林國(guó)衛(wèi)，武思?jí)?，張悅，蔡紅，聞靜

(1. 上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西上饒 334000；2. 玉山縣紅日農(nóng)林農(nóng)民專業(yè)合作社，江西玉山 334700)

三葉青(Tetrastigma hemsleyanuDiels et Gilg.)在我國(guó)有著悠久的民間藥用歷史，塊根是其重要的藥用部位，富含黃酮類[1]、多糖類[2]、酚酸類[3]及脂肪酸類[4]等多種次生代謝物質(zhì)，其提取物具有消炎、抗病毒、解熱及抗腫瘤等功效[5，6]。 由于三葉青在自然環(huán)境中生長(zhǎng)緩慢，僅靠自然繁殖已不能滿足市場(chǎng)需求，開(kāi)發(fā)快繁及人工栽培技術(shù)對(duì)于提高產(chǎn)量、保護(hù)種質(zhì)資源及促進(jìn)其生物學(xué)研究具有重要意義。 但三葉青組織培養(yǎng)中存在嚴(yán)重的再分化障礙，通過(guò)愈傷組織途徑很難形成再生芽或胚狀體，目前只能通過(guò)芽原基無(wú)菌培養(yǎng)增殖實(shí)現(xiàn)快速繁殖[7，8]，這嚴(yán)重制約了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在三葉青分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用。 另外，三葉青塊根從纖維根到營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)藏器官的轉(zhuǎn)變過(guò)程也涉及到體細(xì)胞的再分化。 研究表明胚狀體受體類激酶(somatic embryogenesis receptor kinases，SERKs)是參與植物營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)藏器官形成的關(guān)鍵受體類蛋白[9]，在體細(xì)胞胚發(fā)生及體細(xì)胞的脫分化中發(fā)揮重要作用[10，11]。 因此，本研究從三葉青轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到與SERKs 相似度最高的兩個(gè)受體蛋白基因ThRLP1及ThRLK1，通過(guò)生物信息學(xué)分析、原核表達(dá)分析、塊根發(fā)育不同時(shí)期及器官特異性表達(dá)分析等，初步明確其分子結(jié)構(gòu)特征及表達(dá)特征，為進(jìn)一步研究該類基因所涉及的生物學(xué)過(guò)程及其功能鑒定提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 本研究所用三葉青為栽培品種“懷玉2 號(hào)”，由玉山縣紅日農(nóng)林農(nóng)民專業(yè)合作社提供。

1.1.2 試劑 針對(duì)富含多酚多糖植物組織的RNA 提取試劑盒Quik RNA Isolation Kit GK，購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransScript?One－Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)、基因克隆PCR 酶(2×TransTaq High Fidelity PCR SuperMixⅠ)及檢測(cè)PCRTaq酶(2×EasyTaq?PCR SuperMix)，均購(gòu)自北京TRANSGENE 科技有限公司； 膠回收試劑盒(MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0)、克隆載體(pMDTM18－T Vector Cloning Kit)及大腸桿菌DH5α 感受態(tài)，選用大連TAKARA 公司的產(chǎn)品；瓊脂糖、β-巰基乙醇、NaCl、Tris、EDTA等化學(xué)試劑采購(gòu)于百化商城。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 MC nexus PCR 儀(德國(guó)，Eppendorf)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)儀器(西安，天隆)，DYY－6E 型電泳儀(北京，六一)，Tanon 3500R 全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海，天能)，微量蛋白測(cè)定儀(日本，Shimadzu)，高速離心機(jī)(德國(guó)，Sigma 2K15)，JY96－IIN 型超聲波細(xì)胞破碎儀。 由上海尼桑生物工程股份有限公司提供測(cè)序服務(wù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集與處理方法 2022 年5 月15 日上午從懷玉山紅日農(nóng)林農(nóng)民專業(yè)合作社的溫室中(E117°58′17″，N28°53′51″)采集三葉青的健康功能葉、匍匐狀分枝(枝蔓)、膨大塊根、受精子房及頂芽，然后取葉片正中間1/4 大小作為葉片樣品，取兩片葉子中間的枝截取1/4 長(zhǎng)度作為枝蔓樣品，取塊根中間部位約1/4 大小作為塊根樣品；受精子房取樣以子房膨大及花冠萎蔫為標(biāo)準(zhǔn)，取樣時(shí)去掉花托及萎蔫的花冠部分；頂芽取樣盡量去掉周圍的幼葉。 每種樣品取3 ～5 株，剪碎后混合，稱取100 mg，重復(fù)3 次。

