敖健恒，繆 磊，王慧穎，章天云，王 濤，唐永行，胡利平，聶勝潔

（昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，云南 昆明 650500）

接觸性生物檢材是指人體皮膚（或粘膜）與物體接觸之后所形成的生物檢材類型[1]，這類檢材在法醫(yī)物證檢案中較為多見，其在個體識別、親緣鑒定、偵破案件、提供證據(jù)等方面具有顯著的應(yīng)用價值。接觸性生物檢材的DNA 來源有多種，如皮膚（或粘膜）的脫落細胞及二次轉(zhuǎn)移等，其中脫落細胞是該類生物檢材中DNA 的主要來源[2]，但除了胞內(nèi)DNA，還存在一定比例的胞外游離DNA[2]。接觸性DNA 是目前法醫(yī)學(xué)實踐研究的熱點，但由于各類檢材的接觸性DNA 檢出率較低且差異較大，缺乏對結(jié)果的科學(xué)、合理的證據(jù)解釋，這將影響案件的偵破，且難以在法庭活動中對相關(guān)專業(yè)性的問題給出科學(xué)合理的解釋，因此檢出率的影響因素一直是國內(nèi)外研究的難點問題。個體差異、檢材形成方式、載體類型、檢驗方法等是影響接觸性DNA 檢出率的主要因素[3]，目前多集中在方法學(xué)方面的研究，即針對檢材的轉(zhuǎn)移、DNA 的提取純化、檢測平臺的選擇等，而從個體差異的角度來解釋檢出率差異的報道較為少見。

相關(guān)研究認為，在細胞外有部分降解的DNA來自于凋亡的上皮細胞[4]、皮脂腺[5]或汗腺[6]，它們被認為對皮膚接觸樣本的DNA 含量有顯著貢獻。van den Berge 的研究中[7]闡述，當(dāng)比較每個供體收集的2 種皮膚類型時，皮脂腺皮膚樣本總是有著比非皮脂腺皮膚樣本更高的DNA 含量（高2.6～186 倍）；在比較16 名志愿者跑步前與跑步后、未出汗與出汗的左右手共64 個樣本時，跑步后出汗手樣本DNA 含量更高，最高為未出汗時的153.6 倍[7]。而汗孔是汗腺在皮膚表面的開口，是汗液排泄的通道，Quinones 等[6]研究表明，1 mL 無細胞汗液樣本中可以獲得平均11.5 ng 的游離DNA，說明汗液中游離DNA 是手掌接觸性DNA 的構(gòu)成要素之一。

汗孔作為皮膚的結(jié)構(gòu)之一，是開展手掌接觸性DNA 相關(guān)研究的理想變量因素。因此本研究提出了手部接觸性生物檢材的DNA 檢出率與汗孔密度或有一定的相關(guān)性的假設(shè)，選擇男性手掌汗孔密度作為研究變量，探索其與接觸性生物檢材的DNA 檢出率的相關(guān)性，以期為接觸性生物檢材的差異性DNA 檢出率的結(jié)果解釋提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究的受試對象為73 名男性大學(xué)生，年齡為18～21 歲，受試者手掌皮膚無疤痕，無手癬、皮炎、濕疹等皮膚疾病。本次研究于2021 年5 月進行，樣本的收集獲得受試對象的知情同意并已獲得昆明醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 受試者汗孔密度顯現(xiàn)及觀測

在受試者右手小魚際處均勻涂抹手霜后粘貼定位標(biāo)志，于手機屏幕（含鋼化玻璃貼膜）上平行捺印3 個掌印，使用勻光電筒側(cè)光照射手機屏幕，并用15 倍微距鏡頭在固定高度的臺架上拍攝掌印照片。若掌紋汗孔采集不合格，則運用同樣的方法采集受試者右手拇指的指印。運用Adobe Photoshop Lightroom Classic CC 7.3 軟件對拍攝的圖像進行曝光度、對比度、清晰度、糾正鏡頭畸變等調(diào)節(jié)，以去除不必要的顏色、噪點或畸變干擾，并用Adobe Illustator CC 22.1 軟件制作汗孔計數(shù)模板（圖1）。利用微距鏡頭對比例尺的拍攝，將圖像所對應(yīng)的實際尺度同步到了模板之中，以便于后期劃定范圍與汗孔計數(shù)。利用定位標(biāo)志和掌紋特征點尋找掌紋相同區(qū)域并劃定計數(shù)范圍，并利用軟件對平行捺印的3 個掌印中的每枚掌印4 mm×4 mm 范圍內(nèi)的汗孔進行計數(shù)（圖1）。按照掌（指）印上汗孔的清晰程度分為合格（圖2A）與不合格（圖2B），每枚合格掌（指）印的汗孔由兩名實驗人員分別計數(shù)，若計數(shù)結(jié)果相對偏差大于15%，則由第3 名實驗人員進行計數(shù)，將其中相對偏差較小的2 次計數(shù)結(jié)果納入統(tǒng)計。

