張 丹,朱秋瑾,譚 琦,宋春艷,于海龍,王瑞娟,尚曉冬,劉建雨

(上海市農業(yè)科學院食用菌研究所,農業(yè)農村部南方食用菌資源利用重點實驗室,國家食用菌工程技術研究中心,上海市農業(yè)遺傳育種重點開放實驗室,上海 201403)

金針菇(Flammulina filiformis)學名毛柄金錢菌,又稱毛柄小火菇、構菌、樸菇、冬菇、樸菰等,其口感脆嫩,營養(yǎng)豐富,深受消費者喜愛[ 1]。 金針菇是我國主要的栽培食用菌之一,近5 年的年產量維持在260 萬t左右[ 2]。 菌種是金針菇生產的核心要素,菌種退化是產業(yè)長期關注的焦點。 菌種退化是食用菌的生物學特征之一,菌種具有的典型優(yōu)良性狀發(fā)生明顯弱化或喪失的現象稱為退化,這是一個從量變到質變的逐步演化過程。 菌種退化常表現為菌絲生長勢弱、基質降解能力下降、抗性弱、子實體產量明顯下降等[ 3-4]。金針菇菌種具有生長速率快、對培養(yǎng)環(huán)境敏感、易產生粉孢子等特性,生產用菌種較易發(fā)生菌種退化[ 5]。為了保持菌種的優(yōu)良性狀,對常用菌種進行提純復壯是保證金針菇高產穩(wěn)產的重要措施之一。

常用的提純復壯方法有尖端菌絲分離、組織分離以及原生質體再生等,其中原生質體再生被認為是提純復壯的較好方法,在雙孢蘑菇、白靈菇、平菇等食用菌上已有研究報道[ 6-8]。 原生質體再生技術在金針菇的誘變育種、細胞融合育種、菌絲脫毒以及遺傳學分析等方面也有應用[ 1,9-11]。 陳鵬等[ 12]對金針菇原生質體制備及再生技術進行了正交優(yōu)化,完善了金針菇原生質體的制備方法。 在金針菇菌種復壯方面,鮮見有關原生質體再生技術的應用及遺傳機理的研究報道。

隨著分子生物學的發(fā)展,廣泛分布于基因組的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)標記被大量應用于遺傳研究。 SNP 主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA 序列多態(tài)性,包括單堿基的缺失、插入、轉換及顛換等[ 13]。 根據對生物遺傳性狀的影響,可將SNP 分為蛋白編碼SNP 和非蛋白編碼SNP[ 14]。 轉錄組是開發(fā)標記的理想資源,基于轉錄組建立的標記是根據基因的差異而建立的標記,也稱為基因內部標記,除具有一般分子標記的特點外,還有信息量大、通用性好等優(yōu)勢[ 15]。由于轉錄本保守性較高,如果發(fā)現一個基因內部標記與某一性狀連鎖,那么該轉錄本就可能與控制該性狀的基因相關[ 16]。

本研究采用原生質體再生技術對工廠化白色金針菇退化菌株進行復壯,同時基于轉錄組序列開發(fā)SNP 標記對復壯前后的菌株進行遺傳背景分析,并對復壯前后菌株轉錄組的特異表達基因進行篩選和功能分析,以期探索原生質體再生技術復壯金針菇退化菌株的分子機理,為金針菇菌種退化與提純復壯的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與試劑

試驗于2019 年5 月在上海市農業(yè)科學院食用菌研究所進行,供試金針菇菌株為H25 及退化的H25-d 菌株,由上海市農業(yè)科學院食用菌研究所菌種保藏中心提供。 退化菌株H25-d 為H25 菌株在PDA 培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)20 代時產生的退化菌株,其外觀表征為菌落不規(guī)則、菌絲稀疏且生長速率慢,無法正常栽培出菇。

試劑:溶壁酶購于廣東省科學院微生物研究所;甘露醇購于生工生物工程(上海)股份有限公司;蔗糖、碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀均為分析純,購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)采用PDA 培養(yǎng)基,搖瓶采用PDB 培養(yǎng)基,培養(yǎng)基均為美國BD 公司生產。 木屑培養(yǎng)基:78%木屑,20%麩皮,2%碳酸鈣,含水量為60%。 原生質體再生培養(yǎng)基:3.9%PDA 培養(yǎng)基,2%蔗糖。 工廠化液體培養(yǎng)基:2%白砂糖、0.4%豆粕粉、0.05%硫酸鎂、0.05%磷酸二氫鉀。 工廠化瓶栽培養(yǎng)基:59%木屑、25%玉米芯、15%米糠、1%碳酸鈣,含水量為60%。

