肖樂銓 李雷 戴偉民 強勝 宋小玲

轉(zhuǎn)基因水稻與雜草稻雜交后代的苗期生長特性

肖樂銓 李雷 戴偉民 強勝 宋小玲*

(南京農(nóng)業(yè)大學, 南京 210095;*通信聯(lián)系人, email: sxl@njau.edu.com)

【目的】考查轉(zhuǎn)基因水稻T2A-1與雜草稻的雜交后代苗期特性，為評估T2A-1抗性基因向雜草稻漂移可能引起的生態(tài)風險提供參考?！痉椒ā吭谒鄺l件下，以T2A-1、受體水稻明恢63(MH63)、來源于江蘇泰州、廣東茂名、湖南益陽的3種雜草稻（分別命名為WRTZ，WRMM，WRYY）及其雜交F1～F4為試驗材料（以T2A-1為父本或母本的攜帶轉(zhuǎn)基因的為抗性雜交后代，以受體水稻為父本或母本的為非抗性雜交后代），測定供試材料種子發(fā)芽力，幼苗在正常氮（40 mg/L）和低氮（20 mg/L）下的株高、整株干物質(zhì)量以及根長、不定根數(shù)、平均直徑等8個根系指標，計算根系總體發(fā)育指標，評價T2A-1與雜草稻抗性雜交后代的苗期生長特性?！窘Y(jié)果】抗性雜交后代的發(fā)芽力與非抗性雜交后代相當，但較雜草稻弱。在正常氮條件下，T2A-1與MH63以及抗性雜交后代與非抗性雜交后代的苗期生長指標相當；抗性雜交后代與相應雜草稻相比，WRMM雜交后代的株高顯著低于WRMM，但整株干物質(zhì)量與根系總體發(fā)育指標相當；WRYY雜交后代各苗期生長指標均與WRYY相當；WRTZ雜交后代株高顯著高于WRTZ，但整株干物質(zhì)量及根系指標均顯著低于WRTZ。在低氮環(huán)境下，抗性雜交后代各苗期生長指標均顯著低于或相當于非抗性雜交后代；抗性和非抗性雜交后代的相對根系發(fā)育指標均顯著低于相應的雜草稻?！窘Y(jié)論】T2A-1與雜草稻的抗性雜交后代的苗期生長特性在正常氮條件下相當于或低于親本雜草稻，但在低氮條件下，總體上均顯著弱于雜草稻。

復合性狀轉(zhuǎn)基因水稻；T2A-1；雜草稻；雜交后代；苗期生長特性；根系發(fā)育

水稻（L.）作為我國乃至全世界的主要糧食作物，其轉(zhuǎn)基因技術(shù)非常成熟。通過該技術(shù)已經(jīng)培育出抗除草劑、抗蟲、品質(zhì)改良的轉(zhuǎn)基因水稻。其中，華中農(nóng)業(yè)大學培育的轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻“汕優(yōu)63”和“華恢1號”兩次獲得我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部授予的生產(chǎn)安全證書。除單一性狀外，還成功培育出多種復合性狀轉(zhuǎn)基因水稻，特別是兼具抗除草劑和抗蟲性狀的轉(zhuǎn)基因水稻[1-3]。其中，華中農(nóng)業(yè)大學培育的轉(zhuǎn)的T2A-1對二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟表現(xiàn)出高抗，同時具有很好的抗草胺膦特性，農(nóng)藝性狀與受體明恢63基本一致，具有產(chǎn)業(yè)化前景[4-5]。

種植轉(zhuǎn)基因水稻存在潛在的生態(tài)風險，其中最值得關(guān)注的是抗性基因通過花粉漂移到同屬同種的雜草稻（weedy rice）。雜草稻是廣布世界水稻種植區(qū)的惡性雜草，具有較強的落粒性、休眠以及早熟特性，能逃脫人工收獲進入土壤種子庫來年繼續(xù)為害[6-11]。雜草稻種子萌發(fā)特性、苗期光合特性，以及對氮素的利用能力均強于栽培稻，在與栽培稻競爭中占據(jù)優(yōu)勢地位。一旦轉(zhuǎn)基因水稻通過花粉介導與雜草稻產(chǎn)生雜交后代，其中的抗性雜交后代因無法用目標除草劑防除而有可能成為田間難以防除的雜草[12-13]。但也有學者認為，對于轉(zhuǎn)基因安全評價需要講究風險效益平衡的原則。商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗除草劑和抗蟲水稻能提高雜草和靶標害蟲的防除效果，提高水稻產(chǎn)量。在合理使用除草劑的基礎上，抗除草劑水稻技術(shù)能為雜草稻的防除提供簡單有效的解決方法，同時也防止了外源基因向雜草稻的漂移，獲得的效益要遠大于風險。因此需要我們加以客觀分析和全面評價[14]。

雜草稻與栽培稻的親緣關(guān)系近，親和性極高，極易雜交，并能產(chǎn)生雜交后代[15-16]。前期研究發(fā)現(xiàn)田間T2A-1向供試江蘇泰州和湖南益陽的雜草稻發(fā)生基因漂移，漂移率為0.1103%～0.2065%[17]。一旦發(fā)生基因漂移，這些抗性雜交后代種子的萌發(fā)特性以及苗期生存競爭能力對其在自然界生存定植會有重要影響[18-19]。

種子萌發(fā)與幼苗的建立是植物生活史中的關(guān)鍵事件，種子萌發(fā)速度越快、越早生根和分蘗的幼苗，其不僅有較長的生長時間，且對環(huán)境資源的利用能力越強，因而具有競爭優(yōu)勢[20-23]。具有較高活力的水稻種子在田間中能夠快速、均勻發(fā)芽，在雜草生長的抑制下具有強大的幼苗發(fā)育能力[24-25]。因此，發(fā)芽快慢是決定幼苗競爭能力的重要因素。雜草稻比栽培水稻提前2～3 d萌發(fā)出苗是雜草稻苗期強競爭力的基礎[19, 26]。