圖1 掌紋汗孔計數(shù)方案示意Fig.1 Palmprint sweat pore counting scheme

圖2 汗孔采集顯現(xiàn)的相關(guān)情況Fig.2 Relevant situation on sweat pore collection and display

1.3 DNA 樣本采集

在掌印汗孔捺印合格的受試者中選取35 名開展后續(xù)實驗，實驗環(huán)境溫度控制在16～22 ℃，相對濕度保持在45%。受試者清水洗手1 min，自然晾干，實驗過程中情緒穩(wěn)定且無劇烈運動。采集受試者口腔拭子作為比對樣本，干燥后用紙質(zhì)物證袋保存。

本次實驗采用2 種不同的方法轉(zhuǎn)移受試者的手掌接觸性DNA：（1）直接轉(zhuǎn)移法：在受試者左手小魚際處用油性筆標(biāo)記3 個1 cm×1 cm 大小的區(qū)域，戴薄膜手套20 min，摘除手套后用3 片1 mm×1 mm 的濕潤濾紙片分別擦拭上述3 個區(qū)域內(nèi)的皮膚表面，并分別裝入不同的200 μL 的EP 管中；（2）載玻片轉(zhuǎn)印間接轉(zhuǎn)移法：受試者左手佩戴薄膜手套20 min（并沒有和直接轉(zhuǎn)移法同時進行），摘除手套后在小魚際處放置一塊潔凈的載玻片，將1.35 kg 的物體（以控制壓力變量[8]）垂直作用玻片表面，用1 mm×1 mm 的濕潤濾紙片在2.5 cm×2.5 cm 范圍內(nèi)轉(zhuǎn)印有掌紋的載玻片上擦拭，并裝入200 μL EP 管中。

1.4 PCR、電泳及STR 分析

運用21Plex 熒光檢測試劑盒（沿溯）對轉(zhuǎn)移后的手掌擦拭樣本和比對樣本進行直接擴增，每管中分別加入Mater Mix 4 μL，Primer Mix 2 μL，H2O 4 μL。手掌擦拭物的擴增參數(shù)：96 ℃ 1 min；94 ℃10 s，59 ℃ 1 min，31 個循環(huán)；60 ℃延伸20 min；4 ℃保存。比對樣本的擴增參數(shù)：96 ℃ 1 min；94 ℃ 10 s，59 ℃ 1 min，27 個循環(huán)；60 ℃延伸20 min；4 ℃保存。擴增產(chǎn)物在ABI 3130 型遺傳分析儀上電泳，用GeneMapper ID-X 1.5 軟件進行STR 分型，等位基因峰高閾值為30 RFU。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

運用Microsoft Excel 2019 對等位基因檢出率和汗孔密度進行統(tǒng)計和計算，運用IBM SPSS Statistics 26.0 軟件對掌印汗孔密度及2 種轉(zhuǎn)移方法的等位基因檢出率分別進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 汗孔采集結(jié)果

51 名受試對象掌印汗孔采集合格，11 名受試對象指印汗孔采集合格，汗孔采集總體合格率為84.93%。手掌汗孔密度為（531.41±97.69 ）個/cm2，最小值為309 個/cm2（圖2C），最大值為814 個/cm2（圖2D），掌印汗孔密度分布見圖3；指紋汗孔密度為（627.04±182.13 ）個/cm2，最小值為200個/cm2，最大值為869 個/cm2。

圖3 掌印汗孔密度頻數(shù)分布圖及其正態(tài)分布曲線Fig.3 The frequency distribution diagram and normal distribution curve of palmprint sweat pore density

2.2 DNA 檢驗結(jié)果

對上述樣本使用21Plex 熒光檢測試劑盒（沿溯）進行PCR 復(fù)合擴增，陰性對照未檢出特異性擴增產(chǎn)物，陽性對照基因分型正確，圖為受試者的口腔拭子（圖4A）和實驗樣本的DNA 分型圖（圖4B）。