不同發(fā)育時(shí)期塊根采樣參照聞靜等[12]的方法，樣品稱量后立即液氮速凍，于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA 的提取及cDNA 的合成 以頂芽為樣本，液氮研磨后提取總RNA，操作步驟參照RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)。 對(duì)提取后的RNA 進(jìn)行純度及定量分析，然后用70 ng/μL 的總RNA 作為樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，操作步驟參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.3ThRLP1和ThRLK1基因的克隆和測(cè)序根據(jù)前期從三葉青塊根及葉片轉(zhuǎn)錄組獲得的基因序列及注釋信息分析，設(shè)計(jì)ThRLP1及ThRLK1全基因擴(kuò)增引物、開(kāi)放讀碼框擴(kuò)增引物及熒光定量引物(表1)。 PCR 反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)成分及用量參照試劑盒說(shuō)明書(shū)；反應(yīng)程序?yàn)?8℃變性5 s，56℃退火5 s，72℃延伸1.5 min，共35 個(gè)循環(huán)。 PCR 產(chǎn)物用1.2%～1.5%瓊脂糖TAE 凝膠電泳檢測(cè)，純化后與克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，菌落PCR 檢測(cè)后測(cè)序。

表1 用于ThRLP1 和ThRLK1 基因克隆及熒光定量分析的引物

1.2.4ThRLP1和ThRLK1基因的生物信息學(xué)分析 采用在線軟件進(jìn)行相關(guān)分析，具體見(jiàn)表2。采用MEGA 7 進(jìn)行多重比對(duì)后利用neighbor－joining 算法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

表2 生物信息學(xué)分析在線軟件名稱、用途及網(wǎng)址

1.2.5ThRLP1和ThRLK1基因表達(dá)的RT－qPCR分析 相對(duì)熒光定量采用染料法，反應(yīng)不同組分用量及反應(yīng)溫度條件參照熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)兩步法操作，反應(yīng)體系為20 μL。 器官特異性表達(dá)檢測(cè)中采用ELF－α(MT731970)[12]為內(nèi)參基因，塊根發(fā)育不同時(shí)期的引物設(shè)計(jì)參考聞靜等[12]的方法，內(nèi)參基因?yàn)镽PⅡ(MW307822)。 試驗(yàn)設(shè)置生物學(xué)重復(fù)、技術(shù)重復(fù)各3 次。 數(shù)據(jù)分析采用2－△△Ct法[13]，差異顯著性分析采用SPSS 軟件的LSD 法。

1.2.6ThRLP1和ThRLK1基因的原核表達(dá)分析以ThRLP1及ThRLK1基因的開(kāi)放讀碼框序列設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 擴(kuò)增片段回收后與原核表達(dá)載體連接，具體連接及轉(zhuǎn)化方法參考pEASY?－Blunt 載體說(shuō)明書(shū)；轉(zhuǎn)入DH5α 抗生素篩選，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒測(cè)序，選擇正確的重組原核表達(dá)載體序列轉(zhuǎn)化DE3 感受態(tài)，涂布在含有50 μg/mL 氨芐西林的固體LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h；挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，菌液濃度達(dá)到OD600nm為0.45～0.60 時(shí)加入1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，搖菌4 h 后取1～5 mL 菌液，4℃、12 000 r/min離心，收集菌體沉淀后冰上超聲波破碎，4℃、12 000 r/min 離心20 min，取上清進(jìn)行SDSPAGE 檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因克隆