植物根系是水分和養(yǎng)分吸收的主要器官，其形態(tài)和根系活力對土壤養(yǎng)分吸收有重要作用[27]。已有研究表明，相比栽培稻，雜草稻具有更強的根系，因而具有更強的競爭能力[19]。吳云艷[28]研究了雜草稻與栽培稻在盆栽混種條件下兩者的根部吸收養(yǎng)分能力，結(jié)果表明雜草稻根部吸收養(yǎng)分能力顯著強于栽培稻。Schaedler[29]研究在光競爭下雜草稻與栽培稻根系的初期生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對光的競爭一定程度上抑制了兩者的根系發(fā)育，但雜草稻根系發(fā)育仍然強于栽培稻。

雜草稻較強的根系使得其能夠高效利用氮肥。Burgos等[18]發(fā)現(xiàn)無氮肥施用時, 雜草稻與栽培稻的生物量相近，而施用氮肥后雜草稻莖稈的生物量迅速增加, 且顯著高于栽培稻。由此推測雜草稻具有更高的氮肥利用效率。吳云艷等[28]的研究表明, 雜草稻對氮肥的利用效率高于栽培稻，有些雜草稻對氮的利用甚至比栽培稻高出3倍。

轉(zhuǎn)基因水稻的基因通過花粉漂移到雜草稻后，雜交后代的種子萌發(fā)特性和苗期特性與雜草稻相比是否發(fā)生變化，在無選擇壓條件下，抗性基因?qū)﹄s交后代的苗期特性是否產(chǎn)生影響，這些問題尚不清楚。因此本研究以復合性狀轉(zhuǎn)基因水稻T2A-1、受體水稻明恢63(MH63)以及3種雜草稻的雜交后代為研究對象，研究其種子萌發(fā)特性以及在兩種氮素濃度條件下的苗期生長特性，為評價T2A-1與雜草稻發(fā)生基因漂移后可能產(chǎn)生的生態(tài)風險提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

復合性狀轉(zhuǎn)基因水稻T2A-1及其非轉(zhuǎn)基因受體水稻明恢63(MH63)由華中農(nóng)業(yè)大學提供，3種來源于廣東茂名(WRMM)、江蘇泰州(WRTZ)和湖南益陽(WRYY)的雜草稻由南京農(nóng)業(yè)大學雜草研究室試驗人員采集。T2A-1及MH63與3種雜草稻雜交的12種F1于2018年人工雜交獲得，F(xiàn)2、F3和F4由上一代植株自交獲得，供試材料均保存在?5℃冷庫中備用。

以T2A-1為親本的攜帶抗性基因的雜交后代稱為抗性雜交后代，表示為F1+、F2+、F3+和F4+；以MH63為親本的雜交后代稱為非抗性雜交后代，表示為F1?、F2?、F3?和F4?。試驗材料見表1和表2。

1.2 試驗設計

1.2.1 種子發(fā)芽力

試驗于南京農(nóng)業(yè)大學牌樓溫室進行。每個材料選取籽粒飽滿的種子每種100粒，放置于50℃烘箱中處理 48 h，打破種子休眠，將破休眠后的種子用75%酒精消毒浸種，之后把種子均勻擺放在墊有2層濾紙（用10 mL蒸餾水浸濕）的培養(yǎng)皿中，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（12 h光照）。每隔24 h統(tǒng)計一次種子發(fā)芽數(shù)，14 d后計算發(fā)芽勢與發(fā)芽指數(shù)。重復4次。

發(fā)芽勢=發(fā)芽峰期中發(fā)芽種子數(shù)/總種子數(shù)。發(fā)芽峰期指在規(guī)定期限的最初1/3期間內(nèi)種子發(fā)芽數(shù)之和。

發(fā)芽指數(shù)=∑t/t=當天的發(fā)芽數(shù)/發(fā)芽日數(shù)。待所有可發(fā)芽種子均發(fā)芽后，統(tǒng)計發(fā)芽率(發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/總發(fā)芽種子數(shù))。

在種子發(fā)芽高峰期（約培養(yǎng)3～4 d），從發(fā)芽的種子中選取萌發(fā)時間一致且芽長相似（小于1 cm）的種子，以T2A-1為父本的雜交后代的種子置于盛有40 mg/L的草胺膦溶液（18%的草胺膦可溶液劑，拜耳股份公司）的托盤中培養(yǎng)，并以T2A-1為對照，以T2A-1為母本的雜交后代和以MH63為親本的雜交后代種子置于盛有蒸餾水的托盤中培養(yǎng)，托盤均墊有2層濾紙，種子胚根浸入藥液或蒸餾水。培養(yǎng)溫度為28℃，相對濕度為70%～80%，光周期為光照12 h/黑暗12 h。

培養(yǎng)一周后，觀察以T2A-1為父本的雜交后代種子胚根和胚芽生長是否正常，能正常生長的植株采用基因特異性引物擴增的方法進行分子檢測，確認供試材料為攜帶抗性基因的雜交后代。對于以T2A-1為母本的雜交后代和以MH63為親本的雜交后代，因真雜交種擴增片段應包括雜草稻紅色果皮基因（）118 bp和栽培水稻白色果皮基因（）104 bp片段，采用和特異性引物擴增的方法對幼苗進行分子檢測[13]。

將真雜交種長勢一致的幼苗轉(zhuǎn)移至氮素營養(yǎng)液中培養(yǎng)15 d，培養(yǎng)溫度為白天35℃±5℃，夜間20℃±5℃，自然光照。水稻培養(yǎng)液設置低氮（20 mg/L）與正常氮（40 mg/L）2種處理，每種試驗材料重復4次。水稻培養(yǎng)液采用國際水稻所營養(yǎng)液配方。每種雜交后代均設置父本和母本作為對照處理。

