5倍，其中耐性品種增幅總體大于敏感性品種?？傸S酮含量也受到高溫脅迫的影響，除N22增幅不明顯外，其他品種均有不同幅度的增加，綿恢101增加了24.8%，廣陸矮15、SDWG005和全兩優(yōu)681分別增加了33.8%、42.1%和41.9%，HT下耐性品種總黃酮含量增幅總體顯著高于敏感品種(圖4-B)。圖4-C顯示，除N22外，高溫處理下其余7個(gè)水稻品種穎花中總酚含量均有增加，廣陸矮15增幅最大，高達(dá)69.4%。以上說(shuō)明減數(shù)分裂期高溫促進(jìn)了穎花中苯丙烷類代謝通路中三類主要代謝產(chǎn)物積累，特別是木質(zhì)素和總黃酮含量，二者在耐性品種和敏感性品種間增幅差異顯著。

圖4 不同水稻品種減數(shù)分裂期高溫處理下穎花木質(zhì)素、總黃酮和總酚含量的比較

表2 CK和HT處理下苯丙烷類代謝及下游分支代謝途徑相關(guān)指標(biāo)相關(guān)性分析

為進(jìn)一步明確哪一種代謝產(chǎn)物與高溫結(jié)實(shí)傷害關(guān)聯(lián)最顯著，我們將花粉活力、穎花受精率、苯丙氨酸解氨酶活性、肉桂酸-4-羥化酶活性、4-香豆酸輔酶A連接酶活性、總酚含量、總黃酮含量、木質(zhì)素含量等指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。分析結(jié)果顯示CK處理下苯丙氨酸解氨酶活性和4-香豆酸輔酶A連接酶活性與總酚、總黃酮和木質(zhì)素等三種代謝產(chǎn)物含量均極顯著相關(guān)，肉桂酸-4-羥化酶活性與總酚含量也極顯著相關(guān)，但是花粉活力和穎花受精率均與關(guān)鍵酶活性(苯丙氨酸解氨酶活性、肉桂酸-4-羥化酶活性和4-香豆酸輔酶A連接酶活性)和代謝產(chǎn)物(總酚、總黃酮和木質(zhì)素)含量相關(guān)不顯著(表2)。但是，高溫處理下，花粉活力與肉桂酸-4-羥化酶活性、木質(zhì)素含量極顯著相關(guān)，穎花受精率與木質(zhì)素含量也極顯著相關(guān)，木質(zhì)素含量與總黃酮含量極顯著相關(guān)(表2)。由此可見(jiàn)，高溫引起穎花中木質(zhì)素和總黃酮含量積累，且敏感性品種中積累水平較低，可能是影響高溫下水稻結(jié)實(shí)的一個(gè)重要因素。

2.4 減數(shù)分裂期高溫脅迫對(duì)穎花細(xì)胞壁過(guò)氧化物酶活性的影響

以高溫下苯丙烷類代謝通路具有顯著差異的水稻品種SDWG005和綿恢101為材料，進(jìn)一步分析減數(shù)分裂期高溫如何影響木質(zhì)素積累。如圖5所示，間苯三酚染色顯示高溫處理促進(jìn)了水稻小穗穎殼木質(zhì)素積累，且SDWG005木質(zhì)化水平高于綿恢101。木質(zhì)素氧化聚合依靠相關(guān)細(xì)胞壁氧化物酶作用，高溫顯著增加了以H2O2為底物的愈木創(chuàng)酚過(guò)氧化物酶活性，SDWG005增幅大于綿恢101。穎花中以NADH為底物的NADH過(guò)氧化物酶活性在高溫下也受到激活，SDWG005中激活的是可溶態(tài)NADH過(guò)氧化物酶，綿恢101中激活的是細(xì)胞壁結(jié)合態(tài)NADH過(guò)氧化物酶。漆酶活性同樣受到高溫的影響，不同的是SDWG005穎花漆酶活性在高溫下無(wú)顯著變化，而綿恢101漆酶活性則受到顯著抑制(圖5)。以上說(shuō)明高溫下穎花中不同形態(tài)的過(guò)氧化物酶活性呈上升趨勢(shì)，且酶活性總體水平SDWG005高于綿恢101，因此，SDWG005木質(zhì)素積累水平較高。