以懷玉山三葉青頂芽的cDNA 為模板擴(kuò)增ThRLP1和ThRLK1基因的全長(zhǎng)序列，凝膠電泳結(jié)果(圖1)顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期接近。 經(jīng)測(cè)序得到的堿基序列與前期獲得的轉(zhuǎn)錄組序列相似度大于99%，推測(cè)的氨基酸序列與由轉(zhuǎn)錄組原序列推測(cè)的氨基酸序列相似度為100%。

圖1 ThRLP1 和ThRLK1 基因PCR 電泳檢測(cè)結(jié)果

2.2 ThRLP1 和ThRLK1 基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1ThRLP1和ThRLK1基因推測(cè)蛋白質(zhì)序列的生物信息學(xué)分析ThRLP1基因開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度為657 bp，預(yù)測(cè)編碼218 個(gè)氨基酸。 經(jīng)在線比對(duì)，蛋白序列與河岸葡萄(Vitis riparia)的富含亮氨酸的重復(fù)蛋白亞型1(leucine－rich repeat protein 1－like isoform X1，XP＿034694208.1)相似度最高，為94.50%，序列覆蓋率為100%。 特異匹配保守域分析結(jié)果(圖2)表明在第26 ～67 個(gè)氨基酸位點(diǎn)有N 端的亮氨酸重復(fù)序列(leucine rich repeat N－terminal domain，LRRNT＿2，pfam08263)，在第95～154 個(gè)氨基酸位點(diǎn)有亮氨酸富含區(qū)(leucine rich repeat，LRR＿8，pfam13855)。

圖2 ThRLP1 基因推測(cè)氨基酸序列的信號(hào)肽、保守氨基酸及保守域分析

ThRLK1基因開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度為399 bp，預(yù)測(cè)編碼132 個(gè)氨基酸；蛋白質(zhì)序列與葡萄的SERK2(XP＿002276414.2)相似度最高，為96.97%，序列覆蓋率為100%；保守域分析結(jié)果(圖3)表明在第1～85 氨基酸位點(diǎn)有絲氨酸/蘇氨酸激酶的催化結(jié)構(gòu)域(catalytic domain of the serine/threonine kinase，STK＿BAK1＿like)。

圖3 ThRLK1 基因推測(cè)氨基酸序列的保守氨基酸及保守域分析

ThRLP1和ThRLK1基因預(yù)測(cè)蛋白的分子量、等電點(diǎn)、分子功能及亞細(xì)胞定位等見(jiàn)表3。

表3 ThRLP1 和ThRLK1 蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.2.2ThRLP1和ThRLK1基因的進(jìn)化分析 利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)的Blastp 比對(duì)，將ThRLP1 和ThRLK1及與其同源性較高的46 條蛋白通過(guò)neighbor－joining 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。 由圖4 可見(jiàn)，所有蛋白被分為3 類，ThRLP1 和ThRLK1 分處于不同的類群，其中，ThRLP1 與葡萄的VvSERK1 和河岸葡萄的VrLRP1處于同一進(jìn)化分枝，序列相似性最高；ThRLK1 與葡萄的VvSERK2 和河岸葡萄的VrBAK1 處于同一進(jìn)化分枝，在系統(tǒng)發(fā)育中序列相似性最高。

圖4 ThRLP1 和ThRLK1 及其同源蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 ThRLP1 和ThRLK1 基因的表達(dá)特征分析

2.3.1 兩基因在三葉青不同器官中的表達(dá)ThRLP1在三葉青塊根中的表達(dá)量顯著低于其他器官，而葉片、頂芽、受精的子房及枝蔓中該基因的表達(dá)差異不顯著(圖5A)。 在5 種器官中都檢測(cè)到了ThRLK1基因的表達(dá)，受精的子房中表達(dá)量最低，顯著低于其他器官；頂芽中的表達(dá)量略高于受精的子房，但明顯低于葉片、塊根中的表達(dá)水平；該基因在枝蔓中的表達(dá)量最高，顯著高于其他4 種器官(圖5B)。