1.2.2 根系發(fā)育指標測定

幼苗生長至15 d，使用根系掃描儀（LC-4800，LEGENTSYS-SINTEK，加拿大），測量所有供試材料總根長、種子根長、不定根數(shù)、最長三條不定根的平均長度、根系表面積、根平均直徑、根系體積、根總分支數(shù)。

1.2.3 株高、干物質(zhì)量測定

幼苗生長至15 d，測量所有供試材料株高，并放入烘箱中在60℃烘干24 h，測量所有供試材料整株干物質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

以處理為單位，運用SPSS 20.0中的Duncan新復極差測驗，比較抗性雜交后代（F+和RF+）與非抗性雜交后代（F?和RF?）或相應雜草稻的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)、株高、整株干物質(zhì)量和根系發(fā)育各指標的差異顯著性。

表1 水稻和雜草稻的來源和主要特征

表2 水稻和雜草稻的雜交后代

=1～4，表示F1、F2、F3和F4。

=1-4，means F1, F2, F3and F4.

以F?、RF?和3種雜草稻的根系發(fā)育指標為1，F(xiàn)+與RF+與它們的各項指標比值的平均值定義為相對根系發(fā)育指標。運用SPSS 20.0中的獨立樣本檢驗比較分析F+和RF+與相應的F?和RF?或雜草稻相對根系發(fā)育指標的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交后代與雜草稻種子發(fā)芽力比較

所有供試材料的發(fā)芽率均高于95%。在F1～F4發(fā)芽試驗中，所有抗性雜交后代與其非抗性雜交后代相比，發(fā)芽勢與發(fā)芽指數(shù)均無顯著差異（表3～表6）。

表3 雜草稻及與轉(zhuǎn)基因水稻T2A-1雜交F1的發(fā)芽力

采用Duncan新復極差測驗法分析F1和其相應雜草稻親本的種子發(fā)芽力，不同小寫字母表示同種雜草稻的雜交后代以及雜草稻之間的差異顯著性(<0.05，Mean±SE，=4)。

The germination ability of F1hybrids and their corresponding weedy rice were analyzed by Duncan's Multiple Range Test. The different lowercase letter means significant difference among F1hybrids of the same weedy rice and their corresponding weedy rice (< 0.05, Mean±SE,=4).

表4 雜草稻及與轉(zhuǎn)基因水稻T2A-1的雜交F2的發(fā)芽力

采用Duncan新復極差測驗法分析F2及其相應雜草稻親本的種子發(fā)芽力。不同小寫字母表示同種雜草稻的雜交后代以及雜草稻間的差異顯著性。<0.05，Mean±SE，=4。

The germination ability of F2hybrids and their corresponding weedy rice were analyzed by Duncan's Multiple Range Test. Different lowercase letters mean significant difference among F2hybrids from weedy rice and their corresponding weedy rice.<0.05, Mean±SE,=4.

以上結(jié)果說明對供試3種雜草稻的雜交后代，抗性基因的導入沒有改變雜交后代的發(fā)芽力。WRMM和WRYY雜交后代的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均顯著低于相應雜草稻，這說明它們的雜交后代種子發(fā)芽整齊度和發(fā)芽速率均低于其雜草稻；但WRTZ的雜交后代發(fā)芽勢與WRTZ相當，發(fā)芽指數(shù)均顯著低于WRTZ，這說明WRTZ雜交后代的發(fā)芽整齊度與其雜草稻相當，但發(fā)芽速率均低于其雜草稻。同種雜草稻雜交后代的發(fā)芽力并沒有隨代數(shù)的增加而發(fā)生明顯改變。

表5 雜草稻及其與轉(zhuǎn)基因水稻T2A-1的雜交F3的發(fā)芽力

采用Duncan新復極差測驗法分析F3和其相應雜草稻親本的種子發(fā)芽力。不同小寫字母表示同種雜草稻的雜交后代以及雜草稻間的差異顯著性。<0.05, Mean±SE,=4。

The germination ability of F3hybrids and their corresponding weedy rice were analyzed by Duncan's Multiple Range Test. Different lowercase letters mean significant difference among F3hybrids derived from the same weedy rice and their corresponding weedy rice.< 0.05, Mean±SE,=4.

表6 雜草稻及與轉(zhuǎn)基因水稻T2A-1的雜交F4的發(fā)芽力

采用Duncan新復極差測驗法分析F4和其相應雜草稻親本的種子發(fā)芽力，不同小寫字母表示同種雜草稻的雜交后代以及雜草稻之間的差異顯著性。< 0.05, Mean±SE,=4。

The germination ability of F4hybrids and their corresponding weedy rice were analyzed by Duncan's Multiple Range Test. Different lowercase letter mean significant difference among F4hybrids of the same weedy rice and their corresponding weedy rice.< 0.05, Mean±SE,=4.

2.2 雜交后代與雜草稻株高及整株干物質(zhì)量

正常氮和低氮環(huán)境下，所有抗性雜交后代與其非抗性雜交后代相比，株高與整株干物質(zhì)量均無顯著差異。與相應的雜草稻相比，F(xiàn)1～F4規(guī)律一致。正常氮條件下，F(xiàn)MM+和RFMM+的株高顯著低于其雜草稻W(wǎng)RMM，而整株干物質(zhì)量與雜草稻W(wǎng)RMM相當；FYY+和RFYY+的株高及干物質(zhì)量均與WRYY相當；FTZ+和RFnTZ+的株高顯著高于其雜草稻，但整株干物質(zhì)量顯著低于其雜草稻W(wǎng)RTZ（表7）。低氮條件下與相應雜草稻相比，F(xiàn)MM+和RFMM+的株高顯著低于WRMM，而整株干物質(zhì)量與WRMM相當；FYY+和RFYY+的株高顯著低于WRYY，但整株干物質(zhì)量與WRYY相當。FTZ+和RFTZ+的株高顯著高于WRTZ，但整株干物質(zhì)量顯著低于其雜草稻W(wǎng)RTZ。