柱狀圖上不同小寫(xiě)字母表示不同品種及處理間差異達(dá)5%顯著水平。

2.5 減數(shù)分裂期高溫脅迫對(duì)水稻穎花抗氧化系統(tǒng)、碳水化合物代謝和能量產(chǎn)生的影響

如圖6所示，高溫顯著增加了SDWG005穗部過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶活性。對(duì)綿恢101來(lái)說(shuō)，穗部過(guò)氧化物酶對(duì)減數(shù)分裂期高溫脅迫相對(duì)鈍感，超氧化物歧化酶活性甚至出現(xiàn)顯著降低。此外，SDWG005和綿恢101穗部抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中綿恢101降幅較大。因此，高溫脅迫下綿恢101穗部相比SDWG005積累了較多的過(guò)氧化氫和丙二醛含量(圖6)。

進(jìn)一步測(cè)定耐性品種和敏感性品種高溫處理下穗部碳水化合物含量。如圖6所示，高溫促進(jìn)了可溶性糖、可溶性淀粉和非結(jié)構(gòu)性碳水化合物等的積累，可溶性糖含量綿恢101增幅大于SDWG005，但是可溶性淀粉和非結(jié)構(gòu)性碳水化合物綿恢101增幅均小于SDWG005。通過(guò)熒光定量PCR分析穎花蔗糖代謝關(guān)鍵基因和表達(dá)水平，結(jié)果顯示SDWG005穎花中的基因表達(dá)在高溫下受到誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，而綿恢101穎花中的基因表達(dá)在高溫下受到明顯抑制。此外，饑餓響應(yīng)基因和受高溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，表達(dá)并不受高溫的影響，且的表達(dá)在SDWG005中上調(diào)幅度顯著大于綿恢101，SDWG005 的ATP含量在高溫下顯著增加，而綿恢101增加不顯著。以上說(shuō)明減數(shù)分裂期高溫影響了敏感性品種綿恢101穎花淀粉積累水平和能量水平，這可能是高溫引起敏感性品種產(chǎn)生結(jié)實(shí)傷害的原因之一。