2.3.2 兩基因在塊根發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)分析

由圖6 可見(jiàn)，ThRLP1在具有塊根的纖維根(Ⅳ)中表達(dá)量最高，且與其他發(fā)育狀態(tài)的根中的表達(dá)量差異顯著；其次為在纖維根期(Ⅰ)與塊根期(Ⅲ)，兩者間差異不顯著，但顯著高于塊根的初始膨大期(Ⅱ)。ThRLK1基因在具有塊根的纖維根(Ⅳ)中表達(dá)量最高，顯著高于纖維根期(Ⅰ)和塊根初始膨大期(Ⅱ)，但與塊根期(Ⅲ)差異不顯著；在纖維根期(Ⅰ)該基因的表達(dá)量最低，顯著低于塊根期(Ⅲ)與具有塊根的纖維根(Ⅳ)，但與塊根初始膨大期(Ⅱ)的表達(dá)量差異不顯著。

圖6 三葉青塊根發(fā)育不同時(shí)期ThRLP1(A)和ThRLK1(B)基因的相對(duì)表達(dá)量

2.4 ThRLP1 和ThRLK1 的原核表達(dá)分析

原核誘導(dǎo)表達(dá)分析結(jié)果(圖7)顯示，含有重組表達(dá)載體pEASY－ Blunt E1ThRLP1與pEASYBlunt E1ThRLK1的受體菌經(jīng)過(guò)4 h 的ITPG 誘導(dǎo)后，分別誘導(dǎo)表達(dá)出29 kD 與20 kD 左右的蛋白，與預(yù)測(cè)的目的蛋白大小相符。

圖7 ThRLK1(A)及ThRLP1(B)的原核表達(dá)SDS－PAGE 電泳結(jié)果

3 討論與結(jié)論

SERK 類蛋白已經(jīng)被證明在植物愈傷組織向體細(xì)胞胚發(fā)育過(guò)程中起到重要作用，如在唇蘭的組織培養(yǎng)中，在體細(xì)胞胚發(fā)育初期，ClSERK基因在由原球莖產(chǎn)生的胚性愈傷組織中高度表達(dá)[14]；Pérez－Nú?ez 等證實(shí)CnSERK表達(dá)與體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)有關(guān)，是調(diào)控體外培養(yǎng)的椰子組織中形成體細(xì)胞胚胎的關(guān)鍵基因[15]。 典型的SERK類蛋白包含一個(gè)富含絲氨酸或脯氨酸的胞外結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域[16，17]。 本研究結(jié)果表明ThRLP1基因所編碼的氨基酸序列富含亮氨酸殘基，具有類似LxxLxx-LxxLxLxN 的保守結(jié)構(gòu)域及細(xì)胞外LRR 蛋白的特征結(jié)構(gòu)基元Lt/sgxIP；該蛋白序列具有信號(hào)肽序列，但缺少質(zhì)膜內(nèi)的激酶區(qū)域，所以ThRLP1 是一類細(xì)胞外受體蛋白[18]。 ThRLK1 不具有信號(hào)肽序列，缺少細(xì)胞外區(qū)域及跨膜區(qū)的保守域，但具有激酶特征的絲氨酸/蘇氨酸激酶的催化結(jié)構(gòu)域，因此被稱為質(zhì)膜受體類激酶[19]。 與已知胚狀體受體類激酶分子結(jié)構(gòu)對(duì)比， ThRLP1 和ThRLK1 的蛋白序列只具有部分胚狀體受體類激酶保守域，通過(guò)進(jìn)一步對(duì)三葉青塊根及葉片轉(zhuǎn)錄組中序列的篩選比對(duì)，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)同時(shí)具有細(xì)胞外LRR 氨基酸結(jié)構(gòu)域及質(zhì)膜受體結(jié)構(gòu)域的SERK 類蛋白。 另外，ThRLP1具有SERK 的胞外結(jié)構(gòu)及跨膜結(jié)構(gòu)，而ThRLK1具有SERK 的膜內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)，項(xiàng)目組初期懷疑兩個(gè)基因可能來(lái)源于一個(gè)完整的SERK類基因片段，但是通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增，并沒(méi)有得到預(yù)想的結(jié)構(gòu)完整的SERK 類蛋白序列。 而與ThRLP1 和ThRLK1 蛋白序列相似性較高的葡萄中確實(shí)存在具有類似結(jié)構(gòu)的同類蛋白質(zhì)，因此本研究克隆的ThRLP1和ThRLK1基因可以作為進(jìn)一步研究三葉青SERK 類蛋白質(zhì)的對(duì)象。