除WRYY的雜交后代正常氮條件下株高與WRYY無顯著差異，而在低氮條件下顯著低于WRYY外，WRTZ雜交后代在正常氮條件與低氮條件下與相應雜草稻相比的趨勢一致，均表現(xiàn)雜交后代苗期整株干物質(zhì)量低于其雜草稻。相比而言，低氮條件下兩者的差異更為明顯。

2.3 雜交后代與雜草稻根系發(fā)育指標

正常氮條件下，所有抗性后代F+與非抗性后代F?相比，根系發(fā)育各指標均無顯著差異（圖1）。與相應雜草稻相比，F(xiàn)1～F4規(guī)律基本一致。FTZ+和RFTZ+的相對根系發(fā)育指標顯著低于WRTZ（圖2），這主要體現(xiàn)在除根平均直徑外，F(xiàn)TZ+和RFTZ+的其他根系發(fā)育指標包括種子根長、總根長、不定根數(shù)、根系表面積及根體積等均顯著低于WRTZ。FMM+和RFMM+以及FYY+和RFYY+的相對根系發(fā)育指標與其相應雜草稻均無顯著差異，但部分指標存在差異，其中FMM+和RFMM+的種子根長均顯著低于WRMM，F(xiàn)YY+和RFYY+的總根長低于WRYY。

低氮條件下，抗性后代F+與非抗性后代F?相比，規(guī)律并不完全一致。F1MM+、RF1MM+、F1YY+、RF2TZ+、RF2YY+、F3MM+、RF3MM+、F4MM+、RF4MM+以及RF4TZ+，這些抗性后代的相對根系發(fā)育指標均顯著低于相應的非抗性后代（圖1）。其他3種F1+、4種F2+和4種F3+以及3種F4+與相應的非抗性后代相對根系發(fā)育指標并無顯著差異。與相應的雜草稻相比，3種雜草稻的抗性雜交后代F+相對根系發(fā)育指標均顯著低于相應的雜草稻（圖2）。這主要體現(xiàn)在3種雜草稻的雜交后代的8個根系發(fā)育指標總體均顯著低于其相應的雜草稻。這說明即使在氮元素不足條件下，3種雜草稻根系發(fā)育受抑制情況輕于其抗性雜交后代。

表7 雜草稻及雜交后代的株高及干物質(zhì)量

采用Duncan新復極差測驗法分析雜交Fn和相應雜草稻親本的株高及干生物量, 不同小寫字母表示同種雜草稻的雜交后代以及雜草稻之間的差異顯著性。<0.05, Mean±SE,=4。

The plant height and whole plant dry biomass of Fnhybrid and its corresponding weedy rice were analyzed by Duncan's Multiple Range Test. Different lowercase letter mean significant difference among Fnhybrids of the same weedy rice and their corresponding weedy rice.< 0.05, Mean±SE,=4.

3 討論

3.1 種子發(fā)芽力

一年生植物開始于種子發(fā)芽，種子活力決定了其萌發(fā)率、出苗率、出苗整齊度，以及苗的健壯程度，也是其適應性的重要決定因子。衡量種子活力的指標有發(fā)芽率，種子發(fā)芽率較高，會給種群帶來數(shù)量上的優(yōu)勢，除發(fā)芽率外，表示種子發(fā)芽整齊度和發(fā)芽速率的發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)也是衡量種子活力的重要指標[30-31]。雜草稻具有較高的發(fā)芽勢是其在各種環(huán)境條件下迅速出苗，占據(jù)生存空間的主要原因。李振博等[32]研究溫度、pH 值、水勢及NaCl 脅迫對雜草稻與常規(guī)栽培稻發(fā)芽勢影響，發(fā)現(xiàn)在15℃低溫、pH值為6.0和8.0、?0.3 MPa水勢以及180 nmol/L NaCl等逆境條件下雜草稻的發(fā)芽勢均強于常規(guī)栽培稻。王楠等[33]研究發(fā)現(xiàn)雜草稻耐深播能力強，出苗能力好，甚至在地下16 cm也能萌發(fā)出土，與栽培稻相比具有明顯的優(yōu)勢。劉睿等[26]發(fā)現(xiàn)江蘇省6種雜草稻均比栽培稻早2 d發(fā)芽。本研究表明，T2A-1或受體水稻與雜草稻的雜交F1～F4盡管均具有較高的發(fā)芽率，但與相應雜草稻相比，無論是抗性雜交后代還是非抗性雜交后代的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)幾乎均低于相應的雜草稻，這意味著雜交后代比雜草稻的出苗能力降低，因而雜交后代在苗期占據(jù)生存空間上不具有優(yōu)勢。對于以T2A-1為父本的后代在存活植株中，均檢測到了429 bp基因和602 bp基因片段，說明這些后代均含有和基因。而以T2A-1為母本和以MH63為親本的后代，均檢測到118 bp和104 bp的目的片段，說明這些后代為真雜交種。

1～7分別代表T2A-1/MH63, FnMM+/FnMM?, RFnMM+/RFnMM?, FnYY+/FnYY?, RFnYY+/RFnYY?, FnTZ+/FnTZ?, RFnTZ+/RFnTZ?。在A圖中, n=1; 在B圖中, n=2; 如此類推。采用獨立樣本t檢驗分析相對根系發(fā)育（以F?、RF?和MH63的根系發(fā)育指標為1，F(xiàn)+與RF+與它們的各項指標比值的平均值定義為相對根系發(fā)育指標）。*表示Fn+與Fn?或RFn+與RFn?差異顯著(P<0.05，Mean±SE，n=4)。