1.3 原生質體再生菌株的制備

金針菇退化菌株H25-d 的菌絲原生質體提取參照前人研究方法進行[ 12,17-18]。

在原生質體再生培養(yǎng)基上有星芒狀菌落出現時,按出現時間先后依次挑取單菌落進行單獨培養(yǎng)。 對再生菌株進行鏡檢時,篩選不具有鎖狀聯(lián)合的原生質體單核體菌株,將單核體菌株進行交配型鑒定并兩兩雜交獲取雜交雙核菌株。

1.4 菌絲生長測試

PDA 培養(yǎng)基菌絲生長測定:使用5 mm 直徑打孔器取接種塊,接種于直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中央,25 ℃暗培養(yǎng),當菌絲從接種塊上生長到PDA 平板培養(yǎng)基時,在菌絲前端劃線,在菌絲即將長滿平板時再次在菌絲前端劃線,兩次劃線間的直線距離與培養(yǎng)天數的比值為菌絲生長速率,每個平板測定4 個方向的生長速率,取平均值,每個處理設3 個生物學重復。

木屑培養(yǎng)基菌絲生長測定:將直徑為5 mm 的PDA 菌種塊接種至裝有木屑培養(yǎng)基的200 mm×30 mm玻璃大試管中(每管培養(yǎng)基干質量35 g),25 ℃暗培養(yǎng),待菌絲長到料面2 cm 以下時沿菌絲前端劃線,培養(yǎng)14 d 后再次在菌絲前端劃線。 測量兩次劃線之間的長度,計算菌絲的平均生長速率,每個處理設3 個生物學重復。

液體培養(yǎng)基生長測定:利用5 mm 打孔器分別從PDA 培養(yǎng)基上挑取5 個菌種塊,接種到裝有600 mL液體培養(yǎng)基的1 L 三角瓶中,在黑暗條件下22 ℃、120 r∕min 振蕩培養(yǎng)。 7 d 后檢測培養(yǎng)液的pH 和菌絲生長量(體積測量法:取10 mL 培養(yǎng)液放入有刻度的離心管中,5 000 r∕min 離心5 min,倒出上清液并測定體積,培養(yǎng)液與上清液的體積差值占培養(yǎng)液體積的比值為菌絲的體積含量,每個樣品測定6 次,取平均值),每個處理設3 個生物學重復。

1.5 工廠化栽培測試

栽培測試在上海福茂食用菌有限公司進行,將培養(yǎng)好的液體菌種接種于1 400 mL 栽培瓶中(每瓶培養(yǎng)料濕質量為1 000 g,在121 ℃高壓條件下滅菌2 h,冷卻后接種)。 測定的農藝性狀指標包括生育期、原基形成時間、菇蓋直徑、菌柄長度、菌柄數量以及單瓶產量,所有指標測定均設3 次生物學重復。

1.6 樣品總RNA 提取及轉錄組測序

供試退化菌株H25-d 及其復壯菌株樣品由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行總RNA 提取、轉錄組文庫構建和測序。 具體參考Trapnell 等[ 19-20]的方法。 采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit 方法構建文庫,使用Illumina Hiseq 2000 平臺測序。 測序得到原始序列,使用軟件SeqPrep(https:∕∕github.com∕jstjohn∕SeqPrep)和sickle(https:∕∕github.com∕najoshi∕sickle)對其進行質量控制,得到高質量的清潔序列。

1.7 表型數據分析及轉錄組SNP 分析

利用SPSS 19.0 軟件對金針菇表型生長數據進行差異性分析。 使用Trinity 軟件(https:∕∕github.com∕trinityrnaseq∕trinityrnaseq∕wiki∕)對所有測序的清潔序列進行從頭組裝,得到轉錄組完整序列,并統(tǒng)計轉錄本及單基因簇的各項基礎數據。 以組裝好的轉錄組為模板序列,分別將供試菌株H25-d 及其復壯菌株的原始序列與其進行比對,利用SAMtools(https:∕∕samtools.sourceforge.net∕)和VarScan v2.2.7(https:∕∕varscan.sourceforge.net∕)軟件挖掘SNP 位點。

