袁曉，楊盼迪，朱云娜，王玉昆，王斌

(韶關(guān)學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院/廣東省粵北食藥資源利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東韶關(guān) 512005)

非生物脅迫如干旱、重金屬、高低溫、鹽漬、水浸等會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和地理分布、作物產(chǎn)量和品質(zhì)等造成嚴(yán)重影響[1，2]。 隨著全球氣候變暖，各種極端天氣頻繁發(fā)生，加劇了非生物脅迫對(duì)農(nóng)作物生產(chǎn)的影響[3]。 與動(dòng)物可隨時(shí)移動(dòng)不同，植物一旦在特定介質(zhì)上固著，便不能自主移動(dòng)[4]，因此，植物與動(dòng)物應(yīng)對(duì)非生物脅迫的方式有著很大不同，植物必須依靠自身的防御系統(tǒng)抵抗或適應(yīng)非生物脅迫。 植物適應(yīng)非生物脅迫的途徑主要包括:激活自身的抗氧化防御系統(tǒng)，誘導(dǎo)抗逆相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白積累，促進(jìn)滲透物質(zhì)的積累以保持細(xì)胞內(nèi)外滲透平衡[5]。

在遇到非生物脅迫時(shí)，植物細(xì)胞內(nèi)可溶性糖等滲透性物質(zhì)的合成積累，被認(rèn)為是植物增強(qiáng)非生物脅迫抗性的重要方式[6]。 增加細(xì)胞內(nèi)滲透性物質(zhì)的含量，能提高細(xì)胞滲透勢(shì)，增強(qiáng)植物對(duì)逆境脅迫的耐受性[7]。 棉子糖系列寡糖(raffinose family oligosaccharides， RFOs)是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[8]，同時(shí)也是葫蘆科植物同化物的主要運(yùn)輸形式[9]。 因此，RFOs 在葫蘆科植物中具有雙重作用，既起到滲透調(diào)節(jié)的作用，還負(fù)責(zé)同化物的運(yùn)輸。 肌醇半乳糖苷合成酶(galactinol synthase，GolS)是催化RFOs 合成第一步反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，直接催化肌醇和UDP-半乳糖形成肌醇半乳糖苷[6]。 因此，GolS 在調(diào)控RFOs 合成和增強(qiáng)葫蘆科植物抗逆性中具有重要作用。

黃瓜(Cucumis sativus)是葫蘆科黃瓜屬一年生攀援性草本植物，喜溫，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物[10，11]。 黃瓜對(duì)高低溫、鹽堿等非生物脅迫的耐受能力較差，鹽脅迫和高低溫脅迫嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)發(fā)育，甚至降低采后黃瓜的品質(zhì)和耐貯性，往往導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[12，13]。 據(jù)報(bào)道，黃瓜基因組中共含有4 個(gè)GolS基因，它們?cè)诙喾N非生物脅迫處理后在黃瓜葉片中顯著上調(diào)表達(dá)，其中GolS1表達(dá)上調(diào)能在低溫脅迫條件下促進(jìn)同化物在韌皮部的裝載，提高葉片光合作用效率，促進(jìn)RFOs 積累[9]。 低溫和干旱脅迫處理誘導(dǎo)黃瓜GolS4基因在葉片中的表達(dá)，過(guò)表達(dá)GolS4基因提高RFOs 含量，降低活性氧(reactive oxygen species， ROS)含量；相反，沉默GolS4基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因黃瓜在干旱脅迫處理后更容易萎蔫[14]。 這些研究結(jié)果表明，GolS基因在黃瓜抵抗低溫和干旱等非生物脅迫過(guò)程中具有重要作用。 采后黃瓜屬于離體器官，黃瓜GolS基因的功能在離體器官和非離體器官中是否保守，目前仍不清楚。

本研究從黃瓜中克隆了GolS2基因，分析了其氨基酸序列特性及與其他植物GolS2 的序列差異，并研究了GolS2基因在黃瓜幼苗和采后黃瓜中響應(yīng)非生物脅迫的差異，以期為揭示黃瓜GolS2基因的生物學(xué)功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試驗(yàn)處理