對于發(fā)芽率與發(fā)芽勢，T2A-1的抗性雜交后代與其受體水稻的雜交后代均無顯著差異。這說明外源基因的導入并未改變雜交后代的發(fā)芽率及發(fā)芽勢。因此雜交后代發(fā)芽能力的降低是因為其具有栽培水稻的基因，這說明轉(zhuǎn)基因水稻的基因漂移到雜草稻后產(chǎn)生的雜交后代在沒有目標除草劑以及靶標蟲壓的選擇下，雜交后代種子在出苗能力上弱于雜草稻。含有轉(zhuǎn)基因的雜草稻后代相比于不含轉(zhuǎn)基因的雜草稻無顯著優(yōu)勢，并且雜草稻中含有的栽培稻基因或外源抗除草劑基因會被逐漸淘汰[34]。同時有研究發(fā)現(xiàn)抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻在蟲害發(fā)生較低的環(huán)境下，其生長、分蘗和產(chǎn)生種子的能力等適合度指標相比非轉(zhuǎn)基因水稻親本或不含轉(zhuǎn)基因的雜種分離后代均顯著降低[35-37]，這與本研究結(jié)果相類似。

3.2 根系發(fā)育

植物根系是水分和養(yǎng)分吸收的主要器官，其形態(tài)和根系活力對土壤養(yǎng)分吸收有重要作用[27]。根系數(shù)量、生物量以及表面積與植物養(yǎng)分吸收和產(chǎn)量正相關(guān)[38-41]。水稻根系形態(tài)的總根長、總根表面積、總根體積、分支數(shù)與生物量、氮累積量呈正相關(guān)[42]。程建峰等[43]研究表明水稻根系總吸收面積和活躍吸收面積與氮素利用效率正相關(guān)。因此，如果植物根系較早發(fā)育，生長迅速，根系發(fā)達，它們就可快速利用水資源和營養(yǎng)物質(zhì)，在競爭地下資源方面占據(jù)優(yōu)勢，因而這類植物具有較強競爭能力[44]。前人研究表明，雜草稻比栽培稻具有更強的根系，使得其具有更強的競爭能力。Schaedler[29]發(fā)現(xiàn)雜草稻與栽培稻對光的競爭一定程度上降低了兩者的根系發(fā)育情況，然而雜草稻的根系發(fā)育仍然強于栽培稻。本研究中雜草稻和栽培稻種子發(fā)芽后在2種氮素水平下水培15 d后，三種雜草稻的雜交后代在正常氮條件下根系發(fā)育均低于或相當于親本雜草稻，而在低氮環(huán)境下，雜交后代的根系發(fā)育均顯著弱于雜草稻，特別是雜交后代的總根長、根體積、根系表面積具有劣勢，說明雜交后代的根系量少，在根系發(fā)育和形態(tài)上均不具有強競爭力的基礎，會影響雜交后代根系對養(yǎng)分的充分吸收。

1～6分別代表FnMM+/WRMM, RFnMM+/WRMM, FnYY+/WRYY, RFnYY+/WRYY, FnTZ+/WRTZ, RFnTZ+/WRTZ。在A圖中, n=1; 在B圖中, n=2; 如此類推。采用獨立樣本t檢驗分析相對根系發(fā)育(以3種雜草稻的根系發(fā)育指標為1，F(xiàn)+與RF+與它們的各項指標比值的平均值定義為相對根系發(fā)育指標)。*表示Fn+或RFn+與雜草稻間差異顯著(P<0.05, Mean±SE, n=4)。

在低氮條件下，T2A-1與抗性雜交后代的株高、干物質(zhì)量以及根系發(fā)育相當于或低于MH63及其雜交后代，這可能是在養(yǎng)分不足的情況下維持外源基因的表達造成的非期望效應，具體生理機制仍需進一步研究。非期望效應是指將特定的外源基因整合進受體植物基因組時，除產(chǎn)生一些能穩(wěn)定高效表達的符合原先設計需求的目標性狀外，外源基因隨機插入受體作物，或可能影響受體植物原有的生理代謝過程，或改變受體植物的原有性狀等，這均是轉(zhuǎn)基因設計過程中無法控制并預期的[45]。額外表達外源基因需要消耗物質(zhì)與能量是引起非期望效應的重要原因之一[46-48]。

氮素作為植物生長發(fā)育所必需的第一大營養(yǎng)元素，在植物體內(nèi)參與構(gòu)成磷脂、蛋白質(zhì)、核酸、植物激素、輔酶輔基及葉綠素等主要成分，對器官構(gòu)建、物質(zhì)代謝及植物的生長發(fā)育有不可替代的作用[49]。雜草稻能夠高效利用氮肥, 這是其具有強競爭力的原因之一。Burgos等[18]以在阿肯色州廣泛種植的高產(chǎn)水稻和當?shù)刈顬槠毡榈碾s草稻為試驗對象，對比研究它們的氮肥利用效率，結(jié)果顯示無氮肥施用時, 雜草稻與栽培稻的生物量相近，而施用氮肥后雜草稻莖稈的生物量迅速增加，顯著高于栽培稻。由此推測雜草稻具有更高的氮肥利用效率。吳云艷等[28]的研究表明，雜草稻對氮肥的利用效率高于栽培稻，有些雜草稻對氮的利用甚至比栽培稻高出3倍。本研究雖然只設置了2種氮素條件，但基本可以反映雜交后代對土壤養(yǎng)分的吸收弱于雜草稻，從而影響其競爭能力。

在氮同化過程中，硝酸還原酶(NR)是植物體氮素同化和代謝過程的首個關(guān)鍵限速酶，在植物高效利用氮素過程中具有重要的生物學地位，因此NR活性可以反映植株的氮素營養(yǎng)狀況和氮代謝水平。硝酸鹽還原為氨后，植物須迅速進行氨的同化，植物體內(nèi)95%以上的NH4+通過谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶循環(huán)同化，兩者均為參與氨同化的關(guān)鍵酶[50]。因此有待于進一步研究雜交后代在氮素同化水平上是否與雜草稻相當或處于劣勢，從而從生理生化水平上探究雜交后代的氮同化水平。