3 討論

不同的水稻品種產(chǎn)量是由其作物遺傳特性決定的[41]。而高溫作為一種非生物脅迫，能夠極大地影響水稻正常的生長(zhǎng)發(fā)育，并影響其產(chǎn)量。其中，水稻在生殖生長(zhǎng)階段對(duì)高溫脅迫較為敏感，特別是減數(shù)分裂期花粉形成過(guò)程中高溫通過(guò)影響花粉發(fā)育過(guò)程中的物質(zhì)和能量代謝，引起花粉敗育，進(jìn)而影響授粉受精過(guò)程，導(dǎo)致結(jié)實(shí)率下降，但品種間耐熱性存在顯著差異[42,43]。本研究發(fā)現(xiàn)不同的水稻品種在高溫脅迫下表現(xiàn)出花粉活力和穎花受精率的變化，其中N22、廣陸矮15、SDWG005對(duì)高溫的耐受性較高，而綿恢101對(duì)溫度極為敏感。目前對(duì)于不同品種水稻的耐熱機(jī)制研究較少。前人研究表明，外施水楊酸(SA)能顯著增加水稻的耐熱性，減緩花藥抗氧化酶活性的下降，減少花藥中ROS及MDA含量的上升，從而減少花藥絨氈層細(xì)胞程序性死亡(PCD)的產(chǎn)生，減輕高溫下花粉粒敗育[44]。SA合成關(guān)鍵酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)和4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)共同引導(dǎo)上游產(chǎn)物進(jìn)入苯丙烷類代謝途徑下游分支[45]，其中木質(zhì)素和類黃酮分別為兩個(gè)分支的代謝產(chǎn)物，在非生物脅迫中其著重要作用[29,46]。目前對(duì)苯丙烷代謝響應(yīng)非生物脅迫的研究較多，木質(zhì)素和類黃酮含量的變化會(huì)引起花粉育性的改變[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，水稻中苯丙烷代謝產(chǎn)物在高溫脅迫后加速積累，耐高溫材料的苯丙烷代謝產(chǎn)物的含量在高溫處理下相比于敏感材料高出不少，并且不同水稻品種的苯丙烷代謝產(chǎn)物積累量與水稻的育性指標(biāo)呈正相關(guān)。進(jìn)一步分析表明，苯丙烷代謝上游途徑中的肉桂酸-4-羥化酶和4-香豆酸輔酶A連接酶受到高溫的顯著誘導(dǎo)，說(shuō)明了上游關(guān)鍵酶的活性是苯丙烷代謝產(chǎn)物積累的關(guān)鍵原因，然而作為水楊酸合成關(guān)鍵酶的苯丙氨酸解氨酶的活性在高溫下并沒(méi)有顯著變化，推測(cè)這可能是由于在植物中水楊酸合成途徑主要是異分支酸合成酶途徑(ICS)，而非苯丙氨酸解氨酶途徑(PAL)[47]，同時(shí)有研究表明酚類物質(zhì)的合成一般不受PAL活性的控制，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[48]。木質(zhì)素是花藥細(xì)胞壁的組成成分之一，由木質(zhì)素單體在細(xì)胞壁氧化酶和漆酶的催化下聚合而成[32]。本研究發(fā)現(xiàn)敏感材料的漆酶活性受到了抑制，而抗性材料的漆酶活性無(wú)顯著變化，但細(xì)胞壁過(guò)氧化物酶活性顯著提升，這有利于木質(zhì)素的合成以維持花藥細(xì)胞壁的形成。同時(shí)，在形成木質(zhì)素的過(guò)程中，細(xì)胞壁過(guò)氧化物酶也會(huì)消耗更多的過(guò)氧化氫，有利于水稻在高溫下的生長(zhǎng)。有研究指出，黃酮類化合物是一類重要的抗氧化物質(zhì)，可以激活抗氧化酶活性以及清除過(guò)量的ROS，維持正常的花粉育性及花粉管的生長(zhǎng)[30]。本研究發(fā)現(xiàn)耐性品種在高溫處理下具有更高的抗氧化酶活性，較少的H2O2和MDA含量。說(shuō)明耐熱品種在積累更多的木質(zhì)素和類黃酮的過(guò)程中，水稻花粉ROS穩(wěn)態(tài)受到影響，維持了較高的花粉育性。

可溶性糖作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞具有滲透調(diào)節(jié)及保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用。苯丙烷類代謝初產(chǎn)物苯丙氨酸由糖代謝中的莽草酸途徑產(chǎn)生，苯丙烷類代謝途徑與糖代謝聯(lián)系緊密。有研究指出，糖代謝能夠?yàn)楸奖轭惔x提供碳骨架，間接參與苯丙烷類代謝途徑[24]。本研究觀察到，高溫顯著增加穎花中可溶性糖、可溶性淀粉和非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的含量，說(shuō)明糖類有助于水稻在熱應(yīng)激下正常生長(zhǎng)，但是敏感材料綿恢101的可溶性糖增幅大于抗性材料SDWG005。一方面可能是由于熱應(yīng)激下為苯丙烷類代謝途徑提供底物消耗，另一方面由于蔗糖轉(zhuǎn)化酶()基因受高溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。前人研究表明，蔗糖合酶和轉(zhuǎn)化酶受到抑制會(huì)導(dǎo)致植物的育性指標(biāo)下降[49]，這與我們發(fā)現(xiàn)SDWG005中這兩種酶基因表達(dá)量較高，花粉活力比綿恢101高具有一致性。研究表明，SnRK1和TOR蛋白激酶作為能量管理的樞紐，逆境條件下?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足或能量缺乏時(shí)SnRK1被激活抑制植株生長(zhǎng)以減少消耗能量的合成代謝，而TOR在能量充足時(shí)刺激生物合成代謝[50,51]。能量代謝是植物體現(xiàn)對(duì)逆境環(huán)境耐受性的一方面，能量不足會(huì)導(dǎo)致植物抗逆性下降[52]。高溫處理下和基因表達(dá)量增加，基因表達(dá)量無(wú)顯著變化，說(shuō)明高溫導(dǎo)致穎花中碳水化合物代謝受阻，能量處于缺乏狀態(tài)。SDWG005中基因表達(dá)量顯著增加，而綿恢101中基因表達(dá)量增幅較小，也說(shuō)明在高溫?zé)岷ο履托云贩N仍具有較高的能量水平，能夠?yàn)樘岣呖寡趸芰μ峁┏渥愕哪芰?，最終增強(qiáng)水稻耐熱性。