圖4 毛細管電泳DNA 分型結(jié)果圖譜Fig.4 Capillary electrophoresis DNA typing result chart

參照比對樣本進行手掌檢材的等位基因計數(shù)，采用直接擦拭法和載玻片轉(zhuǎn)印間接擦拭法進行手掌DNA 檢驗的結(jié)果見表1。其中采用直接擦拭法和載玻片轉(zhuǎn)印間接擦拭法所得到的平均等位基因檢出個數(shù)分別為25.36 個和23.86 個，等位基因平均檢出率分別為63.40%和59.64% 。

表1 2 種手掌接觸性生物檢材轉(zhuǎn)移方法的DNA 檢出結(jié)果Tab.1 DNA detection results of two transfer methods for palm touch biological samples

2.3 統(tǒng)計學(xué)結(jié)果

35 名受試對象按手掌汗孔密度平均值分為汗孔密度較小（σ≤523 個/cm2）和汗孔密度較大（σ ＞ 523 個/cm2）2 組，并統(tǒng)計各組的STR 等位基因檢出數(shù)。經(jīng)分析，2 種擦拭方法得到的不同汗孔密度的STR 等位基因檢出數(shù)結(jié)果見表2，2 組的DNA 檢出結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P值分別為0.825 和0.941（表2）；對35 名受試對象的手掌汗孔密度和直接擦拭法STR 等位基因檢出率進行統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)兩者之間不存在相關(guān)性關(guān)系（P1=0.806，圖5A）；對35 名受試對象的手掌汗孔密度和間接擦拭法STR 等位基因檢出率進行統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)兩者之間不存在相關(guān)關(guān)系（P2=0.701，圖5B）。

表2 2 種手掌接觸性生物檢材轉(zhuǎn)移方法的DNA 檢驗結(jié)果與掌印汗孔密度統(tǒng)計比較Tab.2 Comparison of DNA test and palmprint sweat pore density between two trasferring methods of palm touch biological samples

圖5 掌印汗孔密度與等位基因檢出率的散點圖Fig.5 Scatter plot of sweat pore density and allele detection rate in palmprint

3 討論

3.1 掌紋顯現(xiàn)與汗孔計數(shù)模型建立

在基層實踐中，一般使用油墨捺印法、活體指紋采集儀法和掃描儀法等采集指紋，左琦[9]的研究表明以上幾種方法對指（掌）紋中汗孔的顯現(xiàn)情況不佳，或需要價格較昂貴、技術(shù)含量較高的設(shè)備[10]（如譜域光學(xué)相干斷層掃描成像系統(tǒng)等）對指（掌）紋的汗孔進行清晰顯現(xiàn)與采集。本次實驗中筆者通過合理地設(shè)計并利用了一個耗材損耗少、實施容易、數(shù)據(jù)電子化方便的方式建立了實驗?zāi)Ｐ停捎昧撕唵蔚难b置實現(xiàn)了掌紋汗孔顯現(xiàn)，并利用圖像處理軟件對汗孔進行清晰顯現(xiàn)與人工計數(shù)。本方案具有方法簡單、技術(shù)壁壘低、低成本、效果好的特點，十分有利于汗孔相關(guān)研究的開展，也可用于解決基層刑偵工作中難以捺印提取的指掌紋汗孔形態(tài)或其他3 級特征信息等相關(guān)問題。此模型的建立，為法醫(yī)學(xué)實踐中指掌紋的顯現(xiàn)、汗孔計數(shù)、汗孔形態(tài)學(xué)觀察以及相關(guān)的遺傳學(xué)研究提供了技術(shù)支撐。

3.2 實驗質(zhì)量控制

在本次實驗中，筆者盡可能地控制了除汗孔密度之外的變量因素。如受試對象的性別[11-12]及年齡[13-14]、參與實驗時的情緒以及運動狀況、實驗環(huán)境溫度與濕度[15-16]等。有研究者指出：事前的活動[17]（如洗手[18]、撫摸或玩弄頭發(fā)[11]、導(dǎo)致出汗的身體活動[7]）可能會增加轉(zhuǎn)移DNA 的量；皮膚狀況（例如雙手極度干燥，或皮膚病等）會影響轉(zhuǎn)移DNA 的量[19]，所以筆者征集了健康的男性大學(xué)生作為受試者，并在實驗前要求受試者清水洗手1 min 后自然晾干，以盡可能減少手掌上原有分泌的DNA、易脫落細胞、他人背景DNA[17]的影響。實驗過程中未與除薄膜手套內(nèi)壁和實驗載體之外的物體接觸，可以排除DNA 二次轉(zhuǎn)移對實驗結(jié)果的影響。在直接轉(zhuǎn)移法采集手掌生物檢材的操作中筆者設(shè)計了重復(fù)試驗，以減少其他的變量影響；在利用二次轉(zhuǎn)移法時控制了壓力變量[8]和采樣面積，以控制實驗變量。