賈世榮等[34]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻與野生稻的雜交后代相比野生稻在生長特性上發(fā)生的改變，可能是由于雜交后代受到栽培稻基因的影響所致。在本研究中T2A-1的發(fā)芽力和根系的總根長、種子根長以及根系表面積、不定根數(shù)在總體上均低于3種雜草稻，推測雜交后代因具有來自栽培水稻的基因，降低了雜交后代種子的發(fā)芽力和根系發(fā)育能力。從種子發(fā)芽力及根系發(fā)育來看，栽培水稻的基因消弱了雜交后代的生存競爭能力。但有研究表明栽培向日葵的部分性狀，如快速生長能力，增強了栽培種和野生種雜交后代在野外的生存能力[51]。因此，只從根系發(fā)育情況不能全面評價栽培水稻的基因?qū)﹄s交后代可能產(chǎn)生的影響，還需進一步研究栽培水稻其他性狀可能帶來的潛在影響。

[1] 翁綠水, 蔣利平, 肖國櫻. 抗蟲抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻恢復系B2A68的培育[J]. 雜交水稻, 2013, 28(1): 63-67.

Weng L S, Jiang L P, Xiao G Y. Development of an insect-resistant and herbicide-resistant transgenic restorer line B2A68 in rice[J]., 2013, 28(1): 63-67. (in Chinese with English abstract)

[2] 陳麗, 鄧力華, 陳芬, 肖國櫻. 轉(zhuǎn)和基因水稻的獲得與性狀鑒定[J]. 農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究, 2012, 33(1): 104-107.

Chen L, Deng L H, Chen F, Xiao G Y. Development and character identification of rice transformed byandgene[J]., 2012, 33(1): 104-107. (in Chinese with English abstract)

[3] 鄧力華, 鄧曉湘, 魏歲軍, 曹正春, 唐俐, 肖國櫻. 抗蟲抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻B1C893的獲得與鑒定[J]. 雜交水稻, 2014, 29(1): 67-71.

Deng L H, Deng X X, Wei S J, Cao Z C, Tang L, Xiao G Y. Development and identification of herbicide and insect resistant transgenic plant B1C893 in rice[J]., 2014, 29(1): 67-71. (in Chinese with English abstract)

[4] Chen H, Tang W, Xu C, Li X, Lin Y, Zhang Q. Transgenic indica rice plants harboring a syntheticgene ofexhibit enhanced resistance against lepidopteran rice pests[J]., 2005, 111(7): 1330-1337.

[5] Yang X, Wang F, Su J, Lu B R. Limited fitness advantages of crop-weed hybrid progeny containing insect-resistant transgenes () in transgenic rice field[J]., 2012, 7(7): e41220.

[6] Gu X Y, Kianian S F, Foley M E. Seed dormancy imposed by covering tissues interrelates to shattering and seed morphological characteristics in weedy rice[J]., 2005, 45(3): 948-955.

[7] Akasaka M, Konishi S, IzawaT, Ushiki J. Histological and genetic characteristics associated with the seed-shattering habit of weedy rice (L.) from Okayama, Japan[J]., 2011, 61: 168-173.

[8] Baek J S, Chung N J. Seed wintering and deterioration characteristics between weedy and cultivated rice[J]., 2012, 5(1): 1-10.

[9] Zhao C, Xu W R, Li H W, Dai W M,Zhang Z, QiangS, SongX L. The rapid cytological process of grain determines early maturity in weedy rice[J]., 2021, 12: 711321-711321.

[10] Zhao C, Xu W R, Meng L C, Qiang S,Dai W M, Zhang Z,Song X L. Rapid endosperm development promotes early maturity in weedy rice (f.)[J]., 2019, 68(2): 168-178.

[11] Zhao C, Xu W R, Song X L, Dai W M, Dai L, Zhang Z, Qiang S. Early flowering and rapid grain filling determine early maturity and escape from harvesting in weedy rice[J]., 2018, 74(2): 465-476.

[12] Zhang F L, Lei S R, Liu Y, Guo L A, Yin Q, Song J, Wang D, Chang L J, Liu W J, Zhou X Q. Differences in ecological fitness between Bt transgenic rice and conventional rice under insect-infestation pressures[J]., 2012, 18(1): 35-41.

[13] Huang Y, Wang Y Y, Qiang S, Song X L, Dai W M. Fitness of F1 hybrids between stacked transgenic rice T1c-19 withgenes and weedy rice[J]., 2019, 18: 2-14.

[14] 肖國櫻, 陳芬, 孟秋成, 周浩, 李錦江, 于江輝, 鄧力華, 翁綠水.我國轉(zhuǎn)基因抗除草劑水稻的生態(tài)風險與控制[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報, 2015, 23(1): 1-11.

Xiao G Y, Chen F, Meng Q C, Zhou H, Li J J, Yu J H, Deng L H, Weng L S. Ecological risk and management of herbicide-resistant transgenic rice () in China[J]., 2015, 23(1): 1-11. (in Chinese with English abstract)

[15] Song X L, Liu L L, Wang Z, Qiang S. Potential gene flow from transgenic rice(L.) to different weedy rice (f.) accessions based on reproductive compatibility[J]., 2009, 65(8): 862-869.

[16] Zuo J, Zhang L J, Song X L, Dai W M, Qiang S. Innate factors causing differences in gene flow frequency from transgenic rice to different weedy rice biotypes[J]., 2011, 67(6): 677-690.

[17] 王敏. 轉(zhuǎn)基因水稻與雜草稻基因漂移率的檢測技術(shù)及基因漂移研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學, 2019.

Wang M. Study on verifying technology of gene flow frequency and gene flow in transgenic rice and weedy rice[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2019. (in Chinese with English abstract)

[18] Burgos N R, Norman R J, Gealy D R, Blank H. Competitive N uptake between rice and weedy rice[J]., 2006, 99(2-3): 96-105.