所用黃瓜品種為“翠夏”和“津春2 號(hào)”，克隆載體為pMD18－T，VIGS 實(shí)驗(yàn)載體為pTRV1 和pTRV2，均由本實(shí)驗(yàn)室自行擴(kuò)繁保存。 大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海唯地生物有限公司，高保真PCRTaq酶和植物總RNA 提取試劑盒由北京天根生化科技有限公司提供，cDNA 合成試劑盒購(gòu)自上海翌圣生物科技股份有限公司。

于2020 年5 月在本地黃瓜種植基地采收即將上市的黃瓜果實(shí)，室溫條件下一小時(shí)內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。 挑選成熟度基本一致、大小均一的黃瓜果實(shí)作為試驗(yàn)材料。 將挑選好的采后黃瓜分成兩組，每組含有3 個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)含有10 根黃瓜。 采后黃瓜裝框，并用塑料薄膜保鮮袋密封包裝，分別在5℃和10℃貯藏庫(kù)(相對(duì)濕度95%～98%)中貯藏72 h。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃瓜GolS2基因全長(zhǎng)克隆 在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http:/ /www.cucurbitgenomics.org/)中檢索GolS2(登錄號(hào):CsaV3＿1G015730)基因，并根據(jù)mRNA 序列設(shè)計(jì)特異引物。 引物由生工生物工程(上海)有限公司廣州分公司合成，序列如表1 所示。 使用植物RNA 提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取黃瓜總RNA，運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)合成cDNA。以cDNA 為模板，采用RT－PCR 擴(kuò)增黃瓜GolS2全長(zhǎng)序列。 PCR 反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性35 s，58℃退火35 s，72℃延伸5 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)長(zhǎng)度后，回收并連接到pMD18－T(日本Takara 公司) 載體上，并轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。 挑取陽(yáng)性單菌落擴(kuò)繁，并送至生工生物工程(上海)有限公司廣州分公司測(cè)序鑒定。

表1 引物信息

1.2.2 生物信息學(xué)分析 在ExPASy 平臺(tái)完成黃瓜GolS2 蛋白理化性質(zhì)分析，利用Cell－PLoc 2.0在線預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位。 在黃瓜基因組中調(diào)出GolS2翻譯起始密碼子ATG 上游1 500 bp 長(zhǎng)度的DNA 序列，提交PlantCARE 分析其啟動(dòng)子中的順式作用元件，并用TBtools 軟件繪制作用元件在啟動(dòng)子中的定位[15]。 在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中同源比較，挑選出同源性較高的同源蛋白。 使用DNAMAN 軟件比對(duì)氨基酸序列，并用MEGA 軟件(Neighbor－Joining 法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。 本研究用到的生物信息學(xué)分析軟件或在線工具見(jiàn)表2。

表2 本研究用到的生物信息學(xué)分析工具

1.2.3 采后黃瓜VIGS 沉默實(shí)驗(yàn) 黃瓜HHO2(hypersensitive to low Pi － elicited primary root shortening homologue 2)是一個(gè)MYB like 轉(zhuǎn)錄因子，GRP3(glycine－rich RNA－binding protein 3)是一個(gè)RNA 結(jié)合蛋白，他們對(duì)低溫應(yīng)答基因的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用[16－19]。 為研究?jī)苫驅(qū)S瓜GolS2基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，對(duì)采后黃瓜進(jìn)行VIGS 沉默實(shí)驗(yàn)。

在HHO2和GRP3基因全長(zhǎng)序列的3′端附近設(shè)計(jì)引物，并在上、下游引物序列的5′端加入BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)序列，引物信息見(jiàn)表1。 以cDNA 為模板，使用高保真PCRTaq酶擴(kuò)增目的片段。 目的片段經(jīng)酶切和凝膠電泳分離后，與pTRV2 質(zhì)粒相連接。 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)測(cè)序鑒定后，提取重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101 細(xì)胞。