1.8 特異表達基因的篩選及功能分析

篩選的特異表達基因為僅在退化或復壯菌株中表達且轉錄本數量大于600 的基因。 基因功能分析采用NCBI 網站的blastx 搜索數據庫中相似功能基因,選取匹配度最高項。

2 結果與分析

2.1 原生質體再生菌株篩選

當原生質體再生培養(yǎng)基上有星芒狀菌落出現時,按時間先后依次挑取單菌落進行培養(yǎng),在新挑選的菌落中鏡檢出30 個無鎖狀聯(lián)合的、生長性狀較為優(yōu)良的單核體菌株。 對原生質體單核體菌株進行交配型鑒定后,采用單單雜交的方式獲取5 個具有鎖狀聯(lián)合的雜交雙核菌株。 獲得的再生雙核體菌株為原生質體再生菌株,稱為H25-dD。 在PDA 培養(yǎng)基上的H25-dD 菌落外觀與正常菌株H25 相似,長勢明顯強于退化菌株H25-d(圖1)。

圖1 供試菌株在PDA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of the tested strains on PDA medium

2.2 菌絲生長性狀的觀察

為進一步檢測原生質體再生技術對H25-d 菌株的復壯效果,觀察相同培養(yǎng)條件下H25 和H25-dD 菌株在PDA 培養(yǎng)基、木屑培養(yǎng)基、液體菌種培養(yǎng)基中的菌絲生長情況。 H25 與H25-dD 菌株在PDA 培養(yǎng)基上的生長速率分別為(4.63 ±0.15)mm∕d 和(4.68 ±0.14)mm∕d;在木屑培養(yǎng)基中的生長速率分別為(3.51 ±0.07)mm∕d 和(3.53 ±0.08) mm∕d;搖瓶培養(yǎng)7 d 后的培養(yǎng)液pH 分別為(6.28 ±0.01)和(6.30 ±0.07),菌絲量分別為(21.13 ±0.21)%和(21.76 ±0.92)%。 以上4 個指標之間的差異均未達顯著水平,表明H25-dD 的菌絲生長性狀恢復到原有正常菌株水平。

2.3 菌株栽培農藝性狀的觀察

菌株成熟后的子實體農藝性狀是非常重要的指標,特別是產量。 試驗進一步觀察了H25 與H25-dD菌株在工廠化條件下的出菇情況。 從表1 可以看出,H25 和H25-dD 菌株的菌絲生育期、原基形成時間均完全一致,分別為23 d 和5 d;菌蓋直徑平均值分別為5.32 mm 和5.29 mm;菌柄長度平均值分別為134.27 mm和132.54 mm;單瓶子實體平均數量分別為1 228.65 個和1 315.84 個;單瓶平均產量分別為478.67 g 和476.30 g。 以上6 個指標之間均沒有顯著差異,表明H25-dD 菌株可以恢復到與H25 菌株相當的農藝性狀。 如圖2 所示,H25-dD 菌株的子實體形態(tài)與H25 菌株無明顯差異,復壯效果理想。

表1 供試菌株在工廠化培養(yǎng)條件下的農藝性狀Table 1 Agronomic traits of the tested strains under factory culture conditions

圖2 供試菌株的子實體形態(tài)Fig.2 Fruiting body morphology of the tested strains

2.4 轉錄組序列的組裝及SNP 分析

為了進一步探索原生質體再生技術復壯金針菇退化菌株的內在機理,本研究基于轉錄組挖掘的SNP位點對比了H25-d 及H25-dD 菌株的遺傳背景差異。 轉錄組數據經組裝共得到27 736 個轉錄本(Transcript)以及18 064 個單基因簇(Unigene)。 轉錄本的平均長度為1 444.65 bp,單基因簇的平均長度為1 227.17 bp。