[19] Dai L, Song X L, He B Y, Valverde B E, Qiang S. Enhanced photosynthesis endows seedling growth vigour contributing to the competitive dominance of weedy rice over cultivated rice[J]., 2017, 73(7): 1410-1420.

[20] Ross M A, Harper J L. Occupation of biological space during seeding establishment[J]., 1972, 50: 116-122.

[21] Li B, Hara T. On the relative yield of plants in two-species mixture[J]., 1999, 85: 170-176.

[22] Rajjou L, Duval M, Gallardo K, Catusse J, Bally J, Job C, Job D. Seed germination and vigor[J]., 2012, 63(1): 507-533.

[23] Gommers C M M, Monte E. Seedling establishment: A dimmer switch-regulated process between dark and light signaling[J]., 2018, 176(2): 1061-1074.

[24] Foolad M R, Subbiah P, Zhang L P. Common QTL affect the rate of tomato seed germination under different stress and nonstress conditions[J]., 2007, 2007: 97386.

[25] Wang Y, Zhang G, Du J, Liu B, Wang M. Influence of transgenic hybrid rice expressing a fused gene derived fromandon primary insect pests and rice yield[J]., 2010, 29(2): 128-133.

[26] 劉睿, 強勝, 宋小玲, 陳世國, 戴偉民. 雜草稻苗期強競爭性的生理機制[J]. 植物保護學報, 2015, 42(1): 138-144.

Liu R, Qiang S, Song X L, Chen S G, Dai W M. Physiological mechanisms of strong competition of weedy rice at seedling stage[J]., 2015, 42(1): 138-144. (in Chinese with English abstract)

[27] Fitter A H. Lnfluence of mycorrhlzal infection on competition for phosphorus and potassium by two species[J]., 1977, 79: 119-125.

[28] 吳云艷. 雜草稻與栽培稻的地下營養(yǎng)競爭[J]. 西南農(nóng)業(yè)學報, 2016, 29(3): 558-561.

Wu Y Y. Research on nutrient competition between root of weedy rice and that of cultivated rice[J]., 2016, 29(3): 558-561. (in Chinese with English abstract)

[29] Schaedler C E, Taborda C U M, Goulart F A P. Rice root growth and development in competition with weedy rice[J]., 2020, 38: e020216460.

[30] He Y, Chen S S, Liu K X, Chen Y J, Cheng Y H, Zeng P, Zhu P W, Xie T, Chen S L, Zhang H S, Cheng J P. OsHIPL1, a hedgehog-interacting protein-like 1 protein, increases seed vigor in rice[J]., 2022: 1-17.

[31] Li Y X, Zhou J H, Li Z, Qiao J Z, Quan R D, Wang J, Huang R F, Qin H.improves seed germination and salt tolerance by repressing ABA signaling in rice[J]., 2022, 189(2): 1110-1127.

[32] 李振博, 董立堯, 李俊, 張宏軍, 楊玉清. 不同環(huán)境因子對江蘇省雜草稻與常規(guī)栽培稻發(fā)芽勢影響的比較[J]. 雜草科學, 2009(4): 28-31. (in Chinese with English abstract)

Li Z B, Dong L X, Li J, Zhang H J, Yang Y Q. Study on the influence of different environmental factors on the germination potential of weedy rice(L.) and cultivated rice from Jiangsu Province[J]., 2009, 4: 28-31. (in Chinese with English abstract)

[33] 王楠, 馬殿榮, 賈德濤, 王瑩, 陳溫福. 北方雜草稻出苗特性的研究[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學學報, 2007, 26(6): 755-758.

Wang N, Ma D R, Jia D T, Wang Y, Chen W F.Germination characteristics of northern weedy rice[J]., 2007, 26(6): 755-758. (in Chinese with English abstract)

[34] Jia S, Yuan Q, Pei X, Wang F, Hu N, Yao K, Wang Z. Rice transgene flow: Its patterns, model and risk management[J]., 2014, 12: 1259-1270.

[35] 盧寶榮. 轉(zhuǎn)基因逃逸及其環(huán)境生物安全評價研究進展:抗蟲水稻案例分析[J]. 生物安全學報, 2014, 23(4): 217-223.

Lu B R. Assessing transgene escape and its environmental biosafety impacts: A case study in insect- resistant transgenic rice[J]., 2014, 23(4): 217-223.(in Chinese with English abstract)

[36] Xia H, Lu B R, Xu K, Wang W, Yang X, Yang C, Luo J, Lai F X, Ye W L, Fu Q. Enhanced yield performance of Bt rice under target-insect attacks: Implications for field insect management[J]., 2011, 20: 655-664.

[37] Yang X, Wang F, Su J, Lu B R. Limited fitness advantages of crop-weed hybrid progeny containing insect-resistant transgenes () in transgenic rice field[J]., 2012, 7(7): e41220.

[38] Wang Y, Mi G, Chen F, Zhang J, Zhang F. Response of root morphology to nitrate supply and its contribution to nitrogen accumulation in maize[J]., 2004, 27(12): 2189-2202.

[39] 田中偉, 樊永惠, 殷美, 王方瑞, 蔡劍, 姜東, 戴廷波.長江中下游小麥品種根系改良特征及其與產(chǎn)量的關(guān)系[J]. 作物學報, 2015, 41(4): 613-622.

Tian Z W, Fan Y H, Yin M, Wang F R, Cai J, Jiang D, Dai T B. Genetic improvement of root growth and its relationship with grain yield of wheat cultivars in the middle-lower Yangtze River[J]., 2015, 41(4): 613-622. (in Chinese with English abstract)

[40] 韓勝芳, 李淑文, 吳立強, 文宏達, 肖凱. 不同小麥品種氮效率與氮吸收對氮素供應的響應及生理機制[J]. 應用生態(tài)學報, 2007(4): 807-812.