將含有pTRV1 空載的農(nóng)桿菌分別與含pTRV2－HHO2 和pTRV2－GRP3 重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單獨(dú)或同時(shí)等體積混勻，室溫靜置2 h。 使用醫(yī)用注射器，將農(nóng)桿菌分別注射在黃瓜果實(shí)的三個(gè)部位(遠(yuǎn)離果蒂5 cm、遠(yuǎn)離果柄5 cm、果柄和果蒂之間的最中間部位)。 然后將果實(shí)裝在果籃中，用聚乙烯塑料薄膜袋包裝果籃。 室溫(25℃)暗培養(yǎng)48 h，使農(nóng)桿菌恢復(fù)活性，充分沉默目的基因。 將整個(gè)果籃轉(zhuǎn)移至5℃冷庫(kù)貯藏72 h，檢測(cè)沉默HHO2和GRP3基因?qū)Σ珊簏S瓜GolS2基因表達(dá)的影響。

1.2.4 基因的表達(dá)分析 由北京百邁客生物科技有限公司完成處理樣品的總RNA 提取和測(cè)序建庫(kù)，并利用Illumina next seq 2500 測(cè)序平臺(tái)完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作，測(cè)序流程和數(shù)據(jù)處理方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[20]。 用FPKM(fragments per kilobase per million mapped reads) 值表示GolS2的表達(dá)水平。

1.3 數(shù)據(jù)分析

在Mircrosoft Excel 2016 軟件中整理數(shù)據(jù)，利用SPSS 22.0 軟件分析數(shù)據(jù)之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜GolS2 基因克隆及結(jié)構(gòu)分析

如圖1A 所示，從黃瓜中克隆出了一條約1 000 bp的DNA 片段，總體與黃瓜GolS2基因長(zhǎng)度(981 bp)一致。 將該DNA 片段與pMD18－T 載體相連接，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)繁，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，目的產(chǎn)物正是CsGolS2基因。 該基因定位在1號(hào)染色體，ORF 由4 個(gè)不同長(zhǎng)度的外顯子構(gòu)成(圖1B)，第一個(gè)外顯子最長(zhǎng)(406 bp)，第三個(gè)外顯子長(zhǎng)度只有135 bp。

圖1 黃瓜果實(shí)GolS2 全長(zhǎng)PCR 電泳圖(A)及其在染色體上的定位(B)

2.2 CsGolS2 基本特征分析

CsGolS2基因ORF 全長(zhǎng)981 bp，編碼326 個(gè)氨基酸(圖2)。 理論分子量為37.83 kDa，等電點(diǎn)為5.51。 氨基酸中帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)為42 個(gè)，帶正電荷的殘基總數(shù)為32 個(gè)。 編碼蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)為41.45，屬于不穩(wěn)定蛋白，脂肪族指數(shù)為78.31，平均疏水指數(shù)為－0.34。

圖2 黃瓜CsGolS2 開(kāi)放閱讀框序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

CsGolS2 蛋白的氨基酸序列中含有5 個(gè)保守的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，在C 端還含有1 個(gè)疏水性APSAA 五肽結(jié)構(gòu)(圖2)，這些是植物GolS 蛋白的典型特征[21]。 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Cs-GolS2 蛋白可能定位在細(xì)胞壁、葉綠體、細(xì)胞質(zhì)和線粒體等亞細(xì)胞器中。

2.3 多序列比對(duì)與進(jìn)化分析

CsGolS2 與葫蘆科其他4 種植物GolS2 的氨基酸序列一致性很好(圖3)，表明葫蘆科植物GolS2 蛋白保守性很高，推測(cè)葫蘆科植物GolS2 蛋白的生物學(xué)功能可能保守。 其中，CsGolS2 與甜瓜(Cucumis melo)CmeGolS2 蛋白(XP＿008463593.1)的序列一致性最好。

圖3 5 種葫蘆科植物GolS2 蛋白的氨基酸多序列比對(duì)

CsGolS2 與其他8 種植物GolS2 蛋白的同源性分析結(jié)果如表3 所示，可見(jiàn)CsGolS2 與其他8種植物GolS2 蛋白的氨基酸序列同源性介于73.06%～97.85%之間，與甜瓜GolS2 的同源性最高，為97.85%。 說(shuō)明植物GolS2 在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，暗示著它們具有相似的生物學(xué)功能。

表3 不同植物GolS2 蛋白同源性比較 (%)