以組裝好的轉錄組序列為模板,將H25-d 及H25-dD 菌株的測序數據進行比對,挖掘SNP 位點。 結果顯示,H25-d 菌株與模板比對共產生12 423 個SNP 位點,平均每kb 出現的頻率為0.31 個。 SNP 在轉錄組單基因簇中的位置分布表明,有4 041 個位于基因的第一密碼子區(qū)域,有3 950 個位于第二密碼子區(qū)域,有4 115 個位于第三密碼子區(qū)域,在3’和5’端非編碼區(qū)均未發(fā)現SNP 位點,有317 個SNP 沒有明確的分布區(qū)域。 H25-dD 菌株與模板比對共產生13 093 個SNP 位點,平均每kb 出現的頻率為0.32 個。 SNP 在單基因簇中的位置分布表明,有4 240 個位于第一密碼子區(qū)域,有4 045 個位于第二密碼子區(qū)域,有4 324個位于第三密碼子區(qū)域,在3’和5’端非編碼區(qū)均未發(fā)現SNP 位點,有484 個SNP 沒有明確的分布區(qū)域。

分析SNP 的堿基序列發(fā)現,其包含置換和顛換兩種類型的多態(tài)性位點。 H25-d 的SNP 中發(fā)生置換的堿基類型為C∕T 和A∕G,數量分別為4 558 個和4 768 個,轉錄組每kb 出現的頻率均為0.11 個。 發(fā)生顛換的堿基有4 種類型,分別為A∕T、A∕C、T∕G 和C∕G,對應的數量分別為979 個、689 個、856 個和573 個,在轉錄組上每kb 出現的頻率分別為0.02 個、0.01 個、0.02 個和0.01 個。 H25-dD 菌株的SNP 中發(fā)生置換的堿基類型為C∕T 和A∕G,數量分別為4 765 個和4 975 個,轉錄組每kb 出現的頻率分別為0.11 個和0.12 個。 發(fā)生顛換的堿基類型分別為A∕T、A∕C、T∕G 和C∕G,對應的數量分別為1 029 個、768 個、850 個和706 個,在轉錄組上每kb 出現的頻率分別為0.02 個、0.01 個、0.02 個和0.01 個。

H25-d 與H25-dD 菌株的SNP 分布情況比較表明,兩個菌株在SNP 數量及位置分布上均存在差異。在SNP 數量方面,H25-dD 菌株比H25-d 菌株多670 個,其中有199 個位于基因的第一密碼子區(qū)域,有95個位于第二密碼子區(qū)域,有209 個位于第三密碼子區(qū)域,有167 個沒有明確的分布位置。 在SNP 堿基類型方面兩類菌株也有較大差異,H25-dD 菌株比H25-d 菌株發(fā)生C∕T 型堿基轉換的數量多207 個、A∕G 型多207 個。 H25-dD 菌株比H25-d 菌株發(fā)生顛換的A∕T 類型多50 個、A∕C 類型多79 個、T∕G 類型少5 個、C∕G 類型多133 個。 上述差異SNP 位點表明,原生質體再生后菌株的遺傳背景產生了變化,且這些變化多位于基因的密碼子區(qū)域。

2.5 特異表達基因分析

基于SNP 位點的檢測結果,進一步對H25-d 及H25-dD 菌株中特異表達基因進行挖掘,篩選出僅在各自轉錄組特異表達的基因。 結果表明,復壯菌株的特異表達基因數量遠高于退化菌株。 如表2 所示,H25-d 菌株轉錄本數量大于600 的特異表達基因僅有c1661_g1,且未匹配到已知功能的相似基因。H25-dD 菌株中轉錄本數量大于600 的特異表達基因數量有15 個。 功能分析表明,H25-dD 菌株的基因表達在細胞能量代謝、抗氧化、細胞骨架構建以及細胞DNA 甲基化修飾等方面發(fā)生了較大變化。 其中基因c8593_g1、c12033_g1 與細胞內ATP 的合成有關[ 21];c10839_g1、c4223_g1、c10584_g3、c11072_g1、c11025_g3 分別為細胞色素C 氧化酶、NADH 脫氫酶、細胞色素b-c1 復合體的結構單元,參與細胞能量代謝中重要的氧化磷酸化代謝途徑[ 22-25]。 c12025_g1 為磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶相關基因,參與細胞內三羧酸循環(huán)代謝途徑[ 26]。 c11989_g2 為烯醇化酶相關基因,烯醇化酶是催化2-磷酸甘油酸形成高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸的酶,是糖酵解的關鍵酶之一[ 27]。 c12016_g1 為熱激蛋白家族相關基因,編碼70 ku 熱激蛋白,該蛋白是細胞內抵抗氧化脅迫和參與細胞信號傳導的重要物質[ 28]。 c11822_g3 為谷氨酰胺合成酶相關基因,與細胞內重要的抗氧化物谷胱甘肽的合成有關[ 29]。 c12031_g1 為微管蛋白相關基因,主要參與細胞骨架構建及細胞分裂等生物學過程[ 30]。 c11997_g2 為半胱氨酸蛋白酶相關基因,半胱氨酸蛋白酶一般存在于細胞的溶酶體中,主要參與細胞吞噬和細胞內多余物質的清除和消化[ 31]。 c11938_g1 為S-腺苷甲硫氨酸合成酶相關基因,是催化腺苷三磷酸(ATP)和甲硫氨酸形成S-腺苷甲硫氨酸的酶,而S-腺苷甲硫氨酸是細胞DNA 甲基化的主要供體[ 32]。 c12006_g1 為半胱氨酸甲基轉移酶相關基因,同樣參與細胞的DNA 甲基化修飾作用[ 33]。