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Effects of High Temperature on Phenylpropane Metabolism and Downstream Branch Metabolic Pathways in Rice Meiosis

WANG Shengyong1, CHEN Yuhang1, CHEN Huili1, HUANG Yujie1, ZHANG Xiaotian1, DING Shuangcheng2,*, WANG Hongwei1,*

[MARA Key Laboratory of Sustainable Crop Production in the Middle Reaches of the Yangtze River (Co-construction by Ministry and Province)/College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434025, China; Engineering Research Center of Ecology and Agricultural Use of Wetland, Ministry of Education/ College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434025, China; Corresponding author, email: shchding@yangtzeu.edu.cn; wanghw@yangtzeu.edu.cn]

【Objective】Our purposes are to investigate how high temperature during rice meiosis affects phenylpropane metabolism and analyze its relationship with heat tolerance of rice. 【Methods】Eight rice varieties differed in heat tolerance including N22, GLA15 (Guanglu’ai 15), SDWG005, QLY681 (Quanliangyou 681), YLY900 (Y Liangyou 900), YLY1 (Y Liangyou 1), LYP9 (Liangyoupeijiu), and MH101 (Mianhui 101) were used as experimental materialsand exposed to room temperature and high temperature for 5 days. The correlations between activities of key enzymes in phenylpropane metabolism and main metabolite contents such as lignin, total flavonoids and total phenols were analyzed as well as the fertility of rice under high temperature stress during the meiotic stage. SDWG005 (heat resistant) and MH101 (heat sensitive) were used as experimental materials to analyze the effects of phenylpropane metabolism, carbohydrate metabolism and antioxidant defense system on heat tolerance of rice. 【Results】1) Compared with the control, the pollen vitality and fertilization rate of spikelets decreased significantly to various extents at high temperature. 2) HT(high temperature) significantly increased the activities of cinnamate-4-hydroxylase and 4-coumaric acid coenzyme A ligase, as well as the accumulation of lignin, flavonoids and total phenols in spikelets, with resistant varieties registering a higher growth than sensitive ones. 3) Correlation analysis showed that in response to HT pollen activity was significantly correlated with cinnamate-4-hydroxylase activity and lignin content, spikelet fertility was significantly correlated with lignin content, and lignin content was significantly correlated with flavonoid content. 4) Compared with MH101, lignin accumulation in the glumes of SDWG005 was significantly induced under HT. And higher cell wall peroxidase activities were maintained in SDWG005 under HT. 5) Compared with MH101, SDWG005 could maintain higher antioxidant enzyme activities under HT, resulting in less accumulation of H2O2and malondialdehyde. Under HT, the starch level in SDWG005 flowers was higher, and the expression levels of genes involved in acid invertase, sucrose synthase and ATPasewere significantly upregulated. 【Conclusion】High temperature stress increases the key enzyme activities and metabolite contents in the phenylpropanoid pathway in spikelets during the meiosis stage. The resistant variety accumulates more lignin and flavonoids during HT, has higher antioxidant enzyme activities, higher sucrose metabolism and energy utilization efficiency, thereby improving heat tolerance.

rice; high temperature; spikelet; phenylpropane metabolism; lignin; flavonoids

10.16819/j.1001-7216.2023.221112

2022-11-24；

2023-02-07。

濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心開(kāi)放基金資助項(xiàng)目（KFT202012）；主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心開(kāi)放基金資助項(xiàng)目（KFT202108）。