比較了CsGolS2 蛋白與4 種模式植物GolS2蛋白的氨基酸序列相似性和結(jié)構(gòu)域保守性，結(jié)果(圖4)顯示，盡管5 種植物GolS2 蛋白的氨基酸序列長(zhǎng)度有所不同，但序列中均含有一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶保守結(jié)構(gòu)域，屬于糖基轉(zhuǎn)移酶超級(jí)家族；且保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列一致性很高，表明保守結(jié)構(gòu)域的保守性很高。

圖4 黃瓜與4 種模式植物GolS2 蛋白的氨基酸序列比對(duì)

在擬南芥(Arabidopsis thaliana)基因組數(shù)據(jù)中共鑒定出了9 個(gè)GolS基因，分別命名為At-GolS1～AtGolS9。 擬南芥通常被作為研究候選基因功能的模式植物，相關(guān)基因的功能已研究的比較清楚，因此，比較了CsGolS2 蛋白與擬南芥GolS家族蛋白的進(jìn)化關(guān)系(圖5)，以期在一定程度上推測(cè)CsGolS2 蛋白的生物學(xué)功能。 可以看出，擬南芥GolS 家族蛋白可分為兩組，AtGolS8 和At-GolS9 聚在一組，黃瓜GolS2 與其他7 個(gè)擬南芥GolS 蛋白聚在另一分支，CsGolS2 與AtGolS2 和AtGoLS3 的親緣關(guān)系最近。

圖5 黃瓜GolS2 蛋白與擬南芥GolS 家族的親緣關(guān)系

2.4 基于文獻(xiàn)的鹽脅迫和低溫脅迫對(duì)黃瓜幼苗GolS2 基因表達(dá)的影響

前人利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析了黃瓜基因組中所有基因的表達(dá)水平，我們從中挑選了黃瓜幼苗GolS2基因在鹽脅迫和低溫脅迫后的表達(dá)數(shù)據(jù)[22]，結(jié)果(圖6)顯示，鹽脅迫顯著上調(diào)GolS2基因在黃瓜幼苗中的表達(dá)，表達(dá)量比對(duì)照(CK)高42.10 倍；低溫處理顯著誘導(dǎo)GolS2基因表達(dá)，處理6 h 和12 h 的表達(dá)量顯著高于處理2 h。 表明黃瓜GolS2是一個(gè)抗逆性相關(guān)基因，其表達(dá)可能與黃瓜幼苗對(duì)鹽脅迫和低溫脅迫的應(yīng)答密切相關(guān)。

圖6 鹽脅迫(A)和低溫脅迫(B)處理對(duì)黃瓜幼苗GolS2 表達(dá)的影響

2.5 黃瓜GolS2 基因啟動(dòng)子分析

由于鹽脅迫和低溫脅迫顯著上調(diào)GolS2基因在黃瓜幼苗中的表達(dá)，推測(cè)該基因啟動(dòng)子中可能含有逆境響應(yīng)元件。 因此，從基因組數(shù)據(jù)中調(diào)出位于起始密碼子上游1 625 bp 長(zhǎng)度的DNA 序列，分析啟動(dòng)子中的瞬時(shí)作用元件，結(jié)果(圖7)顯示，CsGolS2基因啟動(dòng)子中含有豐富的逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)元件。 其中，有2 個(gè)元件與晝夜節(jié)律(circadian)調(diào)節(jié)相關(guān)，有9 個(gè)光響應(yīng)元件(4 個(gè)G－Box、2 個(gè)Box 4、1 個(gè)TCT－motif、1 個(gè)LAMP－element、1個(gè)chs－CMA1a)，3 個(gè)厭氧誘導(dǎo)元件ARE，2 個(gè)茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(TGACG－motif 和CGTCA－motif)，6 個(gè)乙烯響應(yīng)元件(4 個(gè)ERE 和2 個(gè)Wbox)，3 個(gè)ABA 響應(yīng)元件ABRE。 這些結(jié)果再次證明黃瓜GolS2是一個(gè)典型的逆境脅迫相關(guān)基因。 此外，啟動(dòng)子中還鑒定出多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，比如8 個(gè)MYB 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，3 個(gè)MYC 結(jié)合位點(diǎn)，表明黃瓜GolS2基因的表達(dá)可能受到MYB 和MYC 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。