Han S F, Li S W, Wu L Q, Wen H D, Xiao K. Responses and corresponding physiological mechanisms of different wheat varieties in their nitrogen efficiency and nitrogen uptake to nitrogen supply[J]., 2007(4): 807-812. (in Chinese with English abstract)

[41] Mu X, Chen F, Wu Q, Chen Q, Wang J, Yuan L, Mi G. Genetic improvement of root growth increases maize yield via enhanced post-silking nitrogen uptake[J]., 2015, 63: 55-61

[42] 陳晨, 龔海青, 張敬智, 郜紅建. 水稻根系形態(tài)與氮素吸收累積的相關(guān)性分析[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學報, 2017, 23(2): 333-341.

Chen C, Gong H Q, Zhang J Z, Gao H J. Correlation between root morphology and nitrogen uptake of rice[J]., 2017, 23(2): 333-341. (in Chinese with English abstract)

[43] 程建峰, 戴廷波, 荊奇, 姜東, 潘曉云, 曹衛(wèi)星. 不同水稻基因型的根系形態(tài)生理特性與高效氮素吸收[J]. 土壤學報, 2007(2): 266-272.

Cheng J F, Dai T B, Jing Q, Jiang D, Pan X Y, Cao W X. Root morphologlcal and physiological characterisics in relation to nitrogen absorption efficiency in different rice genotypes[J]., 2007(2): 266-272. (in Chinese with English abstract)

[44] Bais H P, Sang-Wook P, Weir T L, Callaway R M, Vivanco J M. How plants communicate using the underground information superhighway[J]., 2004, 9(1): 26-32.

[45] Kotchoni O S, Gachomo E W, Mwangi M. Commercial production of genetically modified crops: A prognosis towards global acceptance[J]., 2005, 7: 681-688.

[46] Filipecki M, Malepszy S. Unintended consequences of plant transformation: A molecular insight[J]., 2006, 47(4): 277-286.

[47] Xia H, Lu B R, Su J, Chen R, Rong J, Song Z P, Wang F. Normal expression of insect-resistant transgene in progenies of common wild rice crossed with genetically modified rice: Its implication in ecological biosafety assessment[J]., 2009, 119: 635-644.

[48] Yang X, Li L, Cai X X, Wang F, Su J, Lu B R. Efficacy of insect-resistancetransgenes in F5-F7generations of rice crop-weed hybrid progeny: implications for assessing ecological impact of transgene flow[J]., 2015, 60(18): 1563-1571.

[49] 梁曉慧, 史樹德. 作物氮素快速營養(yǎng)診斷及其在甜菜上的應用前景[J]. 北方農(nóng)業(yè)學報, 2019, 47(1): 49-56.

Liang X H, Shi S D. Rapid diagnosis of crop nitrogen nutrition and prospects for its application in sugar beet[J]., 2019, 47(1): 49-56. (in Chinese with English abstract)

[50] 莫良玉. 高等植物氨基酸態(tài)氮營養(yǎng)效應研究[D]. 杭州:浙江大學, 2001.

Mo L Y. Studies on the effects of amino acid nitrogen on different plants under sterile culture[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2001. (in Chinese with English abstract)

[51] Mercer K L, Shaw R G, Wyse D L. Increased germination of diverse crop-wild hybrid sunflower seeds[J]., 2006, 16(3): 845-854.

Seedling Growth Characteristics of Hybrids Between Transgenic Rice with/Genes and Weedy Rice

XIAO Lequan, LI Lei, DAI Weimin, QIANG Sheng, SONG Xiaoling*

(Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; Corresponding author, email: sxl@njau.edu.com)

【Objectives】The studyaims to evaluate the seedling growth characteristics of hybrids between transgenic rice T2A-1 withgene and weedy rice, and lay an experimental basis for evaluating the potential ecological risks of gene flow from T2A-1 to weedy rice. 【Methods】F1+-F4+(positive) hybrids (those with transgenic insertion using the transgenic line T2A-1 as the paternal parent) , F1?-F4?(negative) hybrids(those using the non-transgenic receptor Minghui 63 (MH63) as the paternal parent) with three weedy rice (WRMM, WRTZ and WRYY) accessions, were used as experimental materials. Under hydroponic culture, germinability was measured. Eight root development indexeswere measured and relative root development index under normal nitrogen (40 mg/L) and low nitrogen (20 mg/L), and the seedling growth characteristics of hybrids were evaluated. 【Results】Transgenic positive hybrids had similar 個germinability to transgenic negative hybrids, but both showed weeker germination potential and germination index compared with the corresponding weedy rice. There were no significant differences in plant height, whole plant dry biomass, and root development between T2A-1 and MH63, and between transgenic positive and transgenic negative hybrids under normal nitrogen conditions. Compared with the weedy rice, hybrids derived from WRMM displayed significantly lower plant height, but similar whole plant dry biomass and the index of root development. Hybrids of WRYY displayed similar seedling growth characteristics with WRYY. While hybrids derived from WRTZ had significantly greater plant height, but significantly lower whole plant dry biomass and index of root development. Under low nitrogen conditions, transgenic positive hybrids had similar or significantly lower plant height, whole plant dry biomass and index of root development than transgene negative hybrids. The relative root development indexes of all hybrids were significantly lower compared with their corresponding weedy rice. 【Conclution】Compared with their corresponding weedy rice, transgenic positive hybrids displayed equivalent or lower seedling growth momentum under normal nitrogen conditions, but significantly weaker growth under low nitrogen conditions.

dual-transgenic rice; T2A-1; weedy rice; hybrids; seedling growth characteristic; root development

10.16819/j.1001-7216.2023.220612

2022-06-12;

2022-10-20。

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2016ZX08011-001); 海南省重大科技計劃資助項目(ZDKJ202002-2-3)。