本次實驗通過2 種不同的實驗方法對手掌接觸性生物檢材進行DNA 檢驗，均表明手掌汗孔密度與接觸性DNA 的檢出率無相關(guān)性，說明汗孔密度不是接觸性DNA 檢出率的主要影響因素，或不是其唯一影響因素。

在多項研究中指出，接觸性生物檢材的DNA主要來自于脫落細胞[2,20]，本次實驗采用擦拭法轉(zhuǎn)移手掌接觸性生物檢材，并對所轉(zhuǎn)移的檢材進行直接擴增，而未將脫落細胞DNA 檢驗和游離DNA 的檢驗分開進行研究，因此會受到個體脫落細胞含量差異的影響，未能在嚴(yán)格控制變量的情況下直接反映汗孔密度和接觸性生物檢材DNA 檢出率的單一相關(guān)性，這可能是導(dǎo)致無相關(guān)性實驗結(jié)果的主要原因之一。同時，除了汗孔密度外，每個人的汗腺分泌功能的差異會有區(qū)別，不能簡單的將汗孔密度作為因變量。但值得注意的是，非角化的有核細胞仍有可能從汗管中脫落[6,21]，如不只單獨地考慮汗液中的游離DNA，汗孔密度也有一定程度的可能影響接觸性生物檢材中脫落細胞的含量，從而影響DNA 檢出率。雖然我們盡可能地控制了一些變量，但受試者可能受到其他難以被評估的變量干擾而導(dǎo)致實驗結(jié)果受到影響。

基于上述分析，本項目在未來仍具有較大的研究價值，實驗設(shè)計需要從以下幾個方面進行優(yōu)化：（1）更嚴(yán)謹?shù)目刂谱兞?。盡管關(guān)于轉(zhuǎn)移DNA的研究總是受到大量（相互作用）的變量影響[17]，但仍可以通過控制主要的影響因素從而繼續(xù)深入研究，如對提取到的檢材采取離心的方式去除可能存在的脫落細胞；（2）選取更合適的實驗對象。Oleiwi 的研究指出[22]從手掌表面脫落的DNA 數(shù)量明顯少于兩個手指脫落的DNA 數(shù)量，或可以轉(zhuǎn)而研究手指的汗孔密度與接觸性DNA 檢出率的關(guān)系；（3）擴大研究樣本。本次實驗的樣本例數(shù)較少，個體差異將會對實驗結(jié)果有較大的影響，可以通過擴大樣本來進一步尋找在廣泛人群中存在的規(guī)律；（4）利用更科學(xué)，更先進的方法對汗孔進行可視化與計數(shù)。借助更先進的指紋顯現(xiàn)技術(shù)，可以提高汗孔顯現(xiàn)的成功率，也使得我們可以從更細致的方面研究汗孔和接觸性DNA 之間的關(guān)系。如有條件，對汗孔的計數(shù)的工作可以采用計算機視覺深度學(xué)習(xí)的方法訓(xùn)練相關(guān)模型以實現(xiàn)自動識別[23]，以便于在對更大量樣本的研究中減少工作量與負擔(dān)，同時促進方案的實際應(yīng)用。

隨著實驗方法的不斷優(yōu)化，檢測平臺的持續(xù)升級（如采用二代測序技術(shù)），接觸性生物檢材的DNA 檢出率與靈敏度會逐漸增加。如何對DNA遺留機制給出科學(xué)合理的證據(jù)解釋，是案件偵破和法庭訴訟的重點。汗孔是汗腺在皮膚表面的開口，是汗液排泄的通道，因此探索汗孔密度與汗液分泌量的關(guān)系、汗密度和游離DNA 的含量是否存在相關(guān)性，可以成為下一步研究的關(guān)注點。同時，對從汗孔中分泌的化學(xué)物質(zhì)或遺傳物質(zhì)的分析已成為新的關(guān)注點[24-25]，將指紋的三級特征（如汗孔等）與接觸性DNA 檢測進行結(jié)合或可以提高個體識別的成功率，同時也為后續(xù)研究者研究指紋特征與接觸性生物檢材的關(guān)系提供了新的方向和思路。