圖7 黃瓜GolS2 啟動(dòng)子中與逆境相關(guān)的順式作用元件分析

2.6 低溫處理對(duì)采后黃瓜GolS2 基因表達(dá)的影響

與黃瓜幼苗不同的是，采后黃瓜由于脫離了母體，沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)來(lái)源，只能通過(guò)呼吸代謝維持生命活動(dòng)[7，16]。 在響應(yīng)低溫脅迫過(guò)程中，GolS2在采后黃瓜和黃瓜幼苗中的表達(dá)模式是否一致，目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。 鑒定能同時(shí)提高植株和采后果實(shí)耐冷性的功能基因，對(duì)于培育耐冷黃瓜新品種具有重要意義。 為此，本研究分析了GolS2在采后黃瓜中響應(yīng)低溫處理的表達(dá)模式，結(jié)果(圖8)顯示，與幼苗中的表達(dá)模式不同，GolS2表達(dá)水平在5℃和10℃低溫處理后顯著下降，且處理時(shí)間越長(zhǎng)，下降越明顯；10℃低溫處理對(duì)GolS2表達(dá)的抑制作用強(qiáng)于5℃低溫處理。 表明低溫處理抑制采后黃瓜GolS2表達(dá)，可能負(fù)調(diào)控采后黃瓜耐冷反應(yīng)。

圖8 低溫處理對(duì)采后黃瓜果實(shí)GolS2 表達(dá)的影響

2.7 沉默GRP3 和HHO2 基因?qū)Σ珊簏S瓜GolS2基因表達(dá)的影響

為研究HHO2和GRP3是否對(duì)GolS2基因表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，分析了沉默GRP3和HHO2基因?qū)Σ珊簏S瓜GolS2表達(dá)的影響，結(jié)果(圖9)顯示，不論單獨(dú)沉默GRP3或HHO2基因，還是同時(shí)沉默GRP3和HHO2基因，均顯著下調(diào)GolS2表達(dá)，表明GRP3 和HHO2 蛋白可能調(diào)控GolS2表達(dá)。

圖9 GRP3 和HHO2 沉默對(duì)采后黃瓜GolS2 表達(dá)的影響

3 討論與結(jié)論

肌醇半乳糖苷合成酶是調(diào)節(jié)棉子糖系列寡糖合成的關(guān)鍵酶，對(duì)細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)具有重要作用[23]。 因此，克隆黃瓜GolS家族基因，并分析其響應(yīng)非生物脅迫的表達(dá)模式，有助于豐富和完善植物GolS家族基因的功能。 本研究從黃瓜中克隆了GolS2基因，其編碼326 個(gè)氨基酸殘基。 序列分析結(jié)果顯示，黃瓜GolS2 與擬南芥GolS 家族蛋白的親緣關(guān)系較近，與其他植物GolS 蛋白的同源性也很高，序列中均含有一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶保守結(jié)構(gòu)域。 同時(shí)，黃瓜GolS2 蛋白氨基酸序列具有植物GolS 蛋白的典型特征，比如在氨基酸序列C端含有保守的疏水性APSAA 五肽結(jié)構(gòu)。 這些結(jié)果證實(shí)，黃瓜GolS2 屬于植物GolS 大家族。

植物GolS家族基因的表達(dá)受多種非生物脅迫因子誘導(dǎo)，表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)RFOs 積累和增強(qiáng)抗逆性。 在大豆[Glycine max(L.) Merr.]幼苗中，包括高低溫、干旱及高鹽等在內(nèi)的多種非生物脅迫可不同程度地誘導(dǎo)GmGolS1基因表達(dá)，且高溫脅迫對(duì)GmGolS1基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)烈[24]。 干旱和高鹽脅迫顯著誘導(dǎo)AtGolS1和At-GolS2基因的表達(dá)，而AtGolS3基因表達(dá)受低溫脅迫誘導(dǎo)，超表達(dá)AtGolS2基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥抗旱性顯著提高[25]。 干旱脅迫誘導(dǎo)芝麻(Sesamum indicumL.)SmGolS6基因的表達(dá)，在擬南芥中異源超表達(dá)該基因，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性[26]。 鹽脅迫和低溫脅迫處理顯著誘導(dǎo)黃瓜幼苗GolS2基因表達(dá)，且該基因啟動(dòng)子中含有豐富的逆境脅迫響應(yīng)元件，表明黃瓜GolS2是一個(gè)逆境響應(yīng)基因，其表達(dá)上調(diào)可能是黃瓜幼苗適應(yīng)非生物脅迫的重要機(jī)制。