本研究在器官特異性表達(dá)分析中發(fā)現(xiàn)ThRLP1在三葉青葉片、頂芽、受精后的子房、塊根及枝蔓中均有表達(dá)，與Sultana 等[20]發(fā)現(xiàn)擬南芥的細(xì)胞外LRR 類受體蛋白在器官中的表達(dá)較為普遍的結(jié)果類似；但塊根中的表達(dá)量顯著低于其他器官，推測(cè)該基因與塊根發(fā)育呈負(fù)相關(guān)性或相關(guān)性較小。 目前受體類蛋白參與根或地下儲(chǔ)藏器官發(fā)育的研究并不多見(jiàn)，Chen 等[21]研究發(fā)現(xiàn)富含亮氨酸受體蛋白(leucine－rich repeat RKs，LRRRKs)可以直接與根部頂端生長(zhǎng)因子RGF(root meristem growth factor)作用，控制根頂端分生組織的發(fā)育。 而甜薯貯藏根組織mRNA 印跡分析表明，其受體類激酶SRF6 的mRNA 定位于木質(zhì)部的初生形成層和分生組織周圍，控制貯藏根增厚[22]。 但細(xì)胞外受體類蛋白直接參與植物地下儲(chǔ)藏器官形成的報(bào)道還未見(jiàn)，目前植物胞外受體蛋白的研究主要集中在植物與病原互作的免疫反應(yīng)過(guò)程[23，24]。

ThRLK1在三葉青各器官中也均有表達(dá)，且在頂芽及受精的子房中表達(dá)量較低，推測(cè)該基因與芽的發(fā)生過(guò)程相關(guān)性較小。 三葉青匍匐狀分枝是其主要的運(yùn)輸器官，主要分布著疏導(dǎo)組織，Zhang等研究表明擬南芥的SERK家族受體類激酶與CLE41/TDIF－PXY 作為共同的受體調(diào)節(jié)植物維管束的發(fā)育[25]，而ThRLK1在三葉青枝蔓中的表達(dá)量最高，初步推測(cè)其可能與維管組織發(fā)育相關(guān)。Blümke 等研究表明擬南芥質(zhì)膜受體激酶MAZZA與CLV1f 共同控制的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)控制根的發(fā)育[26]，但目前質(zhì)膜類激酶參與到三葉青塊根發(fā)育的研究還未見(jiàn)報(bào)道。 本研究發(fā)現(xiàn)，雖然ThRLK1基因在三葉青塊根中的表達(dá)量低于枝蔓，但是在塊根和具有塊根植株的纖維根中表達(dá)量較高，推測(cè)其可能在塊根發(fā)育過(guò)程中起一定作用，具體作用機(jī)制還需深入研究。

植物器官再分化及體細(xì)胞胚發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)問(wèn)題，受到植物基因型及培養(yǎng)環(huán)境中激素、養(yǎng)分等諸多因素的調(diào)節(jié)。 本研究克隆的兩個(gè)三葉青受體類蛋白雖然與SERKs 蛋白序列相似度較高，但在芽與受精的子房中并無(wú)顯著的高豐度表達(dá)，在塊根中表達(dá)量也低于枝蔓。 因此，有關(guān)懷玉山三葉青SERK 類蛋白的鑒定及功能還有待進(jìn)一步研究。