3 結論與討論

工廠化栽培的白色金針菇優(yōu)良品種在使用一段時間后會出現大量粉孢子產生、菌絲生長不一致、出菇不齊、產量下降等退化現象。 菌種退化會給金針菇生產企業(yè)帶來較大損失,如何有效緩解菌種退化是金針菇產業(yè)需要研究的重要問題。

金針菇菌種的提純復壯是緩解菌種退化的有效方法之一,常用方法主要有增加菌絲營養(yǎng)、尖端菌絲分離、組織分離及原生質體制備等。 陳志松[ 34]研究認為,挑取菌褶處的組織塊進行分離可有效復壯退化的金針菇菌種。 李雪飛等[ 35]采用組織分離和菌絲尖端分離的方法,結合構樹基質培養(yǎng)和藍光處理對退化金針菇菌絲進行了復壯。 劉昆昂等[ 36]利用結晶紫PDA 培養(yǎng)基結合原生質體制備技術對黃色金針菇退化菌株進行了復壯。 本研究制備的原生質體單核體雜交菌株可有效恢復白色金針菇退化菌株的農藝性狀,與前人的研究結果較為一致。 本研究獲得的原生質體再生菌株的產量等指標并沒有顯著超過對照菌株,其原因是對照菌株為液氮保藏的原始母種,尚未經歷長期的繼代培養(yǎng),其菌株性狀優(yōu)良,復壯后的菌株在同樣培養(yǎng)條件下較難超越原始母種。 若想利用原生質體再生技術獲得產量等指標上超過原菌株的菌株,可在原生質體再生過程中進行誘變育種,篩選出產量等指標超越原始母種的優(yōu)良變異菌株。 另外,也可嘗試采用加富培養(yǎng)基對獲得的原生質體再生菌株進行培養(yǎng)。

基于轉錄組序列開發(fā)的SNP 標記對復壯前后菌株的遺傳背景分析顯示,原生質體再生菌株的遺傳背景發(fā)生了變化,復壯后菌株的SNP 位點比退化菌株的SNP 位點多670 個,這些位點大部分位于基因轉錄表達的密碼子區(qū)域,說明原生質體再生對菌株的遺傳背景產生了影響,與表型相關基因的轉錄表達發(fā)生了變化。 本研究進一步篩選了退化和復壯菌株中轉錄本數量超過600 的特異表達基因,通過基因功能分析明確了細胞能量代謝、抗氧化、細胞骨架構建以及細胞DNA 甲基化修飾等方面相關的基因在復壯菌株中特異表達,這些基因的表達對細胞的正常代謝和清除有害物質具有重要作用,這與Wang 等[ 28]在金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)中的研究結果較為一致。

基于上述分析,初步認為原生質體再生技術能夠增強細胞的抗氧化能力及對有毒有害物質的清除能力,打破有害物質導致的細胞糖酵解、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、ATP 合成以及DNA 甲基化修飾、骨架構建等重要代謝途徑功能紊亂的惡性循環(huán),使細胞的生長發(fā)育重回正軌,從而達到菌株復壯的效果。