盡管植物GolS 蛋白的功能在進(jìn)化中保守性較好，但同一基因在不同類(lèi)型器官中的功能是否存在明顯差異，目前仍不明確。 在黃瓜幼苗中，干旱和低溫脅迫處理顯著誘導(dǎo)GolS2基因的表達(dá)；但在離體的采后黃瓜中，低溫處理卻顯著下調(diào)GolS2基因的表達(dá)，且10℃處理比5℃處理的抑制更強(qiáng)。 此外，黃瓜GolS2基因啟動(dòng)子中含有豐富的光響應(yīng)元件。 這些結(jié)果表明，黃瓜GolS2基因的生物學(xué)功能可能在不同類(lèi)型器官中存在較大差異，非生物脅迫對(duì)黃瓜GolS2基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用可能依賴(lài)于光照；也意味著在采后黃瓜中增強(qiáng)GolS2基因表達(dá)，或許并不能增強(qiáng)采后黃瓜的耐冷性，若需要通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法提高采后黃瓜耐冷性，GolS2基因可能不是一個(gè)有效的候選基因。葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要器官，黃瓜GolS1和GolS4基因在葉片中表達(dá)上調(diào)，能提高葉片的光合作用效率，促進(jìn)RFOs 的積累[9，14]。 而果實(shí)是養(yǎng)分貯藏器官和生殖器官，采收后一般貯藏在密閉或黑暗空間中[27]，采后黃瓜在貯藏過(guò)程中很難進(jìn)行光合作用，盡管黃瓜果實(shí)中也含有葉綠體[20]，表明黃瓜GolS2促進(jìn)RFOs 積累與同化物轉(zhuǎn)運(yùn)效率的提高有關(guān)。

植物GolS家族基因的表達(dá)還受轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的調(diào)控。 旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)WRKY1轉(zhuǎn)錄因子可直接與BhGolS1基因啟動(dòng)子中的Wbox 元件結(jié)合，調(diào)控其表達(dá)[28]。 葡萄(Vitis viniferaL.)AQUILO 是一個(gè)MYB like 轉(zhuǎn)錄因子，其通過(guò)調(diào)節(jié)VvGolS家族基因的表達(dá)促進(jìn)RFOs 合成和積累[29]。 本研究中，黃瓜GolS2基因啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)MYB 和MYC 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，沉默HHO2基因顯著下調(diào)采后黃瓜GolS2表達(dá)，表明HHO2 可能是直接調(diào)控GolS2基因表達(dá)的MYB轉(zhuǎn)錄因子。 HHO2 是否直接調(diào)控GolS2表達(dá)，以及具體的調(diào)控機(jī)制是怎樣的，尚需更多研究進(jìn)一步探明。 植物GRP 蛋白具有類(lèi)似分子伴侶的功能，對(duì)mRNA 的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)具有重要作用[30]。 本研究中，沉默GRP3顯著抑制采后黃瓜GolS2基因表達(dá)，表明GRP3 蛋白可能同時(shí)在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控GolS2基因表達(dá)。

總之，本研究從黃瓜中克隆了GolS2基因，其屬于植物GolS基因超級(jí)家族。GolS2是一個(gè)逆境應(yīng)答相關(guān)基因，高鹽和低溫處理誘導(dǎo)GolS2基因在黃瓜幼苗和葉片中的表達(dá)，但低溫處理卻下調(diào)其在采后黃瓜中的表達(dá)，表明其可能通過(guò)提高黃瓜光合效率和同化物轉(zhuǎn)運(yùn)效率促進(jìn)RFOs 積累。由于采后黃瓜在貯藏期間很難進(jìn)行光合作用，若利用分子育種方法培育果實(shí)耐冷性強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因黃瓜，GolS2可能不是一個(gè)有效的目標(biāo)基因。